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    蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母生理特性的影響

    2022-02-18 08:12:58彭幫柱
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2022年1期
    關(guān)鍵詞:蘋果酒綠原乙酯

    楊 超,肖 媚,張 菡,2,彭幫柱*

    (1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 武漢 430070 2 西安彩虹星球農(nóng)業(yè)科技有限公司 西安 710061)

    蘋果中富含維生素、礦物質(zhì)、多酚等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),其發(fā)酵制品蘋果酒中含有大量的氨基酸和有機(jī)酸等物質(zhì),具有較高的保健價(jià)值,產(chǎn)量?jī)H次于葡萄酒[1]。多酚類化合物具有極強(qiáng)的抗氧化作用,酚類物質(zhì)的種類及含量被用于評(píng)價(jià)果酒的品質(zhì)[2-4]。蘋果中多酚類物質(zhì)有兒茶素類、原花青素類、酚酸類、黃酮醇類、花色苷類、二氫查耳酮類等[5-7]。綠原酸作為蘋果多酚中的代表性物質(zhì),是一種羥基肉桂酸類多酚,因芳香環(huán)上的鄰羥基而具有很高的抗氧化活性[8]。綠原酸在蘋果和蘋果酒中含量相對(duì)較高[9],其在蘋果中含量為0.02~4.39 mg/g DW[10-11],其在蘋果酒中含量為24.84~90 mg/L[12]。在蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中,綠原酸會(huì)不斷的被釀酒酵母代謝,最終存在于蘋果酒中。

    在蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中,綠原酸的含量會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而有所降低[13]。Nguela 等[14]研究了酵母和多酚之間的相互作用,發(fā)現(xiàn)多酚類化合物引起酵母的生長(zhǎng)和代謝紊亂可能主要與它們和酵母細(xì)胞的質(zhì)膜相互作用有關(guān),從靜止、中期到發(fā)酵結(jié)束,酵母菌會(huì)表現(xiàn)出適應(yīng)性反應(yīng),從而降低死亡率。通過(guò)探究原花色素對(duì)釀酒酵母的影響,發(fā)現(xiàn)原花色素可以提高發(fā)酵末期釀酒酵母的數(shù)量和存活率,同時(shí)會(huì)提高胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性,降低胞內(nèi)丙二醛(MDA)的含量,其作用效果與濃度相關(guān)[15]。Jia 等[16]研究原花色素在銅脅迫下對(duì)葡萄酒酵母的生長(zhǎng)和酒精發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)原花色素和Cu2+均可在發(fā)酵初期對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)、CO2釋放量、糖消耗和乙醇生成產(chǎn)生明顯的抑制作用,原花色素可以提高葡萄酒酵母在銅脅迫下抵抗有害作用的能力,并維持細(xì)胞的代謝活性。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析原花色素對(duì)釀酒酵母的影響,發(fā)現(xiàn)原花色素作用涉及6 個(gè)代謝途徑,包括維生素B6、硫胺素、氨基酸、氨酰基-tRNA、碳水化合物和類固醇代謝途徑。作者提出原花色素可以作為細(xì)胞外激活劑來(lái)增強(qiáng)維生素B6、硫胺素、碳水化合物和類固醇的代謝效率[17]。

    在發(fā)酵過(guò)程中,釀酒酵母能對(duì)各種物質(zhì)的脅迫和環(huán)境的變化做出相應(yīng)的代謝應(yīng)答。當(dāng)菌體受到外界脅迫時(shí),釀酒酵母會(huì)通過(guò)改變其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理生化指標(biāo)等來(lái)抵御外界傷害并維持自身活性[18]。SOD 與CAT 是生物氧化防御系統(tǒng)的抗氧化物酶[19-20],MDA 作為脂類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物可以體現(xiàn)生物體內(nèi)氧化應(yīng)激程度。為探究蘋果多酚物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)釀酒酵母生理特性的影響,本研究通過(guò)在蘋果酒發(fā)酵體系中加入不同質(zhì)量濃度的綠原酸,揭示釀酒酵母在綠原酸脅迫下的代謝應(yīng)答,以期闡明蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中多酚影響釀酒酵母的代謝規(guī)律和機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 材料與試劑

    釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC 31084,中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。紅富士蘋果,中國(guó)山東煙臺(tái),色澤紅潤(rùn),無(wú)蟲(chóng)害和機(jī)械損傷,4 ℃冷藏備用。

    綠原酸(純度為98%),上海阿拉丁生化科技有限公司;過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、總蛋白定量測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程研究所。3-辛醇(純度為98%)、酵母膏、蛋白胨、無(wú)水葡萄糖、氯化鈉,國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。PBS磷酸鹽緩沖劑,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent6890N/5975,美國(guó)Agilent 公司;纖維萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS,美國(guó)Supeleo 公司;LDZX-50KBS 高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;SPX-250B生化培養(yǎng)箱,天津市泰斯特儀器有限公司;1510全波長(zhǎng)讀數(shù)儀,Thermo Fisher Scientific 公司;UV3600 紫外分光光度計(jì),英國(guó)愛(ài)丁堡公司;恒溫水浴鍋,常州奧華儀器有限公司;JYZ-V906 榨汁機(jī),九陽(yáng)股份有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 蘋果汁的制備 參考肖媚等[7]的方法,略作修改。將紅富士蘋果洗凈、切塊、榨汁后用紗布過(guò)濾,取200 mL 于500 mL 錐形瓶中,分裝。65 ℃水浴鍋中恒溫水浴30 min,并不斷攪拌使其受熱均勻。水浴滅菌結(jié)束后,置于無(wú)菌操作臺(tái)紫外殺菌15 min,將綠原酸溶于超純水后用0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌。待蘋果汁自然冷卻后,加入終質(zhì)量濃度分別為0,0.1,1.0 g/L 的綠原酸。

    1.3.2 蘋果汁的發(fā)酵 將釀酒酵母菌種接種于150 mL 液體YPD 培養(yǎng)基中(酵母膏1%,蛋白胨2%,無(wú)水葡萄糖2%,121 ℃滅菌20 min),于28℃、120 r/min 培養(yǎng)20 h,酵母活化培養(yǎng)兩代后,用無(wú)菌水洗滌2 次,收集菌體,用適量滅菌蘋果汁復(fù)溶后以1%接種量加入到含有不同質(zhì)量濃度綠原酸的蘋果汁中,28 ℃下靜置培養(yǎng)。每隔1 d 取樣,并置于-20 ℃保存待用。

    1.3.3 超氧化物歧化酶(SOD)的測(cè)定 超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶,能夠催化超氧陰離子歧化,生成過(guò)氧化氫以及單質(zhì)氧。水溶性四唑鹽WST-1 能夠和超氧陰離子反應(yīng)生成水溶性的染料[21]。首先解凍發(fā)酵樣品,取發(fā)酵液5 mL,4 ℃3 000 r/min 離心10 min,棄去上清液。菌液經(jīng)4 ℃PBS 溶液洗滌2 次,用PBS 溶液重懸。采用高通量組織研磨儀破碎酵母細(xì)胞,破碎條件參考文獻(xiàn)[22]~[23],重復(fù)3 次。破碎后的釀酒酵母細(xì)胞于4 ℃5 000 r/min 離心10 min,取上清液并參照SOD 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.4 過(guò)氧化氫酶(CAT)的測(cè)定 采用鉬酸胺法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT),通過(guò)加入鉬酸銨能迅速終止CAT 分解H2O2的反應(yīng),剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生淡黃色的絡(luò)合物,于405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其變化量,計(jì)算釀酒酵母中CAT 的酶活[23-24]。發(fā)酵樣品處理方法同1.3.3 節(jié)所述,并參照CAT 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.5 丙二醛(MDA)的測(cè)定 過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸(TBA)發(fā)生縮合反應(yīng),形成紅色產(chǎn)物,在532 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰[23-24]。發(fā)酵樣品處理方法同1.3.3 節(jié)所述,并參照MDA 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.6 蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中主要香氣成分的測(cè)定

