紫檀芪對(duì)2型糖尿病大鼠腎損傷的改善作用

丁潤(rùn)蓉，孫華磊，劉亞萍，張玉晶，李 星，李文杰

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種常見(jiàn)的代謝性疾??；國(guó)際糖尿病聯(lián)盟報(bào)告，截至2019年，全世界有超過(guò)4.63億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2045年將上升到7億[1]。有研究表明[2]糖尿病腎病是一種常見(jiàn)的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的最常見(jiàn)原因，其詳細(xì)機(jī)制至今仍不清楚；目前有研究[3]表明炎癥介質(zhì)與糖尿病腎病的發(fā)展密切相關(guān)。在高糖環(huán)境下，糖脂代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)改變等因素刺激可以激活腎臟炎癥反應(yīng)，使得細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，引起腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎功能喪失[4]。Wu等[5]認(rèn)為抑制炎癥及成纖維細(xì)胞的激活可能是延緩糖尿病腎病進(jìn)程的有效手段。紫檀芪(pterostilbene，PTE)是存在于藍(lán)莓等漿果中的一種天然多酚類(lèi)化合物，具有抗炎、抗糖尿病等作用[6]。張玉晶等[7]發(fā)現(xiàn)PTE可以改善T2DM大鼠肝臟炎癥反應(yīng)，減輕肝損傷，但其對(duì)腎臟損傷的研究比較少見(jiàn)。本研究觀察了PTE對(duì)T2DM大鼠腎損傷的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料4周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK2015-0004)。PTE購(gòu)自上海士豐生物科技有限公司；尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)測(cè)定試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技有限公司。NF-κBp65、TGF-β1多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，α-SMA多克隆抗體購(gòu)自博士德生物工程有限公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、GAPDH多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 T2DM大鼠動(dòng)物模型的建立和分組將60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法選擇其中10只作為正常對(duì)照組，剩余50只喂養(yǎng)高脂高糖飼料。大鼠高脂高糖喂養(yǎng)4周后，按照40 mg/kg的劑量一次性腹腔注射10 g/L鏈脲佐菌素溶液，并在注射后的第3天和第7天測(cè)定大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，2次FBG≥16.7 mmol/L且出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀提示T2DM造模成功。將造模成功后的大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即T2DM對(duì)照組，低、中、高劑量PTE組和羅格列酮組。將PTE和羅格列酮溶于羧甲基纖維素鈉溶液。低、中、高劑量PTE組分別按照20、40、80 mg/kg的劑量灌胃，羅格列酮組按照5 mg/kg的劑量灌胃，正常對(duì)照組和T2DM對(duì)照組大鼠給予等體積的羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，1次/d，連續(xù)6周。6周后，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血備用；處死大鼠后留取腎臟。

1.3 各組大鼠FBG和血清中TG、TC、BUN的測(cè)定全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)FBG、TG和TC的水平；脲酶法測(cè)定血清中BUN的水平，檢測(cè)方法遵循試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)觀察取腎組織，PBS清洗，用40 g/L多聚甲醛溶液固定，然后用石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 各組大鼠腎組織中NF-κBp65、TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)水平的Western blot法檢測(cè)稱(chēng)取腎組織0.1 g，加入組織蛋白抽提試劑提取蛋白，采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，然后采用5×SDS蛋白電泳上樣緩沖液將蛋白變性。每個(gè)泳道上樣量為50 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜；用50 g/L脫脂奶粉液封閉90 min；加一抗(GAPDH、TGF-β1和α-SMA多克隆抗體按1∶5 000稀釋?zhuān)琋F-κBp65多克隆抗體按1∶500稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次，10 min/次；加入二抗(按1∶5 000稀釋)，室溫下孵育2 h，TBST清洗3次，10 min/次。ECL發(fā)光液顯影，掃描結(jié)果后，用Image J軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。應(yīng)用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析比較各組大鼠干預(yù)前后FBG、血脂水平變化，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組大鼠血清BUN、腎組織中NF-κBp65、TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG、血脂水平的變化見(jiàn)表1。由表1可知，T2DM對(duì)照組，低、中、高劑量PTE組大鼠FBG，血清TC、TG水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05)。干預(yù)6周后，低、中、高劑量PTE組以及羅格列酮組大鼠FBG，血清TC、TG水平均較干預(yù)前下降，但其水平仍高于正常對(duì)照組(P<0.05)。與T2DM對(duì)照組相比，低劑量PTE組和羅格列酮組大鼠血清TC、TG水平較低(P<0.05)。

