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    影響食品中氯霉素檢測結(jié)果的因素及應(yīng)對措施

    2022-02-22 17:28:07廖文通
    食品安全導(dǎo)刊 2022年30期
    關(guān)鍵詞:溫育氯霉素微孔

    廖文通

    (廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣東廣州 510330)

    氯霉素為呈白色或微黃色的針狀、片狀晶體,無臭,味苦,熔點(diǎn)為149~153 ℃;易溶于乙醇、丙酮和乙酸乙酯,微溶于水、乙醚和氯仿,不溶于苯和石油醚。在室溫下pH值為2~9的水溶液中,氯霉素能穩(wěn)定存在24 h以上,蒸餾水煮沸5 h也不會(huì)影響它的活性。氯霉素作為一種廣譜抗生素,過去在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用,但是它本身的毒副作用較強(qiáng),殘留在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)食物鏈傳給人類,會(huì)危害人體健康。《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào))中明確規(guī)定:禁止氯霉素及其鹽、酯在所有食品動(dòng)物中使用;《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650—2019)中規(guī)定:氯霉素在所有動(dòng)物源性食品中不得檢出[1]。目前,食品中氯霉素的檢測技術(shù)方法較多,且人員、環(huán)境、技術(shù)操作等因素均會(huì)影響檢測結(jié)果,因此檢驗(yàn)人員必須加強(qiáng)質(zhì)量控制。

    1 食品中氯霉素的來源和危害

    1.1 氯霉素的來源

    近年來的監(jiān)督檢查中發(fā)現(xiàn),在部分動(dòng)物性食品如雞、鴨、豬、牛和魚肉中檢測出氯霉素。這些氯霉素主要來源于3個(gè)方面:①為防止動(dòng)物生病,促進(jìn)動(dòng)物生長,縮短養(yǎng)殖周期,動(dòng)物養(yǎng)殖過程中在飼料內(nèi)違規(guī)添加氯霉素;②水產(chǎn)品運(yùn)輸過程中保存活力,尤其是海鮮產(chǎn)品長途運(yùn)輸中,在水中加入氯霉素延長海鮮的存活時(shí)間,降低死亡率,從而獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益;③飼養(yǎng)過程中的水質(zhì)出現(xiàn)外源性污染,這種情況比較少見。

    1.2 氯霉素的危害

    氯霉素本身既是一種抗生素,也是一種殺菌劑,對革蘭陽性菌和陰性菌具有較強(qiáng)的抑制作用,對大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌以及肺炎球菌等引起的感染有較高的治療效果。作為藥物服用時(shí),氯霉素口服后經(jīng)胃腸吸收,每6 h服用0.5 g,血藥濃度維持在 4 μg·mL-1以上;口服 15 mg·kg-1后,2 ~ 3 h達(dá)到血藥濃度峰值為10~20 μg·mL-1;靜脈用藥時(shí),同等劑量下的血藥濃度峰值稍高于該數(shù)值。

    但是,食品中殘留的氯霉素,經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體后會(huì)帶來嚴(yán)重危害。①長期攝入微量氯霉素,人體會(huì)對部分細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,造成體內(nèi)正常菌群失調(diào)。造成這一情況的原因是細(xì)菌在乙酰轉(zhuǎn)移酶的介導(dǎo)作用下,導(dǎo)致氯霉素失活以及部分細(xì)菌改變了膜的通透性,導(dǎo)致氯霉素不能進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)。②氯霉素直接攻擊血液系統(tǒng),會(huì)提高再生障礙性貧血、白血病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),通過血象檢查可以進(jìn)行監(jiān)測評估。③新生兒和嬰幼兒可能發(fā)生灰色綜合征,表現(xiàn)為腹脹、嘔吐、紫紺、呼吸淺表和循環(huán)障礙等癥狀[2]。由于新生兒和嬰幼兒的肝臟發(fā)育不全,腎臟排泄能力較差,發(fā)生灰色綜合征的死亡率約為40%。

