RRS滅活疫苗免疫效力探討

郭海兵，曹海濤，耿建新，王科文

[碩騰（上海）企業(yè)管理有限公司，上海 長寧 200050]

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的傳染性疾病，俗稱“藍(lán)耳病”，1987年在美國暴發(fā)后至今，已經(jīng)成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)最重要的疾病之一。我國作為世界上最大的養(yǎng)豬和豬肉生產(chǎn)國，受PRRS的影響尤為嚴(yán)重。雖然，養(yǎng)豬生產(chǎn)者、獸醫(yī)和相關(guān)科學(xué)家經(jīng)過多年與該病斗爭，通過各種途徑控制和凈化該病取得了很大進(jìn)展，但仍未能得到理想控制。疫苗免疫是防控PRRSV的重要措施，但是一直以來飽受爭議。滅活苗在臨床上更安全，且不會發(fā)生散毒和毒力返強(qiáng)，更便于儲存和運(yùn)輸，但是其臨床保護(hù)效率較低、需要多次注射以及副反應(yīng)大等因素，不能有效控制PRRSV的發(fā)生和流行（Zuckermann等，2007）[1]。減毒活疫苗（PRRSV MLV）具有更好的免疫效果，在全球得到廣泛應(yīng)用。但是，PRRSV MLV對于同源毒株的保護(hù)效果較好，對異源毒株提供的交叉保護(hù)性較差（Zhao等，2015）[2]。近年來由于PRRSV基因高度變異和重組演化的特性，使得豬場PRRSV毒株越來越多樣化，PRRSV MLV防控效果不理想，國內(nèi)豬場又開始嘗試PRRS滅活疫苗免疫。本文主要根據(jù)滅活疫苗的免疫機(jī)理、效力評價(jià)指標(biāo)以及文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)來探討PRRS滅活疫苗免疫的效力，希望為豬場科學(xué)選擇和使用PRRS疫苗提供有力依據(jù)。

1 PRRS滅活疫苗免疫效力評價(jià)

目前評價(jià)PRRS疫苗效力主要依靠免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，輔助的評價(jià)試驗(yàn)包括抗體和細(xì)胞因子評價(jià)試驗(yàn)（吳佳俊等，2010）[3]。中和抗體曾被認(rèn)為是評價(jià)PRRS疫苗免疫效果的重要指標(biāo)，但是這方面的報(bào)道存在不同的結(jié)論和觀點(diǎn)，有學(xué)者報(bào)道它能保護(hù)豬抵御PRRSV的攻擊，也有學(xué)者對中和抗體的作用提出質(zhì)疑（吳佳俊等，2010）[3]。Zuckermann等（2007）[1]的試驗(yàn)結(jié)果表明滅活疫苗（Progressis?）可以刺激豬體產(chǎn)生較高水平的中和抗體，卻不能保護(hù)豬免受PRRSV的攻擊；Nilubol等（2004）[4]發(fā)現(xiàn)陽性豬接種滅活疫苗（PRRomiSe?）后產(chǎn)生較高水平的中和抗體，但不能抵御PRRS強(qiáng)毒株的攻擊。Lopez等（2007）[5]研究表明仔豬中和抗體滴度達(dá)到1∶32才能完全保護(hù)，免于PRRSV感染。目前人們逐步把目光轉(zhuǎn)移到IFN-γ（γ干擾素）和細(xì)胞因子，但它們之間的相關(guān)性仍不可靠，認(rèn)為IFN-γ的升高很可能是受免疫佐劑的影響，屬于非特異性免疫（Nilubol等，2004）[4]。

PRRSV的感染可分為兩個(gè)階段，即早期感染期和持續(xù)性感染期。病毒要完全被清除需要150 d或更長的時(shí)間。病毒感染7～9 d后，機(jī)體內(nèi)可檢測到高水平的特異性抗體，但這些抗體不具有中和活性；中和抗體要在病毒感染4周左右才能產(chǎn)生，且效價(jià)較低。由于中和抗體產(chǎn)生較晚且不規(guī)則，因此在PRRSV的保護(hù)性免疫中沒有發(fā)揮太大的作用。PRRSV持續(xù)性感染過程中，扁桃體等組織中存在較高滴度的病毒，而此時(shí)血清中有較高水平的中和抗體，因此認(rèn)為中和抗體清除病毒的能力有限（李琳等，2020）[6]。

