LR12 肽通過(guò)調(diào)控TLR-4/ NF-κB 信號(hào)通路對(duì)壞死性小腸結(jié)腸炎新生小鼠腸道損傷的影響

占彩霞 廖鎮(zhèn)宇 黃瑞文 劉銀芝 楊 慧

湖南省兒童醫(yī)院新生兒科，湖南長(zhǎng)沙 410007

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotic enterocolitis，NEC）是以腸道炎癥為特點(diǎn)的消化系統(tǒng)疾病，常發(fā)生于早產(chǎn)兒，由于復(fù)雜的發(fā)病因素，臨床上缺乏有效治療手段，死亡率約為30%[1]。NEC 病情進(jìn)展較快，目前尚未完全闡明其發(fā)病機(jī)制，但認(rèn)為腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能的改變及腸道炎性損傷是其發(fā)病基礎(chǔ)[2]。髓細(xì)胞觸發(fā)受體1（triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1）是一種炎癥激發(fā)受體，能通過(guò)激活TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其在膿毒癥、結(jié)腸炎等炎癥疾病中發(fā)揮重要作用[3-5]。作為一種TREM1特異性抑制肽，LR12 肽能夠捕獲TREM1 配體，阻斷TREM1 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，具有顯著的抗炎作用[6]，目前已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為治療膿毒性休克的藥物。但目前還未知曉LR12 肽對(duì)NEC 是否有治療效果，為此，本研究通過(guò)構(gòu)建幼鼠NEC 模型，并進(jìn)行LR12 肽干預(yù)，探討LR12 肽對(duì)NEC 的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠18 只（雌性6 只，雄性12 只），8 周齡，體重16～23 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2019-031，動(dòng)物合格證號(hào)：No.1103241911007575。實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范。

1.2 主要試劑

LR12 肽（LQEEDTGEYGCV）及其無(wú)效肽LR12 scramble（YQMGELCAGEED）由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成并提供；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，貨號(hào)：SMB00704）、異硫氰酸熒光素-葡聚糖（FITCDextran，貨號(hào)：46944）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；鼠白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β（貨號(hào)：CSB-E08054m）、IL-6（貨號(hào)：CSB-E04639m）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，貨號(hào)：CSB-E04741m）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢華美生物有限公司；TREM1（11791-1-AP）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；TLR-4（貨號(hào)：14358S）、MyD88（貨號(hào)：4283S）、NF-κB p65（貨號(hào)：6956S）、IκBα（貨號(hào)：4814S）、GAPDH（貨號(hào)：51332S）抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；ECL 顯影試劑盒購(gòu)自美國(guó)密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模及給藥 將雌鼠和雄鼠按照1∶2 合籠受孕，孕鼠共計(jì)產(chǎn)仔60 只。采用隨機(jī)數(shù)字表法將幼鼠分為四組（n=15）：對(duì)照組、模型組、LR12-scr 組（作為陰性對(duì)照）和LR12 組。將2 日齡幼鼠置于保育箱，喂養(yǎng)方式采用人工喂養(yǎng)，代乳品及喂養(yǎng)劑量參考文獻(xiàn)[7]配制。對(duì)照組不做任何操作，其余三組采用缺氧冷刺激+LPS 干預(yù)法[8]構(gòu)建NEC 模型：將幼鼠放入90%氮?dú)庵腥毖?0 s，然后置于4℃冰箱進(jìn)行冷刺激10 min，再腹腔注射7 mg/kg LPS，連續(xù)操作3 d。造模結(jié)束后，若幼鼠NEC 臨床癥狀評(píng)分≥8 分視為模型成功[9]。模型成功且無(wú)死亡。LR12-scr 組腹腔注射5 mg/kg LR12 scramble，LR12 組腹腔注射等劑量LR12 肽，對(duì)照組和模型組給予等量溶劑，1 次/d，連續(xù)3 d。

1.3.2 幼鼠臨床癥狀評(píng)分 記錄所有幼鼠實(shí)驗(yàn)前后的體重，并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行臨床癥狀評(píng)分。見(jiàn)表1。

表1 NEC 臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 檢測(cè)腸黏膜通透性 所有幼鼠灌胃40 mg/g 的FTTC-Dextran 溶液，4 h 后眼眶取血，3500 r/min 離心10 min，離心半徑為15 cm。采用酶標(biāo)儀測(cè)定血漿熒光強(qiáng)度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算其濃度。

1.3.4 蘇木精-伊紅（hematoxylineosin,HE）染色所有幼鼠取回盲部腸組織固定24 h 后取出，石蠟包埋后切片5 μm，行HE 染色。參考Nadler 標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行雙盲評(píng)分，評(píng)分≥3 分者視為NEC 樣腸損傷。見(jiàn)表2。

表2 Nadler 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5 檢測(cè)腸組織中炎癥因子水平 取所有幼鼠腸組織制備組織勻漿，在4℃，3000 r/min 離心15 min，離心半徑為15 cm，取上清，按照試劑盒說(shuō)明書的步驟檢測(cè)TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表達(dá)水平。

1.3.6 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取所有幼鼠腸組織裂解成組織勻漿，12 000 r/min 離心20 min，離心半徑為15 cm，取上清，按照BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取25 μg 蛋白，經(jīng)SDS 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入TREM（1∶1000）、TLR-4（1∶1000）、MyD88（1∶1000）、NF-κB p65（1∶500）、IκBα（1∶500）和GAPDH（1∶1000）孵育，TBST 清洗，加入相應(yīng)屬性二抗（1∶10 000），膜滴加ECL 試劑后，采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組幼鼠實(shí)驗(yàn)前后體重變化、臨床癥狀積分比較