    2 酶聯(lián)免疫吸附法在食品氯霉素檢測中的應(yīng)用

    氯霉素?zé)o色無味,消費(fèi)者在購買、食用過程中肉眼無法鑒別,因此必須采用專業(yè)的檢測技術(shù)手段檢測食品中的氯霉素殘留。目前常用方法有微生物法、免疫法、色譜法以及光譜法等,本文僅對酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)在食品氯霉素檢測中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

    2.1 反應(yīng)原理

    ELISA法的檢測原理是利用抗原與抗體的特異性免疫化學(xué)反應(yīng),即酶標(biāo)記物與樣品中的氯霉素、微孔中的抗體進(jìn)行競爭反應(yīng)[3]。反應(yīng)過程中,若樣品中的氯霉素含量高,競爭反應(yīng)的酶標(biāo)記物越多,微孔中抗體與酶標(biāo)記物的結(jié)合減少,顯色后氯霉素含量與樣品吸光度值呈反比,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出定量結(jié)果。

    2.2 儀器試劑

    ELISA法檢測食品中的氯霉素,需要的儀器包括酶標(biāo)儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、勻漿器、振蕩器、冷凍離心機(jī)、微量移液器、電子天平和氮?dú)獯蹈裳b置等。使用的試劑均達(dá)到分析純標(biāo)準(zhǔn),主要有乙酸乙酯、乙腈、正己烷、鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液和氯霉素ELISA試劑盒等。

    2.3 操作步驟

    樣品制備完成后,ELISA法操作步驟如下。①在不同微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入完成前處理的樣品溶液。②在每一個(gè)微孔中加入酶標(biāo)記物。③溶液與酶標(biāo)記物充分混合后,置于室溫下避光靜置溫育。④去除微孔中的反應(yīng)液,加入洗液洗滌,重復(fù)進(jìn)行3次,并使用吸水紙拍干。⑤在微孔中加入底物溶液,充分混合,置于室溫下避光靜置溫育。⑥在微孔中加入反應(yīng)終止液。⑦使用酶標(biāo)儀判定波長為450 nm的數(shù)據(jù)。⑧結(jié)果判定。計(jì)算樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值(B)與零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值(B0)的比值;以B/B0值為縱坐標(biāo),以標(biāo)樣濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)半對數(shù)曲線;根據(jù)樣品的B/B0值,從曲線上讀出對應(yīng)的濃度,乘以稀釋倍數(shù)即可。

    2.4 技術(shù)優(yōu)勢

    ELISA法檢測食品中的氯霉素,其技術(shù)優(yōu)勢包括:①檢測范圍廣,可對雞鴨、魚蝦蟹、牛奶、血清、肌肉、飼料與蜂蜜等進(jìn)行檢測;②檢測效率高,樣品預(yù)處理簡單,不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備,檢測數(shù)十個(gè)、上百個(gè)樣品僅需幾個(gè)小時(shí);③檢測精度和靈敏度高,回收率在80%~120%。區(qū)兌鵬等[4]采用酶聯(lián)免疫法快速檢測水產(chǎn)品中的氯霉素、氟苯尼考、硝基呋喃類代謝物,其靈敏度高、快速簡便,適用于水產(chǎn)品的快速批量檢測。劉姚等[5]則采用直接競爭ELISA法檢測蜂蜜中的氯霉素殘留,結(jié)果檢出限為0.15 ng·g-1,定量限為0.33 ng·g-1,回收率在97.58%~100.94%,批內(nèi)和批間變異系數(shù)小于11%。

    3 食品中氯霉素檢測結(jié)果的影響因素及應(yīng)對措施

    ELISA法檢測水產(chǎn)品中的氯霉素具有操作簡單、靈敏度高、可批量處理樣品等優(yōu)點(diǎn),被列為我國的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。但在實(shí)際檢測中,存在假陽性、回收率不穩(wěn)定等問題,直接影響檢測結(jié)果的可靠性?;诖?,從每一個(gè)操作環(huán)節(jié)入手分析影響檢測結(jié)果的因素,并提出有效應(yīng)對措施。

