自噬、炎癥反應(yīng)及免疫功能異常在急性胰腺炎中的研究進(jìn)展

何昱靜，溫 雪，盧利霞，馬 俊，于曉輝，張久聰

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室，甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點實驗室；3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院消化內(nèi)科

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種與胰腺外分泌組織損傷和壞死相關(guān)的炎癥性疾病，該病起病快、病情較重、多預(yù)后不良，其發(fā)病率為10%～20%。該病可不同程度地引起肺、腎、肝、心臟等重要實質(zhì)臟器損傷，嚴(yán)重時可在疾病早期發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)甚至死亡。近年來，AP的發(fā)病率不斷上升，死亡率高達(dá)30%[1]。AP常由膽石癥、酒精濫用、高甘油三酯血癥、藥物、肥胖、致病基因變異、自身免疫、感染、手術(shù)并發(fā)癥、代謝和/或內(nèi)分泌失調(diào)等原因引起，前兩者是AP發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素，其中膽石疾病是最常見的原因，其次是酒精；并且由于二者在發(fā)病地區(qū)和性別上的不同，造成其發(fā)病率相應(yīng)不同，通常膽石癥常見于女性，飲酒常見于男性[2]。但相關(guān)研究結(jié)果顯示[3]，在我國，高甘油三酯血癥是引起AP的最常見原因，其次是膽石癥，酒精性AP患者相比前兩者較少見。同時，最新的研究表明[4]，高甘油三酯血癥相關(guān)性AP大鼠組與正常飲食AP大鼠相比，胰腺損傷、細(xì)胞凋亡更嚴(yán)重，自噬通量受阻，并且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)，提示高甘油三酯血癥可加重AP。

1 自噬在AP中的作用

自噬是一種細(xì)胞涉及溶酶體降解并回收受損及有缺陷的細(xì)胞器、脂質(zhì)和長壽蛋白的分解代謝過程，并維持內(nèi)環(huán)境平衡和生物生長能量需要的幾種途徑的總稱。自噬的類型因物質(zhì)被運送到溶酶體方式的不同而不同。大自噬首先是攜帶特定序列基序的胞質(zhì)蛋白與溶酶體上的受體結(jié)合，將必定要降解的物質(zhì)隔離成雙模結(jié)構(gòu)的自噬體，自噬體來自于各種供體膜，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體或質(zhì)膜，然后與晚期核內(nèi)體融合，最終與溶酶體融合并將降解物質(zhì)送入溶酶體腔后形成單膜的自噬溶酶體，物質(zhì)在其中被溶酶體水解酶降解[5]。由此產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，如氨基酸和脂肪酸，通過轉(zhuǎn)運體循環(huán)回到細(xì)胞質(zhì)中。自噬體和自噬溶酶體的形成是自噬的關(guān)鍵步驟。自噬體的腔是中性的，不含水解酶，而自噬溶酶體的腔是酸性的，含有多種水解酶。上述步驟涉及自噬相關(guān)蛋白分級招募的Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein light chain-3,LC3)多蛋白復(fù)合物的介導(dǎo)。微自噬是通過溶酶體直接吞噬小的細(xì)胞質(zhì)成分介導(dǎo)的分泌小泡與溶酶體融合，并被溶酶體水解酶降解的過程[6]。但這一過程融合的機(jī)制仍不清楚。大自噬(以下簡稱自噬)是自噬在外分泌胰腺和胰腺炎中可被檢查到的最常見的形式。自噬與炎癥性疾病、癌癥和神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[7]。AP的誘發(fā)及其炎癥反應(yīng)可由自噬異常或功能紊亂誘導(dǎo)的胰蛋白酶原激活所致[8]。