各組實(shí)驗(yàn)前體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），實(shí)驗(yàn)后模型組體重低于對(duì)照組，而LR12 組體重高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；模型組臨床癥狀積分高于對(duì)照組，LR12 組積分低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），而LR12-scr 組積分與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組幼鼠實(shí)驗(yàn)前后體重變化、臨床癥狀積分比較（）

表3 各組幼鼠實(shí)驗(yàn)前后體重變化、臨床癥狀積分比較（）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

2.2 各組幼鼠腸組織病理學(xué)及腸黏膜通透性比較

對(duì)照組腸組織病理結(jié)構(gòu)正常。模型組和LR12-scr 組腸組織絨毛雜亂，部分絨毛脫落甚至缺失，肌層變薄。LR12 組腸組織結(jié)構(gòu)較清晰，絨毛壞死或脫落現(xiàn)象減少。見(jiàn)圖1。模型組腸組織病理學(xué)評(píng)分和血清FITC-Dextran 含量高于對(duì)照組，LR12 組病理評(píng)分和血清FITC-Dextran 含量低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），而LR12-scr 組以上數(shù)據(jù)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組幼鼠腸組織病理學(xué)評(píng)分及血清FITC-Dextran 含量比較（）

表4 各組幼鼠腸組織病理學(xué)評(píng)分及血清FITC-Dextran 含量比較（）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05

圖1 HE 染色觀察腸組織病理學(xué)變化

2.3 各組幼鼠腸組織炎癥因子水平比較

模型組TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平高于對(duì)照組，LR12 組TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），而LR12-scr 組以上指標(biāo)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組幼鼠腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平比較（ng/L，）

表5 各組幼鼠腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平比較（ng/L，）

注 與對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細(xì)胞介素-6

2.4 各組幼鼠腸組織中TREM1 蛋白及TLR-4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化

與對(duì)照組比較，模型組腸組織中TREM1、TLR-4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平升高，IκBα 蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與模型組比較，LR12 組TREM1、TLR-4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平降低，IκBα 蛋白水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；而LR12-scr 組以上指標(biāo)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組幼鼠腸組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平（n=15）

3 討論

LPS+低氧刺激是反應(yīng)人類NEC 最成功的建模方法[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組幼鼠表現(xiàn)出明顯的NEC癥狀，并出現(xiàn)嚴(yán)重的腸損傷、腸黏膜屏障受損，炎癥加重等變化，說(shuō)明NEC 模型成功。然而，本研究采用LR12 肽干預(yù)后，幼鼠NEC 癥狀有所緩解，腸道損傷減輕，腸黏膜通透性改善，炎癥水平降低，并且顯著抑制TREM1 表達(dá)和TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路的活化。提示，LR12 肽對(duì)NEC 具有改善作用。

TREM1 是一種新型炎癥激發(fā)受體，其可激活并放大TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路，促進(jìn)促炎因子的釋放[12-14]。Shen 等[15]研究顯示，潰瘍性結(jié)腸炎疾病的嚴(yán)重程度和活動(dòng)度與TREM1 顯著相關(guān)。相關(guān)研究[16-17]報(bào)道，下調(diào)TREM1 表達(dá)可抑制小鼠結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)及相關(guān)腫瘤的發(fā)生。作為TREM1 特異性抑制肽，LR12 肽常應(yīng)用于TREM1 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的相關(guān)研究中，并已成為一種治療膿毒癥休克的臨床用藥[18]。然而，LR12 肽對(duì)NEC 的影響尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，采用LR12肽干預(yù)后，NEC 幼鼠臨床癥狀有所改善，并且腸組織損傷減輕，腸黏膜通透性及腸組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平均降低，提示LR12 肽對(duì)NEC 具有一定的改善作用。本研究進(jìn)一步顯示，NEC 幼鼠腸組織中TREM1蛋白表達(dá)水平顯著增加，而LR12 肽干預(yù)可抑制NEC幼鼠腸組織中TREM1 蛋白表達(dá)，提示LR12 肽對(duì)NEC的改善作用可能與抑制TREM1 表達(dá)有關(guān)。

TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路是調(diào)控炎癥反應(yīng)的主要通路之一，且TREM1 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)均由該信號(hào)通路發(fā)揮作用。TLR-4 激活后會(huì)通過(guò)MyD88 觸發(fā)信號(hào)，降解IκBα 和釋放NF-κB p65，從而激活NF-κB[19-20]。而NF-κB 作為核轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)[21]。腸道免疫系統(tǒng)異常激活導(dǎo)致的炎癥“瀑布”效應(yīng)是NEC 發(fā)病的關(guān)鍵因素[22-23]。眾多研究[24-25]顯示，抑制TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路活化可改善NEC 腸損傷，降低炎癥反應(yīng)。Shi 等[26]研究顯示，LR12肽通過(guò)降低TREM 1 的表達(dá)，抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活來(lái)緩解LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷。本研究結(jié)果顯示，NEC 幼鼠腸組織中TLR-4/NF-κB 炎癥信號(hào)通路異?；罨２捎肔R12 肽干預(yù)后，NEC 幼鼠腸組織中TLR-4/NF-κB 炎癥信號(hào)通路受到抑制。因此，LR12肽可能通過(guò)下調(diào)TREM1，進(jìn)而抑制TLR-4/NF-κB 炎癥信號(hào)通路活化，最終降低炎癥反應(yīng)及腸黏膜通透性，改善NEC 腸道損傷。

綜上所述，LR12 肽能夠改善腸黏膜通透性，抑制腸組織炎癥反應(yīng)，從而減輕腸組織損傷，其機(jī)制可能與抑制TLR-4/NF-κB 信號(hào)通路活化有關(guān)，本研究可為NEC 疾病的預(yù)治療提供了新的方向。