蕎麥花葉蘆丁對高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞損傷的影響

公丕媛 張雪 施小哲

(1吉林大學(xué)校醫(yī)院，吉林 長春 130021；2吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院第一臨床醫(yī)院；3長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

糖尿病性白內(nèi)障是常見的一種糖尿病并發(fā)癥，隨著糖尿病發(fā)病率的升高，我國糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病率呈增長趨勢，體內(nèi)持續(xù)高糖可加速糖尿病性白內(nèi)障的惡化，甚至失明，人晶狀體上皮細(xì)胞是糖尿病性白內(nèi)障的重要靶細(xì)胞，高糖作用下可促使多元醇在晶狀體內(nèi)沉積而促使晶狀體滲透壓升高，進(jìn)而導(dǎo)致晶狀體水腫直至形成白內(nèi)障，目前中草藥的提取物或活性成分具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用，并可抑制糖尿病性白內(nèi)障的進(jìn)展，還可能減輕高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞損傷〔1～3〕。蕎麥黃酮是蕎麥的主要提取物之一，其對糖尿病及其并發(fā)癥具有良好的預(yù)防與治療的作用，研究發(fā)現(xiàn)蕎麥花葉蘆丁是蕎麥黃酮的主要成分，蕎麥花葉蘆丁具有降糖、降脂與抗氧化等作用，還可減輕2型糖尿病大鼠肝臟損傷〔4〕。但蕎麥花葉蘆丁與糖尿病性白內(nèi)障的相關(guān)報(bào)道尚少。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在多種疾病形成及發(fā)展過程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，LncRNA FENDRR在高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平升高，并可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成〔5〕。生物信息學(xué)分析顯示FENDRR與miR-146b-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明miR-146b-3p可抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)〔6〕。但FENDRR/miR-146b-3p分子軸是否可作為蕎麥花葉蘆丁預(yù)防與治療糖尿病性白內(nèi)障的潛在靶點(diǎn)尚未可知。因此，本研究采用高糖誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討蕎麥花葉蘆丁是否可通過調(diào)控FENDRR/miR-146b-3p分子軸而減緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)展進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 蕎麥花葉購自內(nèi)蒙古通遼市庫侖旗；人晶狀體上皮細(xì)胞購自上海中喬新舟生物；DMEM培養(yǎng)液與胎牛血清購自美國Gibco；Trizol試劑購自美國Invitrogen；Lipofectamine2000、凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶；逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher；miR-NC、miR-146b-3p mimics、si-NC、si-FENDRR、anti-miR-NC、anti-miR-146b-3p購自廣州銳博生物；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購自美國CST；二抗購自武漢博士德生物。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 蕎麥花葉蘆丁制備〔7〕：取蕎麥花葉加水加熱提取2次，收集濾液濃縮后加入酸性殼聚糖，過濾，收集濾液靜置沉淀，得到黃色沉淀物(總黃酮含量95%)，總黃酮中加入95%乙醇后置于70℃水中加熱溶解，過濾，收集濾液減壓回收乙醇，干燥后得到蕎麥花葉蘆丁(含量98%)，加入培養(yǎng)基稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L。人晶狀體上皮細(xì)胞接種于含有濃度為30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h〔8〕，記為Model組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞記為Con組。人晶狀體上皮細(xì)胞分別加入含有不同濃度(0.2、0.4、0.8 mg/L)蕎麥花葉蘆丁的培養(yǎng)基與含有30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，分別記為Model+蕎麥花葉蘆丁低劑量組、Model+蕎麥花葉蘆丁中劑量組、Model+蕎麥花葉蘆丁高劑量組。si-NC、si-FENDRR、miR-NC、miR-146b-3p mimics分別轉(zhuǎn)染入人晶狀體上皮細(xì)胞后加入含有濃度為30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，分別記為Model+si-NC組、Model+si-FENDRR組、Model+miR-NC組、Model+miR-146b-3p組。anti-miR-NC、anti-miR-146b-3p分別轉(zhuǎn)染入人晶狀體上皮細(xì)胞后加入含有濃度為0.8 mg/L蕎麥花葉蘆丁與30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，分別記為Model+蕎麥花葉蘆丁+anti-miR-NC組、Model+蕎麥花葉蘆丁+anti-miR-146b-3p組。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 按照上述分組處理人晶狀體上皮細(xì)胞，加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，棄上清后將500 μl結(jié)合緩沖液加入細(xì)胞沉淀后，按照凋亡試劑盒分別加入膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC與碘化丙啶(PI)，室溫振蕩孵育10 min后應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.3檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA的水平 用反復(fù)凍融法裂解各組人晶狀體上皮細(xì)胞后，根據(jù)試劑盒說明書分別檢測SOD、MDA的水平。