表1 各組大鼠FBG、血脂水平的變化(n=10) mmol/L

2.2 各組大鼠血清中BUN，腎組織中NF-κBp65、TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)的比較見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組相比，T2DM對(duì)照組，低、中、高劑量PTE組以及羅格列酮組血清中BUN值較高(P<0.05)。與T2DM對(duì)照組相比，低、中、高劑量PTE組以及羅格列酮組大鼠血清BUN水平下降(P<0.05)，且高劑量PTE干預(yù)效果最顯著。與正常對(duì)照組相比，T2DM對(duì)照組大鼠NF-κB、TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與T2DM對(duì)照組相比，低、高劑量PTE組和羅格列酮組NF-κB蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；中、高劑量PTE組和羅格列酮組TGF-β1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；低、中、高劑量PTE組和羅格列酮組α-SMA蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。其中低劑量PTE組NF-κB和α-SMA蛋白表達(dá)的干預(yù)效果最顯著，且隨著PTE干預(yù)劑量的增加，TGF-β1蛋白表達(dá)水平逐漸降低。

表2 各組大鼠血清中BUN，腎組織中NF-κBp65、TGF-β1、α-SMA蛋白表達(dá)的比較(n=10)

2.3 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組大鼠腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，系膜基質(zhì)分布正常，無(wú)纖維化(圖1A)。T2DM對(duì)照組大鼠可見(jiàn)部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫或空泡變性，腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維細(xì)胞增生，基底膜彌漫增厚(圖1B)。與T2DM對(duì)照組相比，PTE低、中劑量PTE組腎臟組織系膜細(xì)胞輕度增生，系膜基質(zhì)擴(kuò)張減輕，基底膜增厚改善，腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少(圖1C和D)；高劑量PTE組基底膜增厚明顯改善，且未觀察到明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1E)。羅格列酮組腎組織形態(tài)明顯改善(圖1F)，與正常對(duì)照組較為接近。

A：正常對(duì)照組；B：T2DM對(duì)照組；C：低劑量PTE組；D：中劑量PTE組；E：高劑量PTE組；F：羅格列酮組

3 討論

糖尿病腎病一種嚴(yán)重的腎臟疾病，以腎小球肥大、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腎組織纖維化為病理特征[8]。目前，高脂高糖聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型已被廣泛用于研究早期糖尿病腎臟變化。本研究中，作者采用PTE對(duì)高脂高糖聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠進(jìn)行了為期6周的干預(yù)。結(jié)果表明，T2DM對(duì)照組大鼠FBG水平升高，血清中TG、TC、BUN水平均升高，腎臟有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有纖維化，提示T2DM大鼠腎功能受損。而PTE干預(yù)可以降低T2DM大鼠FBG、血脂以及BUN水平，改善腎臟的組織病理學(xué)變化。

糖脂代謝紊亂在糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用，持續(xù)高糖刺激可激活腎臟炎癥反應(yīng)，而慢性炎癥可導(dǎo)致纖維連接蛋白、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的合成，加速腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，進(jìn)而加重糖尿病腎病[9]。炎癥因子NF-κB是糖尿病腎病發(fā)展中獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄因子，在糖尿病腎病的炎癥和纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。彭艷芳等[11]發(fā)現(xiàn)PTE可以降低NF-κB的水平，減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕博萊霉素導(dǎo)致的大鼠肺纖維化。本研究結(jié)果顯示，T2DM模型組大鼠腎臟有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且腎臟組織NF-κB蛋白表達(dá)水平升高，而經(jīng)PTE干預(yù)后，腎臟組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，NF-κB蛋白表達(dá)水平降低，說(shuō)明PTE可能通過(guò)抑制NF-κB活性來(lái)減輕T2DM大鼠腎臟炎癥。

TGF-β1是公認(rèn)的調(diào)節(jié)腎臟纖維化過(guò)程的關(guān)鍵因子，可以誘導(dǎo)腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生增多，促進(jìn)腎臟纖維化[12-13]。有研究[14]顯示，NF-κB有TGF-β1的結(jié)合位點(diǎn)，活化的NF-κB可以誘導(dǎo)其下游基因TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)程。TGF-β1還可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為活性的肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步導(dǎo)致纖維化標(biāo)志物α-SMA的過(guò)度表達(dá)。研究[15]發(fā)現(xiàn)，抑制TGF-β1信號(hào)通路的表達(dá)可減輕腎臟纖維化反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，T2DM模型組大鼠基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生，腎臟組織中TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)水平升高，而PTE干預(yù)后，T2DM大鼠腎臟病理結(jié)構(gòu)明顯改善，TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)水平降低，與報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTE可減少炎癥因子NF-κBp65的表達(dá)以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如TGF-β1和纖維化標(biāo)志物α-SMA的積累，進(jìn)一步證明了PTE在STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型中具有改善腎功能和對(duì)腎纖維化的治療作用。

綜上所述，PTE可以改善T2DM大鼠腎臟的損傷，減輕炎癥及纖維化反應(yīng)。其具體機(jī)制可能與抑制NF-κB/TGF-β1信號(hào)通路有關(guān)，為治療糖尿病腎病提供了新思路。