PRRSV GP5蛋白上N-糖基化作用對病毒的正確組裝、靶向作用及生物學(xué)活性均起著重要作用。PRRSV GP5蛋白上的糖基化在逃避機(jī)體免疫或降低機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體方面發(fā)揮著重要作用。病毒主要的中和作用決定子位于GP5蛋白上的N端外功能區(qū)，而這個(gè)蛋白上的一些特性，如“誘騙”表位和異質(zhì)的糖基化作用隱藏了關(guān)鍵性中和作用位點(diǎn)，從而阻礙或降低了機(jī)體對病毒GP5蛋白上中和表位的體液免疫反應(yīng)。這種N端聚糖遮蔽中和作用的特點(diǎn)在同屬的LDV（乳酸脫氫酶病毒）上也被觀察到，被認(rèn)為是病毒免疫逃避及形成持續(xù)性感染的主要機(jī)制之一（李琳等，2020）[6]。

綜上所述，由于PRRSV本身的特性，其感染或免疫之后中和抗體滴度一般不高，中和抗體作用有限。PRRS滅活疫苗產(chǎn)生的免疫主要為體液免疫，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力低，導(dǎo)致免疫效果不理想不能有效清除感染豬體內(nèi)的病毒，常導(dǎo)致免疫失敗。

2 PRRS滅活疫苗對不同豬群的免疫效力

2.1 PRRS滅活疫苗對母豬的免疫效力

Karniychuk等（2012）[1]使用PRRSV 07V63毒株制備滅活疫苗在后備母豬懷孕期27、55和83 d免疫3次，在懷孕期90 d時(shí)，試驗(yàn)組和對照組的后備母豬使用PRRSV 07V63毒株通過鼻內(nèi)接種，接種后20 d安樂死所有后備母豬并采樣。檢測了疫苗免疫后和攻毒后血清中和抗體（圖1）以及攻毒后血清PRRSV病毒載量（圖2）。結(jié)果顯示：試驗(yàn)組和對照組在攻毒前中和抗體滴度都很低，攻毒后試驗(yàn)組有所升高，但是對照組沒有變化。對照組和試驗(yàn)組病毒載量差異不明顯。結(jié)果還顯示：試驗(yàn)組胚胎木乃伊比例8%，對照組15%；胚胎著床位置有嚴(yán)重顯微病理損傷的比例試驗(yàn)組為19%，對照組為45%（P＜0.05）；試驗(yàn)組胎兒57% PRRSV陽性，對照組75% PRRSV陽性。上述試驗(yàn)結(jié)果顯示，PRRSV 07V63毒株制備滅活疫苗在后備母豬的作用有限。雖然在一定程度上比未免疫對照組要好，但是也不能阻止PRRSV感染胚胎。