1.2.4qRT-PCR檢測FENDRR和miR-146b-3p的表達(dá)水平 取各組人晶狀體上皮細(xì)胞加入Trizol試劑提取RNA，檢測RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，qRT-PCR過程中以cDNA為模板，反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液2.5 μl，硫酸鎂(MgSO4)2.5 μl，脫氧核苷三磷酸(dNTPs)2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free雙蒸水(ddH2O)補(bǔ)足體系至25 μl，反應(yīng)程序按照試劑盒說明書設(shè)置，應(yīng)用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測FENDRR(內(nèi)參GAPDH)和miR-146b-3p(內(nèi)參U6)的表達(dá)水平。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測FENDRR和miR-146b-3p的靶向關(guān)系 用FENDRR和miR-146b-3p的結(jié)合位點(diǎn)克隆至pmirGLO載體得到野生型載體WT-FENDRR，用基因突變技術(shù)突變結(jié)合位點(diǎn)后將其克隆至pmirGLO載體得到突變型載體MUT-FENDRR，miR-NC、miR-146b-3p mimics與WT-FENDRR、MUT-FENDRR分別對人晶狀體上皮細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染24 h，收集細(xì)胞后檢測其熒光素酶活性。

1.2.6Western印跡檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 按照“1.2.1”實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA試劑盒檢測蛋白濃度后變性(100℃水浴10 min)，按照每孔30 μg蛋白上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育Bax(1∶800)、Bcl-2(1∶800)與內(nèi)參GAPDH一抗稀釋液(1∶1 000)過夜，TBST洗滌，室溫孵育二抗稀釋液(1∶2 000)1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1蕎麥花葉蘆丁對高糖條件下人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較，Model組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與Model組比較，Model+蕎麥花葉蘆丁低劑量組、Model+蕎麥花葉蘆丁中劑量組、Model+蕎麥花葉蘆丁高劑量組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，且不同劑量組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1、圖2。

圖1 蕎麥花葉蘆丁對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響

表1 蕎麥花葉蘆丁減弱高糖條件下人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡、細(xì)胞氧化應(yīng)激、FENDRR和miR-146b-3p表達(dá)

1～5：Con組,Model組,Model+蕎麥花葉蘆丁低劑量組，Model+蕎麥花葉蘆丁中劑量組,Model+蕎麥花葉蘆丁高劑量組

2.2蕎麥花葉蘆丁對高糖條件下人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較，Model組SOD的活性降低(P<0.05)，MDA的水平升高(P<0.05)；與Model組比較，Model+蕎麥花葉蘆丁低劑量組、Model+蕎麥花葉蘆丁中劑量組、Model+蕎麥花葉蘆丁高劑量組SOD的活性升高(P<0.05)，MDA的水平降低(P<0.05)，且不同劑量組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3蕎麥花葉蘆丁對高糖條件下人晶狀體上皮細(xì)胞中FENDRR和miR-146b-3p的影響 與Con組比較，Model組FENDRR的表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-146b-3p的表達(dá)水平降低(P<0.05)；與Model組比較，Model+蕎麥花葉蘆丁低劑量組、Model+蕎麥花葉蘆丁中劑量組、Model+蕎麥花葉蘆丁高劑量組FENDRR的表達(dá)水平降低(P<0.05)，miR-146b-3p的表達(dá)水平升高(P<0.05)，且不同劑量組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.4FENDRR靶向miR-146b-3p LncBase Predicted v.2預(yù)測顯示FENDRR與miR-146b-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。共轉(zhuǎn)染miR-146b-3p mimics，與共轉(zhuǎn)染miR-NC相比較，野生型載體WT-FENDRR的熒光素酶活性降低(P<0.05)；與共轉(zhuǎn)染miR-NC相比較，共轉(zhuǎn)染miR-146b-3p mimics對突變型載體MUT-FENDRR的熒光素酶活性無明顯影響，見表2。

圖3 FENDRR和miR-146b-3p的互補(bǔ)序列

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5干擾FENDRR對高糖條件下人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡氧化應(yīng)激的影響 與Model組、Model+si-NC組比較，Model+si-FENDRR組細(xì)胞凋亡率明顯降低，Bax蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高，miR-146b-3p表達(dá)水平明顯升高，SOD活性明顯升高，MDA水平明顯降低(均P<0.05)，見圖4、圖5、表3。

表3 干擾FENDRR減弱高糖條件下人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡氧化應(yīng)激

圖4 干擾FENDRR對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響

1～3：Model組,Model+si-NC組,Model+si-FENDRR組

2.6miR-146b-3p對高糖條件下人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡氧化應(yīng)激的影響 與Model組、Model+miR-NC組比較，Model+miR-146b-3p組細(xì)胞凋亡率明顯降低，Bax蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高，SOD活性明顯升高，MDA水平明顯降低(均P<0.05)，見圖6、圖7、表4。

圖6 miR-146b-3p對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響

1～3：Model組,Model+miR-NC組,Model+miR-146b-3p組

表4 miR-146b-3p減弱高糖條件下人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡氧化應(yīng)激

2.7抑制miR-146b-3p可逆轉(zhuǎn)蕎麥花葉蘆丁對高糖條件下人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡氧化應(yīng)激的影響 與Model+蕎麥花葉蘆丁+anti-miR-NC組比較，Model+蕎麥花葉蘆丁+anti-miR-146b-3p組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，Bax蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)，SOD活性明顯降低(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)，見表5、圖8、圖9。

