基于網絡藥理學和分子對接的五苓散治療肝硬化腹水作用機制探討△

韋柳婷，胡振斌，高松林，韋湘紅，黃玲珊，吳凡

1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530000；

2.廣西中醫(yī)藥大學 第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000

肝硬化腹水是肝硬化患者病程由代償期過渡至失代償期的標志，是門靜脈高壓、腎素-血管緊張素-醛固酮系統失衡和低蛋白血癥等多種因素綜合作用的結果[1]。腹水是肝硬化自然病程中的典型癥狀，每年會存在于5%～10%的代償期患者中[2]。代償期患者疾病進展過程中如果出現腹水，其5 年生存率將由原來的80%左右降為失代償期的30%左右，總體中位生存期僅約2 年[3]。西醫(yī)的治療方式主要有病因治療、限鈉、利尿、放腹水和補充白蛋白等[4]，但是可能會引起低鈉血癥、肝腎綜合征和肝性腦病等嚴重不良反應[5-6]。

肝硬化腹水屬于中醫(yī)“鼓脹”范疇，其主要病機為三焦氣化不利、水液代謝失常[7]。五苓散源自《傷寒論》，由白術、澤瀉、豬苓、茯苓和桂枝組成。方中豬苓、澤瀉相配利水滲濕，使水濕之邪從小便而去；白術、茯苓健運中焦，培土以制水；桂枝溫陽化氣，助膀胱氣化功能，加強利水作用；全方共奏溫陽化氣利水之功，恰中其病機。此方有利尿、護腎、止瀉、控制血壓和調節(jié)代謝等效果[8]，同時具有改善肝功能的作用[9]。多篇文獻報道其對肝硬化腹水患者具有改善腹水癥狀、人血清白蛋白（ALB）水平和肝功能的療效，安全性較高，但相關的分子機制研究尚匱乏[10-13]。本研究基于網絡藥理學和分子對接方法，探討五苓散治療肝硬化腹水的作用機制，為其后續(xù)深入研究和臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 五苓散成分、靶點收集與整理

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）中以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18 為條件檢索五苓散中所有中藥的活性成分并收集所對應的靶點蛋白。通過UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）將靶點蛋白轉換為標準基因名。

1.2 肝硬化腹水靶點收集

以“Cirrhosis ascites”為關鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMⅠM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）數據庫中檢索疾病靶點。

1.3 交集靶點的篩選

應用R語言獲取五苓散和疾病的交集靶點。

1.4 中藥-活性成分-靶點網絡的構建

以交集靶點為橋梁，反向篩選得到對應活性成分和中藥，制作網絡關系表及屬性文件，導入Cytoscape 3.8.0 軟件中構建中藥-活性成分-靶點網絡，運用Network analyzer功能進行拓撲分析。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（PPⅠ）網絡構建及核心靶點篩選

在STRⅠNG 數據庫（https://string-db.org/）中導入交集靶點，限定物種為“Homo sapiens”，其他默認數值不做調整，構建PPⅠ網絡。運用Cytoscape 3.8.0軟件中CytoNCA插件對結果進行可視化分析。

1.6 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

使用R 語言程序和Bioconductor 數據庫（https://www.bioconductor.org/）中的“org.Hs.eg.db”人類數據庫，“clusterProfiler”“DOSE”“enrichplot”和“stringi”等軟件包對疾病和藥物的交集靶點以P=0.05、Q=0.05進行GO和KEGG功能富集分析。

1.7 分子對接

運用AutoDock Vina 1.1.2 將核心靶點與β-谷甾醇、(+)-兒茶素、花旗松素、表兒茶素和常春藤皂苷元（由于PubChem 數據庫未檢索到3β-乙酰氧基蒼術酮，故不進行分子對接）進行分子對接。首先利用PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性成分的2D 結構文件，導入Chem3D軟件轉換為最小自由能的3D 空間構象的.mol2 格式。在UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）中將Status 設置為Reviewed，Popular organisms 設置為Human，結合是否存在小分子配體、構象分辨率和中國知網數據庫文獻綜合分析，尋找核心靶點對應蛋白的PDB ⅠD，通過PDB 數據庫（http://www.rcsb.org/）下載3D 晶體結構。最后通過PyMOL 軟件和AutoDockTools 1.5.6 軟件對活性成分的3D 空間構象和核心靶點對應蛋白的3D晶體結構進行預處理，利用AutoDock Vina 1.1.2 進行分子對接，并用PyMOL軟件展示結果。