圖1 疫苗免疫后和攻毒后試驗(yàn)組和對照組各后備母豬血清中和抗體

圖2 攻毒后試驗(yàn)組和對照組各后備母豬血清中PRRSV滴度

Andrew等（2021）[8]用基因2型PRRSV MLV免疫后備母豬，然后用兩個(gè)不同公司生產(chǎn)的PRRSV 1-7-4滅活疫苗分別加強(qiáng)免疫4次。試驗(yàn)分組：試驗(yàn)組1（免疫M(jìn)LV），試驗(yàn)組2（免疫M(jìn)LV+4次滅活疫苗1），試驗(yàn)組3（免疫M(jìn)LV+4次滅活疫苗2）。后備母豬分娩的仔豬在2周齡時(shí)用PRRSV 1-7-4毒株攻毒，攻毒后4周安樂死并采樣檢測。中和抗體（NA）滴度結(jié)果顯示：試驗(yàn)組1沒有針對同源毒株P(guān)RRSV 1-7-4的中和抗體，試驗(yàn)組3中和抗體滴度達(dá)到1∶16，試驗(yàn)組2達(dá)到1∶128（圖3A）；而且母源血清中和抗體可以傳遞給其分娩的仔豬（圖3B），不同組之間差異極顯著（P＜0.000 1）（圖3C）。仔豬攻毒后病毒血癥結(jié)果：雖然每組都有病毒血癥，但是試驗(yàn)組2比試驗(yàn)組3和試驗(yàn)組1都低，差異極顯著（P＜0.01）（圖4A）。攻毒后4周的增重結(jié)果顯示試驗(yàn)組2最好（圖4B）。肺臟大體病變和間質(zhì)肺炎組織學(xué)評分試驗(yàn)組2最好（圖4C、D）。上述試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫PRRSV MLV后使用滅活疫苗加強(qiáng)免疫可以促進(jìn)免疫反應(yīng)，提高中和抗體滴度，而且母源中和抗體可以傳遞給后代仔豬，對于同源毒株的攻毒可以提供部分保護(hù)，保護(hù)不完全，試驗(yàn)組感染后4周都還有病毒血癥，而且肺臟大體病變和顯微病變都存在，但是，也可以看出來不同廠家生產(chǎn)的同一毒株的滅活疫苗效果還是有差異，滅活疫苗1效果要優(yōu)于滅活疫苗2。

圖3 自家滅活疫苗加強(qiáng)免疫可以誘導(dǎo)同源毒株的中和抗體并傳遞給仔豬

圖4 母豬接種滅活疫苗可提高2周齡仔豬對PRRSV-2的免疫力：攻毒后不同周齡的病毒血癥（A）和增重（B）；肺臟大體病變（C）以及間質(zhì)性肺炎組織學(xué)評分（D）

綜上所述，PRRS滅活疫苗免疫母豬，如果是PRRSV陰性豬則中和抗體滴度一般較低，如果是感染過PRRSV或者免疫過PRRSV MLV則中和抗體滴度可能會明顯提升。免疫滅活疫苗的母豬在受到PRRSV攻擊的時(shí)候繁殖失敗一樣會比較明顯，母源中和抗體傳遞給后代仔豬只能提供部分保護(hù)，病毒血癥持續(xù)時(shí)間較長，組織發(fā)生病變，不能有效預(yù)防PRRSV感染。

2.2 PRRSV滅活疫苗對仔豬或生長肥育豬的免疫效力

Zuckermann等（2007）[1]使用商品化的弱毒疫苗Pyrsvac-183和滅活疫苗Progressis（佐劑為KV/ADJ）分別免疫5月齡豬，免疫28 d后用105.0TCID50PRRSV（Lelystad）攻毒，具體分組和采樣見表1。結(jié)果顯示：攻毒后4 d組2和組3（對照組）均有明顯的病毒血癥，差異不顯著，但是組1沒有病毒血癥（圖5）。解剖時(shí)肺臟和扁桃體PCR檢測PRRSV結(jié)果：組2的肺臟90%陽性，組1的肺臟20%陽性，而且病毒載量比組2低，差異顯著（P＜0.05）；組1的扁桃體60%陽性，組2的扁桃體100%陽性；總體上組2和組3載毒量差異不顯著（圖6）。血清中和抗體結(jié)果：組1免疫后28 d沒有明顯的中和抗體，而且攻毒后也沒有喚醒免疫記憶反應(yīng)產(chǎn)生明顯的中和抗體；組2疫苗免疫后產(chǎn)生了微弱的中和抗體，但是攻毒后喚起了免疫記憶反應(yīng)，中和抗體明顯升高，和組1相比還是較高，差異顯著（P＜0.05）（圖7）。檢測外周血單核細(xì)胞（PBMC）中IFN-γ分泌細(xì)胞（IFN-γ-SC），結(jié)果顯示：組1在28 d攻毒后IFN-γ-SC快速上升，7 d后繼續(xù)明顯升高，42 d開始衰減，而且有PRRSV刺激和沒有刺激組差異顯著，沒有刺激組是非特異性細(xì)胞反應(yīng)；組3一直是沒有明顯的IFN-γ-SC上升；組2免疫后21 d IFN-γ-SC快速上升，而且PRRSV刺激組和沒有刺激組都快速上升，說明組2免疫產(chǎn)生的細(xì)胞免疫是非特異性的反應(yīng)（圖8）。上述試驗(yàn)結(jié)果表明滅活疫苗（Progressis）預(yù)防PRRSV（Lelystad）感染效果較差，優(yōu)先選擇MLV疫苗。

