低值海參促進小鼠骨折愈合及機制研究

李 卓，田迎櫻，李媛媛，閆子怡，傅安妮，王靜鳳*

（1 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266003 2 青島海洋生物醫(yī)藥研究院 山東青島 266000）

骨折是很常見的臨床疾病，以愈合無畸形，盡快恢復(fù)肢體功能作為骨折治療的目標。骨折后其完整性一般情況下可完全恢復(fù)，然而愈合過程也可能受到例如：骨質(zhì)疏松、肥胖、糖尿病、血管疾病、感染等因素的影響[1]。臨床醫(yī)學(xué)認為如果超過3 個月仍未完全愈合即被稱為延遲愈合，超過9個月后且最后3 個月內(nèi)沒有愈合跡象，被稱為不愈合。據(jù)統(tǒng)計，每年由車禍、運動損傷或工作事故造成的骨折中，有高達10%～15%的患者出現(xiàn)延遲或不愈合的情況[2]，需要額外的長期治療，治療成本高且對患者的生活質(zhì)量有很大影響。目前，臨床上尚無藥物被批準用于治療骨不連以加速骨折愈合[3]。由于臨床上采用的物理療法和基因療法價格高昂且有副作用，因此，采用膳食輔助治療的方法加快患者骨折愈合進程逐漸成為研究熱點。

海地瓜屬棘皮動物門（Echinodermata）芋參目（Molpadida）的動物，是一種食用性較差的低值海參，主要分布在我國東海、南海，資源豐富且價格低廉，具有巨大的開發(fā)潛力[4]。海地瓜體內(nèi)含有酸性黏多糖、皂苷、膠原蛋白和磷脂型DHA、EPA 等多種活性物質(zhì)，已證明這些物質(zhì)具有降血糖，抗腫瘤，降血脂，抗氧化的生理活性[5-8]。中醫(yī)學(xué)認為，海參具有補腎益精的功效，腎主骨生髓[9-10]，有關(guān)海地瓜對骨折愈合過程的影響尚未見報道。本研究以海地瓜為研究對象，建立右脛開放性骨折模型，研究海地瓜對模型小鼠骨折愈合過程的影響，旨在為海地瓜的深度開發(fā)及在骨折愈合方面的應(yīng)用提供指導(dǎo)，為海地瓜保健食品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 材料 海地瓜 （Acaudina molpadioidea）和仿刺參（Apostichopus japonicus），青島市南山水產(chǎn)市場，二者已經(jīng)制成干制品。將購得的兩種干海參分別清洗后置于膠體磨中粉碎，烘干后得到海參粉，過140 目篩，將細粉置于干燥器中保存待用。用生理鹽水配成50 mg/mL 的海參懸濁液用于灌胃。

1.1.2 實驗動物 雌性C57BL/6 小鼠，SPF 級別，體重 （20.00±2.5）g，許可證號SCXK （魯）2014-0007。小鼠飼養(yǎng)溫度（23±1）℃，相對濕度約為40%～60%，明暗交替12 h /12 h，整個實驗期間允許小鼠自由飲食、飲水。

1.1.3 主要試劑 Aggrecan、Col10α、MMP13 ELISA 測定試劑盒，美國R&D；UNIQ-10 柱式Trizol總RNA 抽提試劑盒、隨機引物，上海生工；MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，美國Promega；dNTP Mixture，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；SOX9、VEGF 等目的基因引物序列合成自金唯智生物科技有限公司；實驗過程所需其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.1.4 儀器與設(shè)備 GL-20M 高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器公司；Model 680 型酶標儀，美國Bio-Rad 公司；WGP-300 型隔水式恒溫培育箱，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；BH-2 型顯微鏡，日本Olympus 公司；Ultra Trurrax T18 basic型高速勻漿機，德國Ika 公司；LightCycler 96Instrument 實時熒光定量PCR 儀，瑞士Roche 公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與實驗設(shè)計 70 只健康小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，配制質(zhì)量分數(shù)為4%的水合氯醛用于麻醉，每只小鼠統(tǒng)一在右脛中上1/3 處位置進行脛骨開放性骨折。術(shù)后3 d 均需腹腔注射青霉素防止術(shù)后感染，將手術(shù)后成功的小鼠隨機分為3 組：骨折模型組（生理鹽水）、仿刺參組（500 mg/kg BW）、海地瓜組（500 mg/kg BW），每組21只。骨折后第1 天立即灌胃受試物，每天1 次，按照10 mL/kg BW 的灌胃體積進行連續(xù)干預(yù)。每組分別于術(shù)后第5，10，21 天取7 只小鼠禁食、不禁水8 h，稱重、摘眼球取血，分離血清用于相關(guān)指標的測定；取骨痂，快速剔除肌肉和筋膜組織，或固定于中性甲醛中用于組織形態(tài)學(xué)的測定，或入液氮暫存用于測定相關(guān)基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.2 骨痂組織形態(tài)學(xué)觀察 取不同時期小鼠右脛骨痂，剝?nèi)ジ街∪饨钅そM織后快速放入體積分數(shù)為10%的中性甲醛溶液中固定，沖洗掉固定液后再放入質(zhì)量分數(shù)為8%的EDTA 脫鈣溶液中，每隔1 周更換1 次脫鈣液，脫鈣時間為3 周。得到的組織進行常規(guī)的石蠟包埋切片，組織厚度為7 μm，H&E 染色觀察。

