TTC在食品菌落總數(shù)中的應(yīng)用研究

李人趙，吳江霞，付剛劍，唐從霞

（江中食療科技有限公司，江西九江 332020）

菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所得1 g或1 mL檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。目前，食品中菌落總數(shù)的測定一般采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）[1]中的平板計(jì)數(shù)瓊脂傾注法，由于食品基質(zhì)的不同，對于某些特殊樣品（如米糊、米粉、奶粉等），此方法存在一定的局限性，如不進(jìn)行優(yōu)化容易造成較大的誤差。例如，在測定米糊的菌落總數(shù)時(shí)，由于糊片基質(zhì)小，吸水膨脹形成糊狀，接種平板時(shí)會帶入大量糊片，傾注培養(yǎng)基后糊片呈白色或米黃色，與菌落形態(tài)、顏色相似或接近，導(dǎo)致樣品與菌落不易區(qū)分，在計(jì)數(shù)時(shí)容易將米糊和菌落混淆，造成計(jì)數(shù)結(jié)果出現(xiàn)偏差，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，部分菌落也會沿著米片生長或生長在米片內(nèi)部，即使借助放大鏡依然很難準(zhǔn)確計(jì)數(shù)[2]，只有經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)員才能準(zhǔn)確無誤的計(jì)數(shù)。

2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyl-2HTetrazolium Chloride，TTC）的氧化態(tài)為無色，而嗜中溫性需氧菌在新陳代謝過程中產(chǎn)生的琥珀脫氫酶可以使無色的TTC被還原成不溶性的紅色三苯甲臜，即在平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基中加入TTC，可以使菌落顯紅色[3]。本文對不同的TTC使用方法和使用濃度對測定菌落總數(shù)準(zhǔn)確度的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

ACB-4A1超凈工作臺，新加坡藝思高科技有限公司（ESCO）生產(chǎn)；YXQ-LS-75G立式壓力蒸汽滅菌器、BPX-272電熱恒溫培養(yǎng)箱和BGZ-146電熱鼓風(fēng)干燥箱，均為上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；PL602E電子天平和ML204T電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)；DK-98-11水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)；Scientz-11L拍擊式均質(zhì)器，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 試劑及溶液

TTC：上海藍(lán)季生物；氯化鈉：西隴科學(xué)股份有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂、無菌均質(zhì)袋：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；2%TTC溶液（稱取2.0 g TTC于100 mL棕色容量瓶中，加入少量蒸餾水使其溶解，再用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置于2～10 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用前按照需要配制成適宜的濃度并滅菌備用）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 判定方法

（1）顏色的判定。通過肉眼觀察培養(yǎng)基及菌落的顏色。

（2）菌落總數(shù)的檢測。參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）執(zhí)行。①稱取25 g樣品置盛有225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制成1∶10的樣品勻液。②用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），在振蕩器上振搖均勻，制成1∶100的樣品勻液。③分別吸取1 mL上述2個(gè)稀釋度的樣品勻液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)培養(yǎng)皿。同時(shí)，分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。④傾注15～20 mL冷卻至46 ℃左右的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使其混合均勻，水平放置待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，于 36 ℃ ±1 ℃條件下培養(yǎng) 48 h±2 h。

（3）結(jié)果判定。①標(biāo)準(zhǔn)值：以未添加TTC溶液的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)值；②偏差度（Z值）：表示結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的偏離程度，以“Z值=（檢測值-標(biāo)準(zhǔn)值）/標(biāo)準(zhǔn)值*100%”計(jì)算；③判定：當(dāng)|Z值|≤5%，表明檢驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值偏差較小，為可接受的偏差；當(dāng)|Z值|＞5%，表明檢驗(yàn)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值出現(xiàn)了偏離，為不可接受的偏差。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）TTC加入方式的確定。配制3瓶100 mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基溶解后，其中1瓶（A號）不加2% TTC溶液，作為對照培養(yǎng)基；1瓶（B號）在滅菌前加入1 mL 2% TTC溶液，混勻；1瓶（C號）在滅菌后加入1 mL已滅菌的2% TTC溶液，混勻。分別觀察并記錄培養(yǎng)基的顏色，同時(shí)取同一份米糊樣品進(jìn)行菌落總數(shù)檢測，觀察并記錄菌落形態(tài)。

（2）TTC溶液使用初步范圍的確定。配制7瓶500 mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基及15 mL 2%TTC溶液分別置于121 ℃高壓滅菌15 min。滅菌結(jié)束，待冷卻至（46±1） ℃時(shí)，分別向7瓶培養(yǎng)基加入經(jīng)121 ℃高壓滅菌的2% TTC溶液0 mL、0.05 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.25 mL、2.50 mL和5.00 mL，搖勻。此時(shí)培養(yǎng)基中TTC的濃度分別為0%、0.000 2%、0.001 0%、0.002 0%、0.005 0%、0.010 0% 和0.020 0%[4]。使用這7瓶培養(yǎng)基分別對10份米糊樣品進(jìn)行菌落總數(shù)檢測。其中以TTC添加濃度為0%的樣品作為對照培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)，觀察、記錄菌落形態(tài)并計(jì)數(shù)偏離度Z值。