表5 抑制miR-146b-3p可逆轉(zhuǎn)蕎麥花葉蘆丁對高糖條件下人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡氧化應(yīng)激的影響

圖8 抑制miR-146b-3p可逆轉(zhuǎn)蕎麥花葉蘆丁對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響

1～4：Model組,Model+蕎麥花葉蘆丁組，Model+蕎麥花葉蘆丁組,Model+蕎麥花葉蘆丁+anti-miR-NC組,Model+蕎麥花葉蘆+anti-miR-146b-3p組

3 討 論

人晶狀體上皮細(xì)胞可維持晶狀體生長、分化等，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成量增多可造成細(xì)胞氧化損傷從而產(chǎn)生病理性變化，因而如何減輕高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞損傷成為治療的關(guān)鍵，既往研究顯示葛根素等中藥可抑制糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)展，但關(guān)于其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證〔9〕。已有研究證實(shí)LncRNA在高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞損傷中表達(dá)異常，并可能作為減輕細(xì)胞損傷的潛在靶標(biāo)〔10，11〕。

蕎麥花葉蘆丁可降低2型糖尿病大鼠血糖含量，還可保護(hù)大鼠腎臟組織〔12〕。蕎麥花葉蘆丁可清除氧自由基及抑制脂質(zhì)過氧化進(jìn)而減輕乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷〔13〕。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率與Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果相似〔14〕，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)隨著蕎麥花葉蘆丁濃度的增高，高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率與Bax蛋白水平降低，而Bcl-2蛋白水平升高，提示蕎麥花葉蘆丁可抑制高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞中SOD活性降低，而MDA水平升高，與研究報(bào)道結(jié)果相似〔15〕，用蕎麥花葉蘆丁處理后高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞中SOD活性升高，MDA水平降低，提示蕎麥花葉蘆丁可抑制高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，且呈劑量依賴性。

本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞中FENDRR的表達(dá)水平升高，而隨著蕎麥花葉蘆丁使用劑量的增高，高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞中FENDRR的表達(dá)水平降低，提示蕎麥花葉蘆丁可能通過下調(diào)FENDRR的表達(dá)而發(fā)揮作用。研究表明FENDRR通過調(diào)節(jié)miR-126促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡〔16〕。但有研究發(fā)現(xiàn)FENDRR通過下調(diào)p53表達(dá)而抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔17〕。與以往研究不同，本研究證實(shí)FENDRR的表達(dá)水平升高可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞損傷，而干擾FENDRR表達(dá)后高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率降低，SOD活性升高，MDA水平降低，提示干擾FENDRR表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞損傷。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)干擾FENDRR表達(dá)后miR-146b-3p的表達(dá)水平升高，而高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞中miR-146b-3p的表達(dá)水平降低，蕎麥花葉蘆丁能夠促使miR-146b-3p的表達(dá)水平升高，同時(shí)本研究證實(shí)FENDRR與miR-146b-3p之間確實(shí)存在靶向結(jié)合關(guān)系，且存在負(fù)向調(diào)控的作用。研究表明miR-146b-3p高表達(dá)可減輕制人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔18〕。利拉魯肽可能通過升高miR-146b-3p的表達(dá)而抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)〔19〕。miR-146b-3p的上調(diào)可通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路而抑制急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)展〔20〕。提示蕎麥花葉蘆丁可能通過下調(diào)FENDRR的表達(dá)而上調(diào)miR-146b-3p的表達(dá)從而抑制糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)展。為進(jìn)一步驗(yàn)證蕎麥花葉蘆丁是否通過調(diào)控FENDRR/miR-146b-3p分子軸而發(fā)揮作用，本研究結(jié)果顯示，miR-146b-3p過表達(dá)后可明顯降低高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率，還可增強(qiáng)其抗氧化能力，而抑制miR-146b-3p表達(dá)后可明顯逆轉(zhuǎn)蕎麥花葉蘆丁對高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的作用。進(jìn)一步證實(shí)蕎麥花葉蘆丁可通過調(diào)控FENDRR/miR-146b-3p分子軸而減輕高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞損傷。

綜上所述，高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞中FENDRR的表達(dá)水平升高，而miR-146b-3p的表達(dá)水平降低，蕎麥花葉蘆丁可下調(diào)FENDRR的表達(dá)而上調(diào)miR-146b-3p的表達(dá)，進(jìn)而抑制高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，F(xiàn)ENDRR/miR-146b-3p可能作為蕎麥花葉蘆丁治療糖尿病性白內(nèi)障的潛在靶標(biāo)，還可能作為進(jìn)一步揭示糖尿病性白內(nèi)障形成的分子機(jī)制。但仍需體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)一步驗(yàn)證蕎麥花葉蘆丁對糖尿病性白內(nèi)障的作用，為臨床試驗(yàn)及治療糖尿病性白內(nèi)障提供新方向。