1.2.3 血清生化指標測定 參照ELISA 試劑盒說明書測定血清Aggrecan、Col10α、MMP13 的含量。

1.2.4 qRT-PCR 分析 不同時期骨痂RNA 按照UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒說明書進行提取，使用NanoDrop-2000 微量分光光度計測定RNA 純度和濃度后，取1 μg RNA 樣品進行逆轉(zhuǎn)錄，采用qRT-PCR 法測定骨痂中不同時期SOX9、Col10α、MMP-13、VEGF、Col1α、ALP、Ihh、Patched、Gli1、Gli2、Smad1、Smad4、Smad5、RUNX2的轉(zhuǎn)錄水平。反應(yīng)體系為25 μL，其中cDNA 樣品5 μL，對應(yīng)基因的上下游引物各0.75 μL，DEPC水6 μL，SYBR 熒光染料12.5 μL。擴增過程：預(yù)變性（95 ℃，10 min），變性（95 ℃，15 s），退火（60 ℃，20 s），延伸（72 ℃，30 s），擴增過程共計35 個循環(huán)。表1為各個基因的具體引物序列，各目的基因mRNA 表達量以β-actin 作為內(nèi)參校正。

表1 目的基因引物序列Table 1 The primer sequence of different genes

（續(xù)表1）

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 海地瓜對模型小鼠SOX9 和Aggrecan 水平的影響

SOX9 是軟骨細胞在早期分化過程中表達的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄水平的升高標志著軟骨細胞開始增殖并成熟，此時軟骨細胞數(shù)量增多并開始合成Aggrecan。因此，Aggrecan 的血清含量可反映此時軟骨基質(zhì)合成情況[11-12]。圖1（a，b）結(jié)果顯示，骨折術(shù)后第5 天，海地瓜與仿刺參組的SOX9 轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于模型組，分別升高了60.34%和63.33%（P<0.01），即海地瓜干預(yù)可促進模型小鼠提前形成軟骨細胞；骨折術(shù)后第10天，此時模型組顯示出活躍的軟骨細胞生成，而海地瓜與仿刺參組SOX9 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平與Aggrecan 血清濃度相較于模型組均顯著降低，分別顯著降低了52.83%，55.19%和12.1%，16.4%（P<0.01）。結(jié)果表明海地瓜具有促進軟骨形成的作用，較模型組提前渡過了軟骨細胞增殖及軟骨基質(zhì)合成高峰期。

圖1 海地瓜對模型小鼠SOX9（a）和Aggrecan（b）水平的影響Fig.1 Effects of Acaudina molpadioidea on SOX9 （a） and Aggrecan （b） in fracture model mice

2.2 海地瓜對模型小鼠Col10α、MMP13 和VEGF 水平的影響

Col10α 的表達會刺激增殖或預(yù)肥大的軟骨細胞轉(zhuǎn)化為肥大軟骨細胞[13]，肥大軟骨細胞分泌金屬蛋白酶MMP13，介導(dǎo)軟骨中Ⅱ型膠原蛋白的降解[14]。如圖2所示，術(shù)后第10 天，與模型組相比，海地瓜與仿刺參的干預(yù)均顯著降低血清Col10α含量，分別降低了15.78%和19.31%（圖2a）（P<0.01），同時血清MMP13 的含量分別增加了15.02%和14.91%（P<0.01）（圖2b），模型組血清Col10α 和MMP13 含量的變化進程均顯著落后。說明海地瓜干預(yù)能夠更早的渡過軟骨細胞肥大階段，促進軟骨基質(zhì)降解，為后期成骨細胞入侵奠定基礎(chǔ)，其作用效果與仿刺參相當。