    1.3.6.1 香氣成分富集 參照Yang 等[25]方法,采用頂空固相微萃取法(HS-SPME)富集蘋果酒中的香氣成分,將4.8 mL 蘋果酒發(fā)酵上清液和0.2 mL 質(zhì)量濃度為327.2 μg/L 的內(nèi)標(biāo)物3-辛醇加入到15 mL 裝有磁性轉(zhuǎn)子的頂空瓶中,加入2 g 的NaCl,于45 ℃條件下平衡10 min 后采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭頂空萃取40 min。

    1.3.6.2 香氣成分檢測(cè) 將已吸附蘋果酒香氣成分的萃取頭插入氣相色譜柱進(jìn)口,250 ℃下解析5 min。色譜柱為HP-5MS 彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),氣相色譜條件和質(zhì)譜條件參考楊穎迪等[22]和葉萌祺[26]的方法。

    1.3.6.3 香氣成分定性與定量 通過(guò)對(duì)比NIST 05 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析,試驗(yàn)結(jié)果保留Qual>60 的鑒定結(jié)果;以3-辛醇為內(nèi)標(biāo)物,通過(guò)對(duì)樣品液中定性檢測(cè)出來(lái)的醇類、酸類、酯類等物質(zhì)的峰面積按公式(1)計(jì)算出各香氣成分的含量。

    式中,C1——香氣成分質(zhì)量濃度(μg/L);C0——內(nèi)標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量濃度 (μg/L);A1——香氣成分峰面積;A0——內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    以上所有試驗(yàn)重復(fù)至少3 次,采用Excel 2016 處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),用Origin 2018 繪圖,SPSS 11.0 (IBM 公司) 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),檢測(cè)平均值的顯著性水平 (S-N-K法),顯著性水平設(shè)置為P<0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

    超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是生物氧化防御系統(tǒng)的抗氧化物酶[19]。發(fā)酵過(guò)程中,綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母的SOD 活性影響如圖1所示。從圖1可以看出,在發(fā)酵第1 天,不同質(zhì)量濃度間SOD 活性具有顯著差異(P<0.05),1.0 g/L 綠原酸促進(jìn)作用最為明顯,且此時(shí)SOD 酶活達(dá)到最高值(20.19±1.61)U/mg 蛋白。在發(fā)酵第2 天,對(duì)照組(0 g/L 綠原酸)、0.01 g/L 綠原酸、0.1 g/L 綠原酸發(fā)酵體系中,釀酒酵母胞內(nèi)SOD 活性逐漸增強(qiáng),而1.0 g/L 綠原酸發(fā)酵體系中SOD 活性開(kāi)始減弱。發(fā)酵4 d 后,不同質(zhì)量濃度綠原酸發(fā)酵體系中釀酒酵母胞內(nèi)SOD 活性均逐漸降低,然而均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。上述結(jié)果分析表明綠原酸的存在提高了釀酒酵母胞內(nèi)SOD 活性。

    圖1 不同質(zhì)量濃度綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母CICC 31084 的SOD 活性的影響Fig.1 Effects of different mass concentrations of chlorogenic acid on SOD activity of Saccharomyces cerevisiae CICC 31084

    2.2 綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響

    過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)在釀酒酵母對(duì)H2O2引起的氧化脅迫中起著至關(guān)重要的作用[20],通過(guò)測(cè)定在不同質(zhì)量濃度綠原酸脅迫下釀酒酵母胞內(nèi)抗氧化酶活性,探究綠原酸對(duì)釀酒酵母的氧化脅迫。由圖2可知,發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母CAT活性均呈先降低后升高的趨勢(shì)。在發(fā)酵第1 天,不同質(zhì)量濃度綠原酸作用下釀酒酵母CAT 活性與對(duì)照組均有顯著差異(P<0.05)。在低質(zhì)量濃度0.01 g/L 綠原酸作用下釀酒酵母CAT 活性高于對(duì)照組,而在質(zhì)量濃度為0.1,1.0 g/L 綠原酸作用下釀酒酵母CAT 活性均低于對(duì)照組。發(fā)酵2 d 后,釀酒酵母CAT 活性開(kāi)始降低,在發(fā)酵4~6 d,CAT 活性降為最低,最低值分別為(4.27±0.43)U/mg 蛋白(0 g/L 綠原酸),(4.57±0.06)U/mg 蛋白(0.01 g/L 綠原酸),(1.31±0.08)U/mg 蛋白 (0.1 g/L 綠原酸),(0.40±0.02)U/mg 蛋白 (1.0 g/L 綠原酸)。發(fā)酵后期,釀酒酵母CAT 活性顯著增強(qiáng),在綠原酸質(zhì)量濃度為0.01,0.1 g/L 的作用下,釀酒酵母活性高于對(duì)照組,高質(zhì)量濃度1.0 g/L 綠原酸低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果分析表明,低質(zhì)量濃度綠原酸(0.01 g/L)會(huì)提高整個(gè)發(fā)酵周期釀酒酵母CAT 活性,而高質(zhì)量濃度綠原酸(1.0 g/L)脅迫會(huì)降低釀酒酵母CAT 活性。