自噬正常情況下是一種細(xì)胞存活防御機(jī)制，自噬通量(即自噬空泡的周轉(zhuǎn)，從自噬小體的形成到自噬溶酶體的物質(zhì)降解)是有效的，無空泡積累，此時自噬有助于維持體內(nèi)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。在胰腺炎中，自噬受損主要表現(xiàn)為胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)堆積含不良降解物質(zhì)的自噬空泡，其可被認(rèn)為是實驗小鼠模型和人類AP的早期標(biāo)志。自噬體形成增加和溶酶體降解減少之間的不平衡導(dǎo)致自噬通量受損。自噬溶酶體的積累表明溶酶體降解效率低下。上述發(fā)現(xiàn)均表明自噬通量的恢復(fù)、阻止腺泡細(xì)胞空泡化可降低胰腺炎的嚴(yán)重程度。

1.1 基礎(chǔ)自噬在胰腺腺泡細(xì)胞中的功能基礎(chǔ)自噬對維持胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[9-10]。胰腺腺泡細(xì)胞自噬被激活或氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬損傷被預(yù)防均可緩解胰腺炎的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡[11]。小鼠胰腺外分泌具有合成和轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)的強(qiáng)大功能，并且在饑餓反應(yīng)時相比肝臟、腎臟、心臟和內(nèi)分泌胰腺還具有較高的基礎(chǔ)自噬水平，這些過程需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體、溶酶體系統(tǒng)和酶原顆粒室的協(xié)調(diào)作用[12]。最近的研究表明，專門針對自噬或溶酶體途徑的基因改變可導(dǎo)致胰腺損傷[13]。介導(dǎo)自噬體形成的自噬相關(guān)蛋白5(autophagy-related gene 5，ATG5)或ATG7或溶酶體功能的編碼基因的破壞可導(dǎo)致胰腺自噬障礙或損傷，導(dǎo)致腺泡細(xì)胞嚴(yán)重變性、外分泌胰腺萎縮、纖維化和炎癥[14]。驅(qū)動溶酶體發(fā)揮自噬功能的一個重要膜結(jié)構(gòu)成分是溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosome-associated membrane protein，LAMP)，它可調(diào)節(jié)溶酶體與其他細(xì)胞器(特別是自噬體)的融合、溶酶體蛋白水解活性和吞噬作用。而缺乏LAMP基因或其被敲除的小鼠可發(fā)生自發(fā)性胰腺炎[15]，特別是LAMP-2，該胰腺炎由自噬通量受損引起的腺泡細(xì)胞空泡化開始，產(chǎn)生由溶酶體/自噬功能障礙最終引起的以胰蛋白酶原激活、巨噬細(xì)胞驅(qū)動的炎癥和腺泡細(xì)胞死亡為特征的自發(fā)性胰腺炎。另外，ATG5、ATG7或介導(dǎo)自噬的轉(zhuǎn)錄因子TFEB和TFE3的基因敲除均可通過上述機(jī)制促進(jìn)自發(fā)性胰腺炎的發(fā)生。TFEB介導(dǎo)的溶酶體生物合成受影響可能導(dǎo)致自噬功能不足，從而促進(jìn)胰腺炎發(fā)生[16]。

1.2 線粒體功能障礙和內(nèi)置網(wǎng)應(yīng)激在溶酶體發(fā)生自噬過程中，伴隨重要的細(xì)胞器反應(yīng)是線粒體功能障礙和內(nèi)置網(wǎng)應(yīng)激[17]。當(dāng)胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理和消除錯誤折疊和/或未折疊等毒素蛋白的能力下降，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑被激活，可導(dǎo)致其自身細(xì)胞凋亡[18]。在諸多組織器官中極易受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響的是胰腺。在AP的驅(qū)動因素中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的驅(qū)動作用可被自噬作用阻止。相反，若自噬受損可促進(jìn)胰腺炎的進(jìn)展。表明胰腺中自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體穩(wěn)態(tài)之間存在交叉調(diào)節(jié)。自噬受雷帕霉素機(jī)制靶點和腺苷單磷酸激酶信號的調(diào)控。因此，靶向線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、自噬體及自噬溶酶體細(xì)胞器途徑以恢復(fù)腺泡細(xì)胞有效自噬可作為維持腺泡細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和治療AP的一個重要途徑。