    3.1 采樣保存

    檢測水產(chǎn)品中的氯霉素,產(chǎn)品對象主要是魚類和蝦類,如草魚、鯉魚、南美白對蝦等。魚蝦樣品采集后,送檢過程中的溫度控制在0~5 ℃,保存溫度為-18 ℃。制取樣品時(shí),先去皮、去殼,再取肌肉組織,最后經(jīng)均質(zhì)器均質(zhì)處理,以上這些操作環(huán)節(jié),均可能受到污染,進(jìn)而影響最終的檢測結(jié)果。對此,應(yīng)對措施如下。①魚蝦樣品采集時(shí),要選擇新鮮的對象,因?yàn)榘l(fā)生腐爛或變質(zhì)的對象有病原菌生長,會(huì)分解抗原抗體的蛋白,對酶標(biāo)記物產(chǎn)生干擾。②制取樣品時(shí),不能反復(fù)凍融,而是一次性規(guī)范操作完成。反復(fù)凍融過程中,會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),影響抗原與抗體結(jié)合。

    3.2 試劑選用

    試劑類型的選擇、試劑盒運(yùn)輸保存方法、試劑的使用過程,也會(huì)影響最終檢測結(jié)果。對此,應(yīng)對措施如下。①優(yōu)選試劑,最好選擇同一廠家的配套試劑,確保試劑滿足檢測試驗(yàn)要求,且處于有效期內(nèi)。②試劑盒在運(yùn)輸過程中,放在有冰袋的保溫盒內(nèi),縮短運(yùn)輸時(shí)間;保存時(shí)溫度控制在4~8 ℃。一般情況下,按照說明書中的要求進(jìn)行保存即可,防止高溫導(dǎo)致蛋白變性或活性降低。③試劑盒使用時(shí),從冰箱內(nèi)取出先在室溫下靜置30 min,并且充分搖勻。這是因?yàn)樵噭┖型蝗恢糜谑覝叵?,可能形成水化層,影響溫育時(shí)間,出現(xiàn)假陰性結(jié)果。④制備試劑時(shí),在空管內(nèi)先加入稀釋液,再加入稀釋物,并且充分混勻。

    3.3 加樣

    加樣操作中,加樣量不精確、加樣速度過快,會(huì)影響最終的檢測結(jié)果。對此,應(yīng)對措施如下。①向微孔加入試劑或樣品提取液時(shí),使用移液器操作,對移液器定期校正,確保精準(zhǔn)度;一個(gè)樣品使用一個(gè)移液頭,避免發(fā)生交叉污染。②加樣時(shí)控制好速度,液體在微孔下方1/3處放注,加在孔壁上部會(huì)影響吸附效果;不能產(chǎn)生氣泡,會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)誤差。③樣品數(shù)量較多時(shí)進(jìn)行分批操作,盡量縮短整個(gè)檢測用時(shí),避免引起誤差。

    3.4 溫育

    溫育是ELISA法檢測過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié),將微孔板置于恒溫箱中或進(jìn)行水浴處理,該環(huán)節(jié)看似簡單,實(shí)際上很容易出現(xiàn)問題。從ELISA法的原理看,抗原與抗體在固相上結(jié)合反應(yīng),必須有一定的反應(yīng)條件和時(shí)間。溫育需要的時(shí)間長短和溫度高低是反比關(guān)系,隨著溫度增高,需要的時(shí)間縮短[6]。但是,溫度升高可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,抗原與抗體反應(yīng)結(jié)合物減少,會(huì)降低試驗(yàn)敏感性;時(shí)間縮短對弱陽性樣本不夠友好,由于分子含量低,反應(yīng)不完全易出現(xiàn)假陰性。對此,應(yīng)對措施如下。①根據(jù)試劑盒說明書,確定溫育時(shí)間和溫度,常見的溫度包括2~8 ℃、室溫、37 ℃和43 ℃;如果說明書中給出2個(gè)溫度,試驗(yàn)時(shí)選擇較低的溫度,適當(dāng)延長溫育時(shí)間,確保抗原與抗體充分反應(yīng)。②將微孔板置于恒溫箱中或進(jìn)行水浴處理,從室溫升高至目標(biāo)溫度需要一段時(shí)間,尤其是室溫較低的情況下;不考慮這段時(shí)間,實(shí)際溫育時(shí)間不夠,弱陽性樣本可能檢測不出來。③“邊緣效應(yīng)”是使用96孔板時(shí),外圍孔的顯色較深、中心孔的顯色較淺;溫育時(shí)盡量采用水浴法,可以排除這一效應(yīng),提高測定的重復(fù)性。

