綠色熒光蛋白標(biāo)記解淀粉芽孢桿菌Bam22在油菜體內(nèi)的定殖

楊瀟湘，黃小琴，張 蕾，張重梅，鮮贇曦，周西全，劉 勇

（1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，成都 610066；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066）

0 引言

植物病害生物防治是實(shí)現(xiàn)生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要措施，而生防拮抗菌的運(yùn)用是生物防治的重要途徑之一[1]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)作為一類重要的生防菌，既能產(chǎn)生肽類、蛋白質(zhì)、吡嗪類和酚類等多種抗菌物質(zhì)[2]，也可以提高土壤酶活性，改善土壤微生物區(qū)系，從而提高土壤肥力[3]。然而，這類生防微生物在田間應(yīng)用時(shí)，時(shí)常無法達(dá)到預(yù)期的生防效果。這可能與其在植物根圍或內(nèi)部有效定殖的能力差有關(guān)[4-5]。成功的定殖是發(fā)揮促生防病等效果的先決條件。因此，除了研究其促生防病機(jī)制外，也有必要探究其在植株體內(nèi)的定殖能力和定殖規(guī)律。研究生防菌定殖的常用方法有同位素示蹤法[6]、抗生素抗性標(biāo)記法[7]、生化顯色標(biāo)記法[8]和熒光標(biāo)記法[9]等。其中，熒光標(biāo)記法中的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記法因標(biāo)記基因小、靈敏度高（可檢測單個(gè)的菌體）和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)時(shí)、原位研究微生物的空間定位、微生物與環(huán)境和宿主的相互作用等方面展示了良好的應(yīng)用前景[10-11]。利用GFP標(biāo)記生防菌株已在多種芽孢桿菌上取得成功，如枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等[12-14]。解淀粉芽孢桿菌菌株Bam22是分離自油菜根際土壤的具有生防潛力的微生物。前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對根腫病菌(Plasmodiophora brassicae)[15]、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)[16]、腐 皮 鐮 孢 菌 (Fusarium solani)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和鏈格孢(Alternaria alternate)等多種病原菌的生長和孢子萌發(fā)具有較好的抑制作用，并且表現(xiàn)出對多種作物較強(qiáng)的促生作用[15]。進(jìn)一步開發(fā)利用該菌株，首先要明確其在植株體內(nèi)的定殖能力和定殖規(guī)律。本研究利用自然轉(zhuǎn)化法將含有綠色熒光蛋白基因的穿梭載體pGFP4412導(dǎo)入Bam22細(xì)胞中，獲得GFP標(biāo)記菌株，并進(jìn)一步對標(biāo)記菌株的遺傳穩(wěn)定性、生長曲線、抑菌能力及其在油菜體內(nèi)的定殖進(jìn)行研究，旨在為解析其抗菌防病促生機(jī)制、制定科學(xué)施用技術(shù)和該菌株的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)Bam22、根 腫 菌 (P.brassicae)CZPb4、灰 葡 萄 孢 (B.cinerea)B13、核盤菌(S.sclerotiorum)Ss-1、腐皮鐮孢菌(F.solani)FoHJ9和鏈格孢(A.alternata)AlYY11均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭載體pGFP4412，帶有卡那霉素(Km)抗性基因和GFP基因，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)王琦教授惠贈(zèng)。

1.1.2 植物材料‘川油36’是由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育而成的油菜品種。

1.2 方法

1.2.1 Bam22的GFP標(biāo)記 采用Idris等[17]的兩步法轉(zhuǎn)化解淀粉芽孢桿菌Bam22，略作修改。挑取新鮮劃線的單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，33℃、170 r/min過夜振蕩培養(yǎng)；次日吸取一定體積的培養(yǎng)物于GCHE培養(yǎng)液中，使其OD600=0.3左右；33℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=1.4左右；加入等體積的GC培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)約1.5 h；將此時(shí)的培養(yǎng)物均分成2份，5000 r/min室溫離心5 min；取200 μL上清液重懸沉淀，加入2 mL轉(zhuǎn)化緩沖液和1 μg的pGFP4412質(zhì)粒，輕輕混勻后放置于33℃培養(yǎng)箱1 h，期間每10～15 min輕輕顛倒混勻1次，加入含亞致死濃度的卡那霉素的LB培養(yǎng)液，33℃、170 r/min培養(yǎng)2～3 h，8000 r/min離心5 min，取400 μL上清液重懸沉淀后均勻涂布于含卡那霉素的LB平板上，次日觀察有無抗性菌落出現(xiàn)，并進(jìn)行熒光顯微鏡觀察驗(yàn)證。

1.2.2 標(biāo)記菌株的遺傳穩(wěn)定性 以0.1%(v/v)比例取過夜活化的菌株Bam22-GFP加入到無抗生素的LB培養(yǎng)液中，33℃、170 r/min培養(yǎng)5 h；再重復(fù)以相同的比例將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于無抗生素的LB體培養(yǎng)液中，相同條件下重復(fù)培養(yǎng)10次。將培養(yǎng)10輪后的培養(yǎng)液稀釋一定倍數(shù)后涂布于不含與含卡那霉素的LB平板，統(tǒng)計(jì)2種平板上的菌落數(shù)，并采用熒光顯微鏡觀察驗(yàn)證。