（3）TTC溶液適宜使用范圍的進(jìn)一步確定。配制7瓶500 mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，滅菌結(jié)束，待冷卻至（46±1） ℃時(shí)，按比例加入定量已滅菌的TTC溶液，使培養(yǎng)基中TTC的濃度分別為0.002%、0.002 5%、0.003 0%、0.003 5%、0.004 0%、0.004 5%和0.005 0%。使用這7瓶培養(yǎng)基對10份米糊樣品再次進(jìn)行菌落總數(shù)檢測，以1.3.2（2）項(xiàng)下TTC添加濃度為0%的作為對照計(jì)數(shù)，觀察、記錄菌落形態(tài)并計(jì)數(shù)偏離度Z值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同順序加入TTC溶液的效果

經(jīng)過對培養(yǎng)基和菌落形態(tài)顏色效果觀察，滅菌后加入TTC溶液最合適，結(jié)果見表1及圖1。

圖1 不同方式添加TTC的培養(yǎng)基及平板中菌落的顏色

表1 不同方式添加TTC對檢測的影響表

2.2 TTC溶液的使用初步范圍

由圖2可知，經(jīng)過對菌落形態(tài)顏色觀察，當(dāng)TTC溶液濃度低于0.002%時(shí)顯色效果不明顯，菌落呈淺紅色，個(gè)別菌落未染色成功。

圖2 不同TTC濃度的菌落形態(tài)顏色顯示效果

由表2及圖3可知，當(dāng)TTC溶液濃度高于0.005%時(shí)，菌落結(jié)果呈下降趨勢，表明此濃度對菌落有抑菌作用[5]。偏離度|Z|值＞5%，表明該結(jié)果存在偏離，不宜采用。故TTC溶液初步使用范圍宜在0.002%～0.005%。

圖3 TTC濃度與平均菌落總數(shù)關(guān)系趨勢圖

表2 不同濃度TTC（0%～0.020 0%）對菌落總數(shù)的影響表

2.3 進(jìn)一步確定TTC溶液的使用范圍

由表3和圖4可知，當(dāng)TTC濃度高于0.003 5%時(shí)，菌落總數(shù)呈一定的下降趨勢，表明此濃度TTC對菌落總數(shù)有一定的抑菌作用，TTC濃度在0.004 0%～0.005 0%時(shí)，偏離度|Z|值在5.90%～10.40%，偏離度|Z|值＞5%，表明該結(jié)果存在偏離，不宜采用。結(jié)合2.2項(xiàng)下的結(jié)果建議TTC溶液的使用濃度為0.002 0%～0.003 5%

圖4 TTC濃度與平均菌落總數(shù)關(guān)系趨勢圖

表3 不同濃度TTC（0.002 0%～0.005 0%）對菌落總數(shù)的影響表

3 結(jié)論與不足

3.1 結(jié)論

①當(dāng)TTC與培養(yǎng)基混合后再滅菌，不僅菌落會被染色，培養(yǎng)基也會被染色，從而影響菌落計(jì)數(shù)。因此，在實(shí)際檢驗(yàn)時(shí)，TTC應(yīng)與培養(yǎng)基分開滅菌，在使用前按比例添加至46 ℃左右的培養(yǎng)基中，混勻后使用。②TTC濃度＜0.002%時(shí)，菌落不顯色或顯淺粉色，在菌落計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)仍有部分菌落因未顯色而容易忽略，導(dǎo)致結(jié)果偏低；TTC濃度在0.002 0%～0.003 5%時(shí)，菌落顯明顯的紅色，可以很快點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，同時(shí)結(jié)果與未添加TTC的結(jié)果對照偏離值|Z|≤5%，差異很小，符合要求；當(dāng)TTC濃度＞0.003 5%時(shí)，菌落總數(shù)與濃度呈反比趨勢，即TTC開始對菌落產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)結(jié)果與未添加TTC的結(jié)果對照偏離值|Z|＞5%，差異相對明顯，結(jié)果偏離。故在食品菌落總數(shù)檢測中TTC溶液的最適宜添加濃度為0.002 0%～0.003 5%。③本研究為麥片類、米粉（米糊）類等食品的菌落總數(shù)檢測提供了科學(xué)可靠的優(yōu)化方案，操作流程簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，可推廣性強(qiáng)。

3.2 不足

①自身顏色深的產(chǎn)品，如果粒橙、胡蘿卜汁等不宜添加TTC，容易導(dǎo)致菌落顯色與產(chǎn)品自身顏色混淆。②本文僅通過多次檢測數(shù)據(jù)對TTC溶液的抑菌濃度進(jìn)行判斷分析，未經(jīng)過菌種添加回收等方式研究計(jì)算高濃度TTC溶液對菌落總數(shù)的具體抑菌效果。