2 結果

2.1 五苓散活性化學成分和靶點篩選

通過TCMSP 得到五苓散50 個活性化學成分，其中茯苓、豬苓和澤瀉分別為15、11、10 個，白術和桂枝同為7 個，去重后共有46 個活性成分。桂枝和澤瀉中均含有谷甾醇；啤酒甾醇和麥角甾-7,22E-二烯-3β-醇是茯苓和豬苓的共同成分；過氧麥角甾醇是桂枝和豬苓的共同成分。46 個活性成分所對應的61 個蛋白靶點，經UniProt 數據庫校正后共得到47個靶點，涉及27個活性化學成分（表1）。

表1 五苓散潛在活性成分信息

續(xù)表1

2.2 肝硬化腹水相關靶點及交集靶點的篩選

收集GeneCards 數據庫（將score 設置為1）、OMⅠM、TTD 和DrugBank 數據庫中的肝硬化腹水相關靶點，整合去重后共得到1623 個靶點基因。通過R 4.0.4 的VennDiagram 數據包得到17 個藥物-疾病交集靶點（圖1），反向推導得到23個活性成分。

圖1 五苓散治療肝硬化腹水的藥物-疾病共同作用靶點韋恩圖

2.3 藥物-活性成分-疾病靶點網絡構建和關鍵活性成分分析

使用Cytoscape 3.8.0 軟件對17 個交集靶點進行藥物-活性成分-疾病靶點網絡的構建（圖2）。利用Cytoscape 3.8.0 軟件的“Network analyzer”功能，根據度值篩選排名前6 名的活性成分，分別是β-谷甾醇、(+)-兒茶素、花旗松素、表兒茶素、常春藤皂苷元、3β-乙酰氧基蒼術酮（表2）。

表2 五苓散治療肝硬化腹水度值前6位的活性成分

圖2 五苓散治療肝硬化腹水的藥物-活性成分-核心靶點網絡

2.4 PPⅠ網絡的構建及核心靶點的篩選

運用STRⅠNG 數據庫對17 個交集靶點構建PPⅠ網絡（圖3），得到17個節(jié)點、55條邊，平均節(jié)點度值為6.47。通過Cytoscape 3.8.0 軟件分析中心性、介度中心性、特征向量中心性、緊密中心性、網絡中心性和基于局部平均連通性的方法拓撲參數，以6 個數值均大于其中位數的節(jié)點為條件進行篩選，得到胱天蛋白酶3（CASP3）、CASP8、熱休克蛋白90α（HSP90AA1）、環(huán)氧合酶2（PTGS2）和過氧化氫酶（CAT）、雌激素受體1（ESR1）等核心靶點（圖4）。

圖3 五苓散治療肝硬化腹水靶點PPI網絡

圖4 五苓散治療肝硬化腹水PPI網絡核心靶點拓撲分析

2.5 GO功能富集分析

GO 分析得到800 個生物過程（BP）條目，30個細胞組成（CC）條目，73 個分子功能（MF）條目，GO 分析分別取前10 條進行展示（圖5）。在BP中主要涉及對類固醇激素的反應和生殖結構、生殖系統、女性性腺發(fā)育等方面；在CC中靶點富集在細胞器外膜、細胞外膜、膜筏、質膜微區(qū)、膜區(qū)、線粒體外膜、核孔復合體和髓鞘等；在MF 中核受體活性和配體激活的轉錄因子活性富集程度最高。