血管入侵為新骨生成奠定了重要基礎(chǔ)，對軟骨內(nèi)骨化過程至關(guān)重要，VEGF 是促進血管生成的經(jīng)典誘導(dǎo)因子[15]。如圖2c 所示，模型組VEGF mRNA 轉(zhuǎn)錄水平直至骨折后第21 天仍持續(xù)升高，且轉(zhuǎn)錄顯著水平低于兩種海參干預(yù)組，該結(jié)果表明模型小鼠血管生成進程落后。而海地瓜與仿刺參的干預(yù)均在第10 天顯著上調(diào)了VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平。說明海地瓜加快了模型小鼠血管入侵速度，為成骨細胞和破骨細胞募集于折斷端做好準備，其作用效果與仿刺參相當。

圖2 海地瓜對模型小鼠Col10α（a），MMP13（b）和VEGF（c）水平的影響Fig.2 Effects of Acaudina molpadioidea on Col10α（a），MMP13 （b） and VEGF （c） in fracture model mice

2.3 海地瓜對模型小鼠ALP 和Col1α 水平的影響

ALP 和Col1α 是不同階段新骨生成的標志基因[16]。如圖3所示，模型組的ALP、Col1α 的轉(zhuǎn)錄水平均在術(shù)后21 d 才達到頂峰，術(shù)后第10 天，海地瓜與仿刺參干預(yù)即可顯著上調(diào)早期成骨標志物ALP 的轉(zhuǎn)錄水平，與模型組滯后的骨生成相比分別升高了291.32%和212.2%（P < 0.01）；術(shù)后第21 天，海地瓜與仿刺參組Col1α 轉(zhuǎn)錄水平較模型組分別顯著上調(diào)了74.66%和101.42%（P<0.01）。說明海地瓜干預(yù)使模型小鼠的新骨生成活躍，在骨折愈合中期和后期均能顯著加快新骨生成速度，其作用效果與仿刺參相當。

圖3 海地瓜對模型小鼠ALP（a）和Col1α（b）水平的影響Fig.3 Effects of Acaudina molpadioidea on ALP （a） and Col1α （b） in fracture model mice

2.4 海地瓜促進骨折小鼠纖維愈傷組織的形成

如圖4所示，骨折術(shù)后第5 天，模型組充斥著大量血腫，仍存在明顯的炎癥浸潤且沒有形成纖維骨痂。與模型組相比，灌胃海地瓜與仿刺參使模型小鼠的折斷端已初步連接在一起，折斷端由血腫快速轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維結(jié)締組織，表明二者的干預(yù)使其更快的渡過了炎癥期，也更有利于軟骨性骨痂的形成，海地瓜的作用效果略次于仿刺參。

圖4 術(shù)后5 d 骨痂組織切片H & E 染色（10×放大）Fig.4 H & E staining of the callus on days 5 post-surgery （10× magnification）

2.5 海地瓜促進骨折小鼠軟骨痂的形成

骨折術(shù)后第10 天為軟骨痂期，如圖5所示，模型組的軟骨細胞為圓形排列、體積較小的幼稚軟骨細胞，只有極少數(shù)軟骨細胞出現(xiàn)肥大，并未開始終末分化。灌胃海地瓜與仿刺參干預(yù)后，模型小鼠的骨折斷端出現(xiàn)了大量肥大軟骨細胞，且出現(xiàn)了礦化新骨；仿刺參組軟骨細胞面積更少，肥大軟骨礦化凋亡更明顯，且有大量新生骨小梁出現(xiàn)。即海地瓜干預(yù)在第10 天相比模型組更快的渡過了軟骨增殖期，加速了軟骨細胞的肥大礦化，其中海地瓜促進軟骨性骨痂向骨性骨痂的轉(zhuǎn)變作用效果略次于仿刺參。

圖5 術(shù)后10 d 骨痂組織切片H & E 染色（10×和20×放大）Fig.5 H & E staining of the callus on days 10 post-surgery （10× and 20× magnification）