    圖2 不同質(zhì)量濃度綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母CICC 31084 的CAT 活性的影響Fig.2 Effects of different mass concentrations of chlorogenic acid on CAT activity of Saccharomyces cerevisiae CICC 31084

    2.3 綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量的影響

    丙二醛(MDA)作為膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一,可以用來(lái)判斷釀酒酵母細(xì)胞膜氧化損傷程度[27]。發(fā)酵過(guò)程中不同質(zhì)量濃度的綠原酸對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)MDA 含量的影響,如圖3所示。從圖3可知,發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母胞內(nèi)MDA 含量呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢(shì)。在發(fā)酵前期,綠原酸的添加降低了釀酒酵母胞內(nèi)MDA 的含量,高質(zhì)量濃度1.0 g/L 綠原酸作用下MDA 含量最低,為(0.24±0.02)nmol/mg,與對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)。發(fā)酵1 d 后細(xì)胞胞內(nèi)MDA 含量緩慢增加。發(fā)酵8 d 時(shí),MDA 含量快速增加,分別達(dá)到最高值(8.64±0.30)nmol/mg (0 g/L 綠原酸),(12.42±0.23)nmol/mg(0.01 g/L 綠原酸),(13.38±0.27)nmol/mg(0.1 g/L 綠原酸),(11.40±0.48)nmol/mg(1.0 g/L 綠原酸)。發(fā)酵末期,細(xì)胞體內(nèi)MDA 含量降低,不同質(zhì)量濃度綠原酸作用MDA 含量均高于對(duì)照組,且有顯著差異(P<0.05)。結(jié)果表明,綠原酸的存在會(huì)降低發(fā)酵前期MDA 含量,提高發(fā)酵后期MDA 含量。

    圖3 不同質(zhì)量濃度綠原酸脅迫對(duì)釀酒酵母CICC 31084 胞內(nèi)MDA 的影響Fig.3 Effects of different mass concentrations of chlorogenic acid on intracellular MDA of Saccharomyces cerevisiae CICC 31084

    2.4 綠原酸脅迫對(duì)蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵香氣生成的影響

    香氣物質(zhì)是影響蘋果酒品質(zhì)的重要因素之一,根據(jù)前期文獻(xiàn)資料選取苯乙醇、辛酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯為蘋果酒關(guān)鍵香氣成分進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析[28]。添加不同質(zhì)量濃度綠原酸對(duì)蘋果酒關(guān)鍵香氣成分的影響,如圖4所示,各關(guān)鍵香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度隨著蘋果酒發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,在發(fā)酵中期達(dá)到最大值,后逐漸降低趨于穩(wěn)定。

    苯乙醇(2-phenylethanol)變化如圖4a 所示。外源綠原酸的添加促進(jìn)苯乙醇的生成。0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中苯乙醇含量均高于對(duì)照組(0 g/L 外源綠原酸),且變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致,在發(fā)酵前4 d 苯乙醇含量逐漸增加,發(fā)酵4 d 后苯乙醇含量呈現(xiàn)波動(dòng)變化。在1.0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中,發(fā)酵1 d 的苯乙醇含量低于對(duì)照組,發(fā)酵1 d 后苯乙醇含量逐漸增加且高于對(duì)照組,發(fā)酵8 d后苯乙醇含量降低。發(fā)酵結(jié)束時(shí),質(zhì)量濃度為0.1,1.0 g/L 的外源綠原酸發(fā)酵體系中苯乙醇含量高于對(duì)照組,分別為(10 324.63±34.14)μg/L(0.1 g/L 外源綠原酸),(10 183.36±124.71)μg/L(1.0 g/L 外源綠原酸),(9 514.63±424.26)μg/L (0 g/L 外源綠原酸)。