1.3 選擇性和非選擇性自噬自噬有選擇性和非選擇性。營養(yǎng)缺乏引起的自噬是非選擇性；選擇性自噬是通過降解細(xì)胞成分上的特定受體啟動的，p62就是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白受體，作為多聚泛素化蛋白的信號支架和伴侶，它調(diào)節(jié)自噬和氧化應(yīng)激等多種細(xì)胞過程[19-20]。p62通過自噬特異性降解，正常情況下保持在低水平，過度的自噬空泡和p62累積(特別是與LC3-Ⅱ一起)是自噬通量受損的標(biāo)志。LC3是哺乳動物酵母ATG8的同源物，其胞質(zhì)形態(tài)(LC3-Ⅰ)被脂化為LC3-Ⅱ。在正常組織中，選擇性自噬和非選擇性自噬共存，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，選擇性自噬具有抗疾病作用。

1.4 miRNA的調(diào)節(jié)miRNA是一類高度進(jìn)化保守的單鏈核苷酸，其表達(dá)障礙可導(dǎo)致炎癥浸潤，在包括胰腺炎在內(nèi)的多種疾病免疫應(yīng)答的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[21]。此外，鑒于miRNA的穩(wěn)定性和易檢測性特征，其可作為AP患者臨床上潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，對早期診斷AP及其預(yù)后和治療干預(yù)具有較高的靈敏性和特異性[22]。腺泡細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中miRNA的異常可通過調(diào)節(jié)腺泡細(xì)胞的凋亡和壞死、局部和全身炎癥反應(yīng)而促進(jìn)AP的發(fā)生發(fā)展[23]。研究發(fā)現(xiàn)miR-19b在AP中的過度表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)靶向基因的編碼而促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞壞死和凋亡，有助于AP的發(fā)生[24]。另外，miR-375可以通過靶向調(diào)節(jié)ATG7抑制自噬并促進(jìn)AP腺泡細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡[25]。并且ATG7在胰腺腺泡細(xì)胞中的缺失可導(dǎo)致AP腺泡細(xì)胞的凋亡[26]。研究發(fā)現(xiàn)miR-148的直接靶點是IL-6，其表達(dá)上調(diào)可降低IL-6的水平，同時可降低自噬小體和自噬溶酶體的量以改善AP[27]。上述結(jié)果提示miRNA有望成為AP基因治療的候選基因。

2 炎癥反應(yīng)及免疫功能異常

近年來，免疫細(xì)胞及其產(chǎn)物免疫分子受到廣泛關(guān)注，尤其是單核細(xì)胞不同表型的極化和功能狀態(tài)在調(diào)節(jié)AP發(fā)生發(fā)展中起重要作用，如M1單核細(xì)胞通過釋放促炎細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而M2單核細(xì)胞主要產(chǎn)生控制炎癥、防止組織過度破壞及促進(jìn)組織修復(fù)的抗炎分子[28]。單核細(xì)胞被壞死腺泡細(xì)胞釋放的細(xì)胞內(nèi)容物介質(zhì)，即損傷相關(guān)分子模式(danger associated molecular pattern，DAMP)所活化。DAMP通過與免疫細(xì)胞上的不同受體結(jié)合來介導(dǎo)發(fā)揮激活炎癥和刺激免疫反應(yīng)的作用，其對AP的發(fā)生機(jī)制具有促進(jìn)作用。例如，晚期炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白1(high-mobility group box-1，HMGB1)與Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)結(jié)合[29]激活NF-κB通路后，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)水平，釋放細(xì)胞因子、黏附分子和氧自由基[30]，加重胰腺組織炎癥反應(yīng)。循環(huán)中HMGB1水平與AP的嚴(yán)重程度相關(guān)，細(xì)胞外HMGB1增加AP嚴(yán)重程度[31]，而細(xì)胞內(nèi)HMGB1限制炎癥反應(yīng)和組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可通過TLR2和TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號通路誘導(dǎo)M1單核細(xì)胞的極化狀態(tài)，參與炎癥反應(yīng)過程[32]。此外，上述物質(zhì)參與毛細(xì)血管滲漏、腸道缺血、細(xì)菌移位和肺泡損傷，參與AP局部炎癥進(jìn)展到全身性炎癥反應(yīng)的過程。上述過程的持續(xù)作用是AP逐步進(jìn)展的特點，在此期間，機(jī)體免疫系統(tǒng)下調(diào)，腸道細(xì)菌移位加重胰腺周圍組織感染，從而導(dǎo)致敗血癥和多臟器功能衰竭，增加AP患者的死亡率。