2.6 海地瓜促進骨折小鼠硬骨痂形成與重塑

骨折術(shù)后21 d，3 組的染色結(jié)果均顯示出硬骨痂期的特點。如圖6所示，模型組形成的硬骨痂排列松散且不規(guī)則，呈現(xiàn)明顯的編織骨特點，骨細胞分布廣且數(shù)量多。灌胃海地瓜與仿刺參使模型小鼠的骨細胞分化更加成熟，體積變小，數(shù)量變少，且編織骨轉(zhuǎn)變?yōu)榱烁旅艿陌鍖庸?。說明海地瓜的干預(yù)加快了模型小鼠的新骨生成速率，促進編織骨向板層骨轉(zhuǎn)化，其作用效果與仿刺參相當。

圖6 術(shù)后21 d 骨痂組織切片H & E 染色（10×和20×放大）Fig.6 H & E staining of the callus on 21 days post-surgery （10× and 20× magnification）

2.7 海地瓜激活I(lǐng)hh-PThrp 和Smads/Runx2信號通路促進骨折愈合

Ihh 主要由肥大前的軟骨細胞分泌，Ihh 信號激活后既可以調(diào)節(jié)軟骨細胞的增殖，也可以調(diào)節(jié)軟骨細胞的肥大分化與礦化成骨[17]，是軟骨內(nèi)骨化的重要過程。如圖7所示，骨折后第10 天，與模型組相比，海地瓜與仿刺參的干預(yù)均能顯著下調(diào)Ihh、Patched、Gli1、Gli2 的轉(zhuǎn)錄水平，使模型小鼠提早渡過軟骨細胞的肥大階段，加快了礦化與新骨生成進程；骨折術(shù)后第21 天，二者的干預(yù)同樣下調(diào)了Ihh 通路關(guān)鍵基因的表達，該結(jié)果表明海地瓜可通過Ihh 信號通路促進軟骨細胞的肥大過程。

圖7 Ihh-PThrp 通路關(guān)鍵因子mRNA 的表達Fig.7 The mRNA impression of key genes in Ihh pathway

由Smads 介導(dǎo)的BMP 信號不僅可以調(diào)控骨生成，而且還可以調(diào)控軟骨細胞的肥大和成熟。Smads/Runx2 通路關(guān)鍵基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平如圖8所示。術(shù)后第10 天，海地瓜與仿刺參的干預(yù)可顯著降低Smad1、Smad4、Smad5、Runx2 的mRNA 表達水平；術(shù)后第21 天，Smads/Runx2 通路關(guān)鍵基因的mRNA 表達各組之間無顯著差異，以上結(jié)果側(cè)面反映了仿刺參與海地瓜的Smads/Runx2信號在術(shù)后第10 天減弱，即海地瓜的干預(yù)能促進軟骨細胞更快的渡過肥大時期，提早進入礦化成骨階段，其作用效果與仿刺參相當。

圖8 Smads/Runx2 通路關(guān)鍵因子mRNA 的表達Fig.8 The mRNA impression of key genes in Smads/Runx2 pathway

3 討論

本實驗采用右脛開放性骨折模型，探究海地瓜對小鼠骨折愈合過程的影響。結(jié)果顯示，海地瓜的促骨折愈合作用效果與仿刺參相當，海地瓜使愈合早期的模型小鼠更快的渡過軟骨增殖及肥大階段，促進基質(zhì)降解及血管入侵，加快新骨形成速率以加速軟骨內(nèi)骨化過程，促進骨折愈合。其作用是通過激活I(lǐng)hh 和Smads/Runx2 信號通路實現(xiàn)的。

骨折修復(fù)是一個復(fù)雜的過程，骨折后繼發(fā)性骨愈合過程類似于縱向骨生長過程中的軟骨內(nèi)成骨過程[18]，即利用內(nèi)源性再生潛能恢復(fù)原始骨結(jié)構(gòu)，促進礦化組織的增加。然而目前骨折愈合的詳細病理生理機制尚未完全闡明，以往的研究結(jié)果表明，這一過程主要依賴于成骨細胞和破骨細胞的作用以及軟骨內(nèi)骨化過程中多種細胞因子的調(diào)控[19]。