    3.5 洗滌

    洗滌是將反應(yīng)液中未與抗原抗體結(jié)合的物質(zhì)、干擾性物質(zhì)排除的過程,雖不是反應(yīng)步驟,但也會(huì)影響最終檢測結(jié)果。采用ELISA法,一般分為人工洗滌、洗板機(jī)洗滌兩種方式,應(yīng)對措施如下。①人工洗滌時(shí),不同微孔中的液體可能交叉,使用吸水紙拍干時(shí)應(yīng)垂直,防止發(fā)生交叉污染。②洗板機(jī)洗滌時(shí),洗液量不足、洗板針堵塞是常見問題,應(yīng)經(jīng)常檢查洗液量,及時(shí)補(bǔ)充,觀察沖洗頭是否通暢;洗板后的液體殘留及時(shí)處理,以提高洗滌效果。

    3.6 顯色

    酶作為一種催化劑,和底物結(jié)合后會(huì)發(fā)生反應(yīng)。酶與底物的催化反應(yīng)需要一定時(shí)間,而且受到反應(yīng)溫度的影響,一般來說溫度越高,反應(yīng)需要的時(shí)間越短。為避免對檢測結(jié)果造成影響,檢驗(yàn)人員應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,控制好反應(yīng)時(shí)間和溫度。顯色完成后,及時(shí)加入終止液,防止顯色變?nèi)跎踔料恕?/p>

    3.7 比色

    比色使用酶標(biāo)儀完成,其原理為酶與底物一一對應(yīng),兩者反應(yīng)后生成不同的顯色物,它們的有效吸收波長不同[7]。例如,使用HPR催化TMB,生成的顯色物有效吸收波長是450 nm。酶標(biāo)儀對微孔的測定值,決定了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,測定前使用無塵紙擦除酶標(biāo)板上的水汽,不要影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。

    3.8 結(jié)果計(jì)算

    氯霉素的殘留檢測結(jié)果,以明確的定量數(shù)值進(jìn)行表示,計(jì)算過程與相對吸光值、稀釋倍數(shù)有關(guān),而且標(biāo)準(zhǔn)半對數(shù)曲線的繪制有一定難度,這些因素也會(huì)影響檢測結(jié)果。對此,應(yīng)對措施如下。①嚴(yán)格按照試劑盒說明書中的要求進(jìn)行計(jì)算,一人計(jì)算,另一人核對,保留所有原始數(shù)據(jù)。②為避免其他因素的干擾,還要做好室內(nèi)質(zhì)控工作,包括儀器設(shè)備的校正、環(huán)境(溫度、濕度)檢測、測試流程的控制等。

    4 結(jié)語

    綜上所述,食品安全關(guān)系到人們的健康,落實(shí)食品安全檢測工作,提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,是從業(yè)人員關(guān)注的要點(diǎn)。本文以ELISA法檢測食品中的氯霉素為核心,介紹了技術(shù)原理和優(yōu)勢,從各個(gè)操作環(huán)節(jié)分析了影響因素和應(yīng)對措施,希望為實(shí)際檢測工作提供參考。食品安全質(zhì)量檢測不僅是社會(huì)關(guān)注的一個(gè)要點(diǎn),也是保證飲食安全健康的一個(gè)重要手段。相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)和檢驗(yàn)人員只有認(rèn)識(shí)到這一工作的重要性,不斷學(xué)習(xí)新知識(shí)、新技術(shù),提升職業(yè)技能和綜合素質(zhì),才能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,為食品安全監(jiān)督管理提供數(shù)據(jù)支持。

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