AP最早的免疫反應(yīng)發(fā)生于自身腺泡細(xì)胞，其受損后釋放的趨化因子和細(xì)胞因子以及各種黏附分子募集并介導(dǎo)外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)進(jìn)入胰腺損傷部位，活化的PBMCs是全身炎癥和加重AP組織損傷的關(guān)鍵細(xì)胞，在這些趨化因子中，單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP1)促進(jìn)炎性單核細(xì)胞的運輸，巨噬細(xì)胞炎性蛋白2α(macrophage inflammatory protein 2α，MIP2α)和CXC趨化因子配體1(C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1)招募中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞是第一批被招募到胰腺和肺的免疫細(xì)胞[33]?；罨闹行粤＜?xì)胞和PBMCs進(jìn)入全身循環(huán)后又可分泌包括白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素6(IL-1和IL-6)及細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecules-1，ICAM-1)等促炎和趨化因子，攻擊腺泡細(xì)胞，使胰腺和胰外多器官炎癥加重，放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)，早期發(fā)生SIRS或MODS[34]。中性粒細(xì)胞還會產(chǎn)生由顆粒蛋白、DNA和組蛋白組成的中性粒細(xì)胞胞外黏附網(wǎng)[35-36]，使胰腺導(dǎo)管阻塞，激活促炎信號，并提前激活胰蛋白酶原。炎癥反應(yīng)的有效發(fā)生和結(jié)局以及組織穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)依賴于炎癥介質(zhì)招募到胰腺炎癥部位的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他類型免疫細(xì)胞間的相互協(xié)調(diào)作用。因此，抑制免疫細(xì)胞及其免疫分子可以防止胰腺和遠(yuǎn)隔器官的損傷。

2.1 炎癥轉(zhuǎn)錄因子的激活目前研究轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的范圍較廣，它們在炎癥反應(yīng)過程中調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生。腺泡細(xì)胞NF-κB的激活觸發(fā)TNF-α、IL-6、IL-1β、髓過氧化物酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，INOS)和ICAM-1這些與AP相關(guān)促炎介質(zhì)的表達(dá)上調(diào)，同時招募白細(xì)胞到胰腺和遠(yuǎn)隔器官誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程，使胰腺自身和周圍組織損傷和破壞，進(jìn)一步加重AP進(jìn)展[37]。NF-κB還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的功能[38]。其調(diào)節(jié)可影響AP胰腺和腸道損傷的嚴(yán)重程度[39]。NF-κB包含Rel家族成員的同型二聚體和異型二聚體，并被細(xì)胞因子、脂多糖、氧化應(yīng)激和蛋白激酶C的激活劑激活[40]。然而，腹腔巨噬細(xì)胞表面蛋白Tim-3表達(dá)的下調(diào)通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路以介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子釋放來加重胰腺組織損傷[41]。在腺泡細(xì)胞中，NF-κB通路的激活可同時誘導(dǎo)促炎和抗炎信號通路以增加或降低胰腺炎的嚴(yán)重性，這取決于激活該通路的方法，但闡明其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