圖5 五苓散治療肝硬化腹水的GO功能富集分析

2.6 KEGG富集分析

KEGG分析得到67條通路（P＜0.05，圖6），主要涉及晚期糖基化終產物（AGE）-晚期糖基化終產物受體（RAGE）、p53、白細胞介素-17（ⅠL-17）、腫瘤壞死因子（TNF）和雌激素信號通路等。上述通路與五苓散干預肝硬化腹水的發(fā)生發(fā)展有關。

圖6 五苓散治療肝硬化腹水的KEGG通路分析（排名前30）

2.7 分子對接驗證

選取PPⅠ網絡中核心靶點蛋白（HSP90AA1、CASP3、CASP8、PTGS2、ESR1、CAT）與β-谷甾醇、(+)-兒茶素、花旗松素、表兒茶素和常春藤皂苷元進行分子對接。結果顯示，化合物與靶點最低結合能為-10.5～-6.8 kcal·mol-1（1 cal≈4.184 J），均具有良好的結合力（表3）。其中花旗松素與CAT、表兒茶素與CAT、(+)-兒茶素與CAT、表兒茶素與PTGS2、β-谷甾醇與PTGS2、β-谷甾醇與HSP90AA1結合能分別為-10.5、-10.0、-9.2、-9.2、-9.2、-9.1 kcal·mol-1，結合能力最好，用PyMOL 可視化后見圖7。

圖7 五苓散治療肝硬化腹水部分活性成分與核心靶點分子對接

表3 五苓散治療肝硬化腹水活性成分與核心靶點分子對接結果

3 討論

拓撲分析得出五苓散可能是通過β-谷甾醇、(+)-兒茶素、花旗松素、表兒茶素、常春藤皂苷元和3β-乙酰氧基蒼術酮等活性成分治療肝硬化腹水。β-谷甾醇在富含脂質的素食中含量豐富，具有抗菌抗炎、抗氧化、降血糖、調血脂和類激素功能等多種藥理作用[14]。β-谷甾醇能降低肝星狀細胞（HSC）中與細胞外基質（ECM）合成相關的蛋白表達水平，減少膠原蛋白的積累量，發(fā)揮減輕活化人肝星狀細胞及二甲基亞硝胺誘導的小鼠肝損傷的作用[15]。兒茶素及其立體異構體可以通過調控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子E2相關因子2（Nrf-2）、Toll 樣受體4（TLR4）/核轉錄因子-κB（NF-κB）、兒茶酚-O-甲基轉移酶（COMT）和NF-κB 等多條信號通路發(fā)揮抗菌、抗炎、抗癌、護肝、控制血糖和增強記憶力等作用[16]。(+)-兒茶素能夠促進抗氧化酶中超氧化物歧化酶的表達，減少血清中血脂和丙二醛含量，從而修復小鼠的肝損傷和改善脂質代謝[17]。表兒茶素可以通過抑制炎癥反應、調節(jié)抗氧化防御系統和減輕甲氨蝶呤肝毒性誘導的損傷起到護肝效果[18]?；ㄆ焖伤啬芡ㄟ^激活磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B（PⅠ3K/Akt）信號通路、抑制NF-κB 信號通路和提高抗氧化酶含量 [還原型谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）] 發(fā)揮抗凋亡、抗炎、抗氧化作用來逆轉小鼠肝損傷[19]。常春藤素皂苷元可以抑制促炎因子表達和阻斷p38 MAPK 活化達到抗炎、抗凋亡的效果，治療乙醇誘導的肝損傷[20]。蒼術酮可以抑制肝癌HepG2 細胞的遷移，并且能夠通過線粒體途徑促進其凋亡，其作用效果與劑量呈正相關[21]。