表1 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

圖5 各組血清病毒載量

圖6 各組肺臟和扁桃體病毒載量

圖7 各組血清中和抗體滴度（SVN）

圖8 各組外周血單核細(xì)胞中IFN-γ-SC數(shù)量

Nilubol等（2004）[4]通過試驗(yàn)驗(yàn)證商品化的滅活疫苗（PRRomiSe?, Intervet, USA）在處理之前PRRSV感染豬的排毒影響，具體分組：組I（n=5）不攻毒的對照組，組Ⅱ（n=5）滅活疫苗對照組，組Ⅲ（n=20）攻毒對照組，組Ⅳ（n=20）攻毒+14、28 d滅活疫苗免疫兩次，攻毒的組都是在0 d鼻內(nèi)接種1 mL PRRSV VR-2385 105.4TCID50/mL。結(jié)果顯示：病毒血癥滴度和持續(xù)時(shí)間組Ⅳ和組Ⅲ無差異；所有攻毒豬只到21 d都可以分離到病毒；尸體剖檢時(shí)，組Ⅲ扁桃體8/18可以分離到病毒，組Ⅳ扁桃體6/15可以分離到病毒，但是PCR檢測PRRSV RNA，組Ⅲ和組Ⅳ所有豬的扁桃體都是陽性。中和抗體結(jié)果：組Ⅰ和組Ⅱ整個(gè)試驗(yàn)階段都沒有中和抗體；組Ⅲ和組Ⅳ在攻毒后28 d中和抗體達(dá)到較高水平，但是差異不顯著，在42 d差異顯著（P＜0.05）（圖9）。該試驗(yàn)表明仔豬感染PRRSV之后免疫滅活疫苗（PRRomiSe?, Intervet, USA），雖然可以誘導(dǎo)更好的體液免疫水平，但是沒有縮短病毒血癥和組織排毒時(shí)間，對于防控PRRSV感染沒有起到相應(yīng)的作用。

圖9 各組對PRRSV VR-2385中和抗體平均值

蔡學(xué)輝等（2009）[9]分別采用PRRSV CH-1R致弱疫苗株和變異毒株滅活疫苗免疫40～45日齡仔豬，免疫接種后4周，用HP-PRRSV HuN-4變異株強(qiáng)毒攻毒，攻毒后21 d剖檢，取主要器官作病理組織學(xué)觀察和病毒抗原定位。結(jié)果顯示，變異毒株滅活疫苗免疫攻毒后導(dǎo)致的病理變化和病毒抗原分布程度均明顯高于CH-1R弱毒疫苗免疫組（表2）。該研究結(jié)果表明，CH-1R弱毒疫苗對HuN-4強(qiáng)毒免疫保護(hù)效果好于變異毒株滅活疫苗。