1.2.3 生長曲線測定 菌株Bam22和Bam22-GFP在無抗生素的液體LB，33℃、170 r/min過夜活化，加入適量的LB液體使OD600=1.0左右，以1%(v/v)接種比例分別接種至LB液體培養(yǎng)基中，33℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)。在接種后的第0、5、10、15、20、25、30、35 h分別測定培養(yǎng)物的OD600，繪制其生長曲線。

1.2.4 標(biāo)記菌株對病原真菌的抑菌能力測定 用5 mm打孔器在活化的灰葡萄孢、核盤菌、腐皮鐮孢菌和鏈格孢菌落的邊緣打取菌餅，并置于PDA平板中央。在距菌餅2.5 cm處點(diǎn)接1 μL過夜活化的Bam22和Bam22-GFP菌液。25℃下培養(yǎng)3～5天，觀察抑菌圈大小。

1.2.5 標(biāo)記菌株對根腫菌休眠孢子萌發(fā)抑制的測定

（1）油菜根系分泌物的收集。參照劉翠平[18]的方法，將催芽后的油菜移到裝有Hoagland營養(yǎng)液的50 mL小燒杯的紗布上，每杯10顆，在24℃恒溫培養(yǎng)箱中光暗交替培養(yǎng)7天后收集根系分泌物溶液。根系分泌物溶液經(jīng)細(xì)菌過濾器（濾膜孔徑為0.22 μm）過濾后，保存于4℃冰箱備用。

（2）根腫菌休眠孢子的提取。參照楊佩文等[19]的方法，略作修改。將10 g油菜根腫組織消毒清洗后切碎，加50 mL蒸餾水于攪拌機(jī)內(nèi)攪成勻漿，用紗布過濾后將濾液轉(zhuǎn)移到干凈的50 mL離心管中，然后在離心機(jī)中3100 r/min離心15 min；倒掉上清液，使沉淀重溶于50 mL無菌水，再3100 r/min離心10 min，重復(fù)該操作3次；棄上清將沉淀溶于50%的蔗糖溶液，3100 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，再加入30 mL無菌水，3100 r/min離心10 min；倒掉上清液，重復(fù)該操作3次，用血球計(jì)數(shù)板法統(tǒng)計(jì)孢子含量，最后用無菌水制成109個(gè)孢子/mL的懸液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）解淀粉芽孢桿菌無菌發(fā)酵濾液的制備。分別挑取Bam22和Bam22-GFP單菌落接種到裝有150 mL LB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，33℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)3天，8000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)細(xì)菌過濾器（濾膜孔徑為0.22 μm）過濾后，保存于4℃冰箱備用。

（4）休眠孢子萌發(fā)抑制實(shí)驗(yàn)。參照劉翠平[18]的淺層液體培養(yǎng)法，用制備的根系分泌物溶液將根腫菌休眠孢子濃度稀釋為107個(gè)/mL備用。取4.5 mL含有根系分泌物的根腫菌休眠孢子懸浮液至50 mL滅菌三角瓶中，再加入0.5 mL解淀粉芽孢桿菌無菌發(fā)酵濾液，以等量LB培養(yǎng)液代替解淀粉芽孢桿菌無菌發(fā)酵濾液作為空白對照，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。25℃、黑暗條件培養(yǎng)7天后采用地衣紅染色法觀察休眠孢子的萌發(fā)情況。

1.2.6 標(biāo)記菌株的回收及其在油菜體內(nèi)定殖觀察 選取長勢一致的油菜幼苗，采用室內(nèi)盆栽灌根法進(jìn)行標(biāo)記菌株的回收及其在油菜體內(nèi)定殖觀察。每株油菜幼苗接種20 mL 1.00×107CFU/mL的Bam22-GFP菌液于油菜根圍，以LB培養(yǎng)基為對照，每處理重復(fù)20株。分別于菌液灌根后1、7、15、30、45天后取樣，取油菜根、莖、葉組織，用無菌水沖洗3次，研磨后稀釋成不同濃度，靜置3 min，取200 μL汁液涂于含20 μg/mL卡那霉素的LB平板上，33℃下培養(yǎng)36 h，在紫外投射儀照射下統(tǒng)計(jì)平板上發(fā)綠色熒光的菌落數(shù)，按公式(1)確定煙草植株體內(nèi)的標(biāo)記菌株量。在灌根后第7天，取油菜根、莖組織，用無菌水沖洗4次后，在熒光顯微鏡下觀察Bam22-GFP在油菜體內(nèi)的定殖情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌Bam22的GFP標(biāo)記