PPⅠ網絡預測的關鍵靶點包含CASP3、HSP90 AA1、CASP8、PTGS2、ESR1 和CAT。CASP3 和CASP8 均屬 于凋亡Caspases 家族蛋白，CASP3 在細胞凋亡方面發(fā)揮著關鍵作用[22]。CASP3 活化與肝星狀細胞（HSC）活化、膠原蛋白沉積和小鼠肝細胞損傷有關，能促進肝纖維化進程和肝細胞死亡[23]。CASP8 能夠減輕肝臟脂質堆積和炎癥，在非酒精性脂肪肝炎（NASH）疾病進展中起負調控作用[24]。PTGS2 的表達產物環(huán)氧合酶2（COX-2）可以通過激活NF-κB 通路引起炎癥反應和增加線粒體活性氧的產生導致氧化應激損傷肝臟[25]，其過度表達常與腫瘤密切相關[26]。塞來昔布（COX-2 抑制劑）可作用于脾肝軸，通過減少脾源性促炎性細胞因子表達和淋巴組織增殖，抑制氧化應激刺激，對肝硬化有明確的治療效果[27]。HSP90AA1 是HSP90 基因家族中的1 種癌蛋白，能夠提高c-核蛋白類基因（c-MYC）的表達，促進肝細胞癌的產生和發(fā)展[28]，也是肝細胞癌的潛在診斷生物標志物，其表達的程度高低與肝細胞癌、胃癌等多種癌預后有緊密的聯系[29]。對酒精性肝病患者使用HSP90AA1 抑制劑能夠降低NLRP3 炎性體活性和下游促炎趨化因子（ⅠL-1β和ⅠL-18）的表達[30]。ESR1 是多種細胞色素P450酶（CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19）的調節(jié)劑，對肝臟的代謝過程有重要的影響作用[31]，其介導的環(huán)狀RNA-4018（circ_0004018）能夠抑制肝腫瘤細胞中血管的生成[32]。CAT 是一種抗氧化酶，能夠減輕氧化應激損傷，抑制肝硬化的發(fā)展[33]。

對篩選出來的17 個交集靶點進行KEGG 通路富集分析，發(fā)現五苓散主要通過AGE-RAGE、p53、ⅠL-17、TNF 和雌激素信號通路等治療肝硬化腹水。AGE與RAGE結合后能作用于MAPK、JAK2/STAT1等多條通路激活NF-κB 引起TGF-β、TNF-α和ⅠL-1等細胞因子的產生，促進肝星狀細胞活化、促纖維化因子形成和膠原蛋白合成及沉積，進而導致肝纖維化，逐步發(fā)展為肝硬化[34]。鐵死亡與肝纖維化相關，而p53 通路在細胞鐵死亡中具有關鍵作用[35]。p53 可以通過誘導鐵死亡抑制肝星狀細胞活化，減輕四氯化碳誘導的小鼠的肝纖維化程度[36]。ⅠL-17 是Th17 的主要效應分子，Th17/ⅠL-17 信號通路能夠引起持續(xù)炎癥反應和纖維化，推動著乙型病毒性肝炎（HBV）和丙型病毒性肝炎（HCV）向肝硬化的方向發(fā)展[37]。Th17/ⅠL-17 軸既可以誘導HSC 活化、促纖維化因子表達和促進上皮-間質轉化（EMT），促進膠原蛋白的合成和沉積，導致肝纖維化，又可以促進炎癥細胞的募集并增加促炎因子表達[38-42]。TNF-α是一種涉及細胞增殖、分化和凋亡，以及炎癥反應、免疫反應等多方面的多功能促炎性細胞因子[43]。由TNF-α形成的TNF-α誘導蛋白8 樣分子1（TⅠPE1）可以與凋亡信號調節(jié)激酶1（ASK1）直接結合，抑制TNF 受體相關因子6（TRAF6）的泛素化活性，產生預防肝脂肪變性、炎癥反應和肝纖維化的作用[44]。雌激素信號通路在調節(jié)脂肪生成方面很重要，可以維持肝脂質穩(wěn)態(tài)[45]。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學和分子對接方法從理論上初步論證了五苓散可以通過多成分、多靶點、多通路治療肝硬化腹水，主要起到抗炎、抗纖維化、抗氧化等多種作用。