Sox9 是一種含有高遷移率組框DNA 結(jié)合區(qū)的蛋白，主要在增殖的軟骨細胞中表達，是軟骨細胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，能夠誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)如Aggrecan 和CoL2α 的合成，在軟骨內(nèi)骨化中尤為重要[20]。Akiyama 等[21]通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)在肢芽的間充質(zhì)細胞中敲除Sox9 后，軟骨形成受阻，并且軟骨基質(zhì)標志基因的表達低下。本研究結(jié)果顯示，海地瓜干預(yù)可上調(diào)愈合早期Sox9 的mRNA 轉(zhuǎn)錄，組織學(xué)染色結(jié)果也表明其能促進骨折早期軟骨組織的形成從而加快骨折愈合。在新骨形成初期，血管生成與骨形成緊密相連，VEGF 是有力的促血管生成因子，ALP 代表早期骨礦化程度[22]。海地瓜干預(yù)在術(shù)后第10 天顯著促進了血管生成和新骨的形成，在不同程度上提高了VEGF 和ALP 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，這與組織學(xué)染色結(jié)果中海地瓜干預(yù)促進模型小鼠的軟骨痂向硬骨痂轉(zhuǎn)變及愈合程度相對應(yīng)，證明海地瓜可促進骨性骨痂的形成，且作用效果與仿刺參相當。

軟骨細胞肥大礦化是軟骨內(nèi)骨化中重要的過程，它是血管入侵肥大區(qū)域，新骨組織代替軟骨組織的基礎(chǔ)[23]。Ihh 信號和Smads/Runx2 信號在調(diào)控軟骨細胞的肥大過程中發(fā)揮著重要作用，軟骨細胞表達Col10a 是軟骨基質(zhì)礦化的前提[24-25]。本研究中，骨折后第10 天，海地瓜干預(yù)后血清Col10α含量顯著下降，對應(yīng)此時Ihh 信號和Smads/Runx2的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號減弱，即海地瓜的干預(yù)使模型小鼠提早渡過了軟骨肥大時期，步入新骨形成時期，這與組織形態(tài)學(xué)結(jié)果一致。Smads/Runx2 信號中Smads蛋白是BMP2 在細胞內(nèi)信號傳遞過程中的重要中介因子，Retting 等[26]通過實驗證明在軟骨內(nèi)骨化中Smad1 和Smad5 是軟骨分化中非常關(guān)鍵的調(diào)控因子。本研究中，對Smads/Runx2 信號通路中Samd1、Smad4 和Smad5 的轉(zhuǎn)錄水平進行了測定，結(jié)果顯示術(shù)后第10 天，海地瓜組的Samd1、Smad4和Smad5 的轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低，這與Ihh 信號中關(guān)鍵基因表達的趨勢相同，提示海地瓜干預(yù)也可以通過Smads/Runx2 信號通路調(diào)控軟骨細胞的肥大過程。有研究表明，Smads 蛋白和Runx2 結(jié)合后可以激活Col10a 的轉(zhuǎn)錄活性[27-28]，并且Amano等[29]通過免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)Gli1/Gli2 可以分別結(jié)合在RUNX2、Smads 的結(jié)合位點上并形成共聚體，然后共同結(jié)合在Col10a 的啟動子上，進而激活Col10a 的轉(zhuǎn)錄，促進軟骨細胞的肥大。本研究中海地瓜干預(yù)激活了Ihh 及Smads/Runx2 信號通路中關(guān)鍵基因的表達，促進Col10a 的轉(zhuǎn)錄，推測海地瓜可能通過Ihh 信號和BMP2/smads 信號的交互作用調(diào)控軟骨細胞的肥大過程。

本研究證實了海地瓜整參的促進骨折愈合活性，已有前人探究了不同來源的活性肽[30]、多糖[31]及皂苷[32]等活性成分在骨折愈合軟骨內(nèi)骨化過程中發(fā)揮的積極作用，海地瓜中含有的酸性黏多糖、膠原肽、皂苷等活性成分可能是促進骨折愈合的關(guān)鍵因素，然而現(xiàn)有研究并未明確具體起作用的活性成分，以及這些活性成分起作用的具體靶點，其潛在機制值得進一步研究，這將加深對海參骨折愈合過程中改善效果的理解。

綜上所述，海地瓜可通過促進軟骨細胞增殖肥大、基質(zhì)降解、血管入侵及新骨生成以加快軟骨內(nèi)骨化進程，從而加速模型小鼠骨折愈合，其促進機制可能與Ihh 信號和BMP2/smads 信號交互并調(diào)控軟骨細胞的肥大有關(guān)，本研究首次以攝入整參的方式對比了海地瓜與仿刺參促進骨折愈合的活性，為以海地瓜為代表的低值海參的藥用價值開發(fā)提供了理論支撐。