表2 PRRSV抗原免疫組化檢測結(jié)果

李福泉等（2021）[10]對由ISA201VG和ISA70VG佐劑分別制備的2種NADC30-PRRSV SY株滅活疫苗的免疫效果進(jìn)行比較研究。選用35日齡PRRSV抗體和抗原均為陰性的健康仔豬15頭，隨機(jī)分為3組：試驗(yàn)組1（ISA201VG免疫組）、試驗(yàn)組2（ISA70VG免疫組）和對照組（未免疫攻毒組）。試驗(yàn)組首免107.0TCID50/頭，間隔21 d后以相同劑量進(jìn)行二次免疫，采用ELISA法檢測PRRSV血清抗體，結(jié)果顯示：免疫后第35天，試驗(yàn)組2的5頭豬PRRSV抗體轉(zhuǎn)陽率達(dá)100%，試驗(yàn)組1的5頭豬PRRSV抗體轉(zhuǎn)陽率達(dá)40%（圖10）。二免后14 d采用NADC30-PRRSV SY株攻擊試驗(yàn)豬，攻毒劑量為1×105.0TCID50/mL，檢測各組豬體溫變化，結(jié)果顯示：試驗(yàn)組2從攻毒后第8天起體溫超過40 ℃，持續(xù)6 d；試驗(yàn)組1的5頭豬只有1頭體溫超過40 ℃；對照組5頭豬攻毒后第11～13天體溫升至40 ℃持續(xù)3 d（圖11）。各組豬增重檢測顯示：試驗(yàn)組2與對照組相比較，體重呈現(xiàn)負(fù)增長且體重減少均在5%以上，而試驗(yàn)組1與對照組相比較，體重呈現(xiàn)正增長且增長均在7%以上（圖12）。對PRRSV感染后兩個(gè)試驗(yàn)組肺組織病理觀察均可見肺臟呈局限性間質(zhì)性肺炎和淤血，并伴有血栓、部分肺泡隔增寬，支氣管周圍有淋巴細(xì)胞浸潤伴有間質(zhì)性肺炎，但試驗(yàn)組2比試驗(yàn)組1組織病變更加嚴(yán)重（表3）。本試驗(yàn)結(jié)果表明ISA201VG佐劑效果更好，同時(shí)證實(shí)類NADC30-PRRSV（SY株）制備的滅活疫苗對于同源毒株的攻毒保護(hù)較差，不宜制備滅活疫苗免疫。

圖10 不同佐劑配制的PRRSV滅活疫苗接種豬后的抗體變化

圖11 類NADC30-PRRSV/SY株攻毒后各組豬的體溫變化

圖12 類NADC30-PRRSV/SY株攻毒后各組豬的體重變化

表3 兩種佐劑制備的PRRSV滅活疫苗免疫豬攻擊NADC30-PRRSV/SY株后的組織病理變化

PRRSV毒株的快速變異導(dǎo)致毒株多樣性，并且部分豬場存在多個(gè)譜系毒株共存的情況，增加了防控PRRS的難度，豬場為了穩(wěn)定藍(lán)耳病，選擇使用弱毒疫苗和滅活疫苗聯(lián)合使用，但是前面試驗(yàn)數(shù)據(jù)已經(jīng)證實(shí)效果甚微。試驗(yàn)條件下或田間條件下，單純使用滅活疫苗或者是之前感染過PRRSV的陽性豬群再使用滅活疫苗，對于減少排毒時(shí)間和排毒量以及提高生產(chǎn)成績作用有限。

3 總結(jié)

綜上所述，PRRSV滅活疫苗一般很難產(chǎn)生或者產(chǎn)生的中和抗體滴度較低，而且刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子反應(yīng)一般也認(rèn)為是佐劑的作用，屬于非特異性免疫反應(yīng)，大部分試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在預(yù)防PRRSV感染、減少排毒、提高生產(chǎn)成績方面效果甚微。

免疫PRRS弱毒疫苗或者豬只感染過PRRSV之后，再免疫滅活疫苗，是否會激發(fā)更好的體液免疫和細(xì)胞免疫，這方面有正面的報(bào)道，也有反面的報(bào)道，總體對防控PRRSV感染和減少排毒作用有限。Nan等（2017）表示PRRSV滅活疫苗的潛在功效作為治療疫苗比疾病預(yù)防疫苗作用要強(qiáng)。

當(dāng)然，PRRS防控需要綜合措施，如生物安全、疫苗免疫、后備母豬隔離馴化和防控繼發(fā)細(xì)菌疾病等，不能完全依賴疫苗免疫。目前很多種豬企業(yè)PRRSV凈化提上日程，PRRSV滅活疫苗有一定的用武之地，可以在準(zhǔn)備凈化PRRSV的豬場穩(wěn)定之后，種豬群免疫使用。