    發(fā)酵過(guò)程中辛酸乙酯(Ethyl octanoate)含量變化如圖4b 所示。在0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中,辛酸乙酯含量逐漸增加,發(fā)酵2 d 后趨于穩(wěn)定,在發(fā)酵6 d 后辛酸乙酯含量逐漸降低。在0.1 g/L外源綠原酸發(fā)酵體系中,辛酸乙酯含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均高于對(duì)照組,發(fā)酵第4 天時(shí)辛酸乙酯含量達(dá)到最高值,且明顯高于對(duì)照組,低質(zhì)量濃度外源綠原酸促進(jìn)辛酸乙酯的生成,發(fā)酵4 d 后辛酸乙酯含量逐漸減少。在1.0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中,發(fā)酵前期辛酸乙酯含量逐漸增加且低于對(duì)照組,發(fā)酵4 d 后辛酸乙酯含量高于對(duì)照組,發(fā)酵第6 天辛酸乙酯含量達(dá)到最高,而最高值低于0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中辛酸乙酯含量的最高值,發(fā)酵6 d 后辛酸乙酯含量逐漸降低。發(fā)酵結(jié)束時(shí),辛酸乙酯含量分別為(4 950.53±71.42)μg/L(0 g/L 外源綠原酸),(5 161.59±79.07)μg/L (0.1 g/L外源綠原酸),(5 639.33±20.51)μg/L(1.0 g/L 外源綠原酸)。在發(fā)酵后期,辛酸乙酯質(zhì)量濃度逐漸降低,不同質(zhì)量濃度綠原酸作用無(wú)顯著差異。

    圖4 蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中添加不同質(zhì)量濃度綠原酸對(duì)關(guān)鍵香氣生成的影響Fig.4 Effects of different mass concentrations of chlorogenic acid on key aroma component productions of Saccharomyces cerevisiae during cider fermentation

    發(fā)酵過(guò)程中乙酸苯乙酯 (Phenethyl acetate concentration)含量變化如圖4c 所示。0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中乙酸苯乙酯含量變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致,在發(fā)酵前4 d 乙酸苯乙酯含量逐漸增加,至第4 天達(dá)到最高值,后逐漸降低,且整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)乙酸苯乙酯含量略微高于對(duì)照組。在1.0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中,乙酸苯乙酯含量在發(fā)酵初期第1 天時(shí)低于對(duì)照組,發(fā)酵1 d 后乙酸苯乙酯含量逐漸增加,且明顯高于對(duì)照組,發(fā)酵6 d 后乙酸苯乙酯含量達(dá)到最高值,后逐漸降低。發(fā)酵結(jié)束時(shí),乙酸苯乙酯含量分別為(765.49±36.69)μg/L(0 g/L 外源綠原酸),(772.39±40.66)μg/L (0.1 g/L 外源綠原酸),(977.37±5.39)μg/L(1.0 g/L 外源綠原酸)。

    發(fā)酵過(guò)程中正己酸乙酯(Ethyl hexanoate)含量變化如圖4d 所示。正己酸乙酯含量呈先逐漸增加后逐漸降低的變化趨勢(shì)。0.1 g/L 外源綠原酸的添加明顯促進(jìn)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中正己酸乙酯的生成,而1.0 g/L 外源綠原酸的添加抑制了整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中正己酸乙酯的生成。發(fā)酵結(jié)束時(shí),正己酸乙酯含量分別為(1 613.55±42.43)μg/L(0 g/L 外源綠原酸),(1 739.7873±67.44)μg/L(0.1 g/L 外源綠原酸),(1 343.82±45.97)μg/L(1.0 g/L 外源綠原酸)。