NF-κB在炎癥開始時被激活，但STAT3的磷酸化和易位發(fā)生在后期，并將局部損傷與多器官衰竭聯(lián)系起來。STAT3介導(dǎo)炎癥通路，并調(diào)節(jié)胰腺炎的發(fā)展過程[42]，其特異性地下調(diào)或失活緩解AP的嚴(yán)重程度[43-44]。而STAT3的線粒體易位可抑制由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬，并且可以有效地保護(hù)線粒體免于被線粒體自噬降解[45]。該通路的抑制劑可以改善胰腺炎及其并發(fā)癥的嚴(yán)重程度[46-47]，因此，抑制STAT3活性可能是緩解AP進(jìn)展的潛在靶點。

2.2 腸道菌群失調(diào)腸黏膜損傷及其隨后釋放的內(nèi)毒素和促炎細(xì)胞因子(如IL-1β和IL-18)可能在重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)導(dǎo)致的多器官功能障礙中起重要作用，甚至是SAP患者潛在的致死原因[48]。SAP發(fā)生急性肺損傷可能與自噬水平降低引起的細(xì)菌易位有關(guān)[49]。有報道稱，SAP大鼠引起的腸黏膜屏障損傷可由高脂飲食引起的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等機(jī)制引起[50]。Wan等[51]研究p38 MAPK抑制劑SB203580對大鼠SAP模型腸道炎癥和腸道菌群失調(diào)的作用時發(fā)現(xiàn)：(1)腸道菌群失調(diào)在SAP的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。(2)胰腺及回腸遠(yuǎn)端水腫和炎性浸潤的SAP模型大鼠血漿和回腸遠(yuǎn)端TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)經(jīng)SB203580治療后降低。(3)SAP組的細(xì)菌多樣性及數(shù)量明顯降低，而SAP+SB203580組的細(xì)菌多樣性高、腸道菌群比例更正常。(4)SB203580通過抑制p38 MAPK信號通路減少腸道炎癥反應(yīng)和微生物菌群失調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，血清中促炎因子的消除可降低ROCK(Rho激酶)mRNA的表達(dá)來改善SAP合并MODS患者的腸黏膜屏障功能障礙[52]。腸道內(nèi)菌群失調(diào)，如大腸桿菌數(shù)量顯著增加與急性壞死性胰腺炎胰腺損傷和腸屏障功能障礙有關(guān)[53]。腸黏膜屏障功能受損后使其通透性增加，細(xì)菌、毒素和炎癥因子可通過滲入黏膜隨腸道淋巴管引流進(jìn)入全身體循環(huán)，進(jìn)而形成膿毒癥，引起胰腺等多臟器損傷。

3 總結(jié)

自噬障礙和持續(xù)炎癥反應(yīng)會促進(jìn)胰腺炎的發(fā)展。腺泡細(xì)胞自噬紊亂與疾病的開始有關(guān)，而AP的嚴(yán)重程度主要取決于炎癥反應(yīng)是否消退或增強(qiáng)?；贏P患者的臨床現(xiàn)實情況，全面了解AP的發(fā)生機(jī)制對早期臨床醫(yī)師規(guī)范、有效治療該病具有重要的指導(dǎo)意義。然而，要完全明確自噬、炎癥反應(yīng)及免疫功能異常在AP的發(fā)生機(jī)制還需進(jìn)行更多的相關(guān)研究。而充分認(rèn)識上述機(jī)制在AP發(fā)病機(jī)制中的作用是針對AP潛在治療靶點和靶點途徑的關(guān)鍵步驟，這對于AP的診斷、臨床嚴(yán)重程度和治療起到積極有效的參考作用，對早期評估病情和預(yù)后發(fā)揮重要的臨床意義，以此為臨床有效治療該病提供現(xiàn)實依據(jù)。