    發(fā)酵過(guò)程中癸酸乙酯(Ethyl decanoate)含量變化如圖4e 所示。0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中,癸酸乙酯含量緩慢增加,發(fā)酵6 d 后癸酸乙酯含量逐漸降低。在0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中,癸酸乙酯含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均高于對(duì)照組,發(fā)酵第4 天時(shí)癸酸乙酯含量達(dá)到最高值,且明顯高于對(duì)照組,發(fā)酵4 d 后癸酸乙酯含量逐漸降低。在1.0 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中,發(fā)酵前期癸酸乙酯含量逐漸增加且低于對(duì)照組,發(fā)酵4 d 后癸酸乙酯含量高于對(duì)照組,發(fā)酵第6 天癸酸乙酯含量達(dá)到最高,最高值低于0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系癸酸乙酯含量的最高值,發(fā)酵6 d 后癸酸乙酯含量逐漸降低。發(fā)酵結(jié)束時(shí),癸酸乙酯含量分別為(2 350.5±413.66)μg/L(0 g/L 外源綠原酸),(2 314.97±45.40)μg/L (0.1 g/L 外源綠原酸),(3 719.39±416.24)μg/L(1.0 g/L 外源綠原酸)。

    發(fā)酵過(guò)程中乙酸異戊酯(Esoamyl acetate)含量變化如圖4f 所示。發(fā)酵過(guò)程中乙酸異戊酯含量呈先增加后逐漸降低的變化趨勢(shì)。發(fā)酵前期不同質(zhì)量濃度外源綠原酸作用效果較復(fù)雜,在發(fā)酵前3 d,添加外源綠原酸發(fā)酵體系中乙酸異戊酯含量低于對(duì)照組,此階段0.1 g/L 外源綠原酸發(fā)酵體系中乙酸異戊酯含量明顯小于對(duì)照組,發(fā)酵第4 天時(shí)添加外源綠原酸發(fā)酵體系中乙酸異戊酯含量開(kāi)始高于對(duì)照組。發(fā)酵中后期,外源綠原酸存在促進(jìn)乙酸異戊酯生成的作用,促進(jìn)效果與質(zhì)量濃度成正比。發(fā)酵結(jié)束時(shí),乙酸異戊酯含量分別為(458.56±78.07)μg/L(0 g/L 外源綠原酸),(467.44±80.53)μg/L(0.1 g/L 外源綠原酸),(571.44±84.50)μg/L(1.0 g/L 外源綠原酸)。

    對(duì)蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中不同質(zhì)量濃度外源綠原酸與關(guān)鍵香氣物質(zhì)生成量進(jìn)行相關(guān)性分析,相關(guān)系數(shù)如表1所示。由表1可知,蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中苯乙醇、乙酸苯乙醇、癸酸乙酯、乙酸異戊酯質(zhì)量濃度與外源綠原酸質(zhì)量濃度成正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.133,0.253,0.026,0.114。辛酸乙酯、正己酸乙酯與外源綠原酸質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為-0.012,-0.248。

    表1 蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中外源綠原酸質(zhì)量濃度與關(guān)鍵香氣成分生成量之間相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient between chlorogenic acid mass concentration and key aroma component production during cider fermentation

    3 結(jié)論

    蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中,釀酒酵母CICC 31084 在綠原酸脅迫下,主要通過(guò)改變胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量來(lái)提高釀酒酵母的抗逆能力。其中,SOD 活性隨著綠原酸質(zhì)量濃度的升高而逐漸增加;低質(zhì)量濃度綠原酸脅迫促使釀酒酵母的CAT活性增加,高質(zhì)量濃度綠原酸脅迫降低了CAT 活性。綠原酸脅迫降低了發(fā)酵前期MDA 含量,發(fā)酵后期MDA 含量逐漸增加。蘋果酒發(fā)酵過(guò)程中各關(guān)鍵香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,在發(fā)酵中期,各香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度達(dá)到最大值,后逐漸降低并趨于穩(wěn)定。相關(guān)性分析表明關(guān)鍵香氣物質(zhì)苯乙醇、乙酸苯乙醇、癸酸乙酯、乙酸異戊酯的質(zhì)量濃度與外源綠原酸質(zhì)量濃度成正相關(guān)關(guān)系;辛酸乙酯、正己酸乙酯的質(zhì)量濃度與外源綠原酸質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

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