用自然轉(zhuǎn)化法將攜帶GFP標(biāo)記基因的大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pGFP4412導(dǎo)入解淀粉芽孢桿菌Bam22自然感受態(tài)細(xì)胞。挑取在含有卡那霉素的LB平板上長出的抗性菌落，在熒光顯微鏡下檢測到菌株發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，菌體形態(tài)為典型的桿狀，表明GFP在Bam22的細(xì)胞內(nèi)被成功表達(dá)（圖1）。Bam22-GFP經(jīng)不含卡那霉素的LB培養(yǎng)液繼代培養(yǎng)10次后，將菌液稀釋一定倍數(shù)分別涂布于不含與含卡那霉素的LB平板，統(tǒng)計(jì)2種平板上的菌落數(shù)，并采用熒光顯微鏡觀察驗(yàn)證。結(jié)果表明，含有卡那霉素抗性且會(huì)發(fā)熒光的菌株占菌落總數(shù)的比例為72%，表明質(zhì)粒pGFP4412在Bam22細(xì)胞中較為穩(wěn)定，標(biāo)記菌株適于定殖研究。

圖1 Bam22-GFP的熒光觀察

2.2 野生菌株和GFP標(biāo)記菌株的生長曲線比較

從野生菌株Bam22與GFP標(biāo)記菌株Bam22-GFP在LB培養(yǎng)液中的生長曲線（圖2）可以看出，菌株Bam22與Bam22-GFP的生長曲線的變化趨勢基本相同。說明外源質(zhì)粒的引入和GFP蛋白的表達(dá)對宿主菌的生長量并未產(chǎn)生明顯影響。

圖2 Bam22與Bam22-GFP的生長曲線

2.3 野生菌株和GFP標(biāo)記菌株的抑菌能力比較

野生型菌株Bam22對多種病原菌均表現(xiàn)出較好的抑菌效果。因此，通過平板對峙法比較了Bam22和Bam22-GFP對灰葡萄孢、核盤菌、腐皮鐮孢菌及鏈格孢的抑制效果。由圖3可知，Bam22-GFP對灰葡萄孢、核盤菌、腐皮鐮孢菌及鏈格孢的抑菌效果與野生型菌株Bam22無明顯差異。進(jìn)一步采用地衣紅染色法比較野生菌株和GFP標(biāo)記菌株抑制根腫菌休眠孢子萌發(fā)的能力。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，著紅色的是未萌發(fā)的休眠孢子，未著色的是萌發(fā)的休眠孢子。由圖4可知，與對照相比，Bam22-GFP與Bam22均對根腫菌休眠孢子萌發(fā)具有較好的抑制能力，兩者無差異。結(jié)果說明，外源質(zhì)粒的引入對Bam22的抑菌能力并無太大的影響，Bam22-GFP可用來研究Bam22的生防效果和定殖規(guī)律。

圖3 Bam22與Bam22-GFP的抑菌能力

圖4 Bam22-GFP對根腫菌休眠孢子萌發(fā)的影響

2.4 標(biāo)記菌株在油菜上的定殖

采用灌根法研究Bam22-GFP在油菜上的定殖，分別于菌液灌根后1、7、15、30、45天后取樣，采用含有卡那霉素的LB平板進(jìn)行標(biāo)記菌株的分離和統(tǒng)計(jì)。對照處理所有階段的樣品涂布于卡那霉素LB平板上均無芽孢桿菌菌落生長，而Bam22-GFP灌根處理后的樣品涂布在卡那霉素LB平板上均有菌落生長；Bam22-GFP在油菜根、莖、葉部位的定殖趨勢一致，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但根部菌落數(shù)顯著高于莖和葉；灌根后第7天，根、莖、葉的Bam22-GFP菌落數(shù)均達(dá)到峰值，分別為3.55×103、2.89×103、1.23×103CFU/g菌落；隨著時(shí)間推移，各部位的菌落數(shù)逐漸降低，但到第45天時(shí)，仍然可以在根、莖和葉組織中回收到少量標(biāo)記菌株（圖5）。此外，在灌根后7天可通過熒光顯微鏡明顯觀察到Bam22-GFP聚集在根、莖部的皮層和維管束部位（圖6）。標(biāo)記菌落的回收和熒光顯微鏡觀察結(jié)果均表明，Bam22-GFP能夠定殖在油菜植株內(nèi)部，并在油菜體內(nèi)傳導(dǎo)。

圖5 Bam22-GFP在油菜上的定殖動(dòng)態(tài)

圖6 熒光顯微鏡觀察Bam22-GFP在油菜上的定殖

3 結(jié)論與討論

本研究將攜帶綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pGFP4412導(dǎo)入解淀粉芽孢桿菌Bam22細(xì)胞中，標(biāo)記菌株Bam22-GFP在熒光顯微鏡下發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光，其生長和對多種病原菌真菌及根腫菌休眠孢子萌發(fā)的抑制效果較野生型菌株Bam22無明顯差異。Bam22-GFP可通過灌根方式進(jìn)入油菜體內(nèi)定殖和傳導(dǎo)，定殖時(shí)間長達(dá)45天。

隨著人類環(huán)保意識的增強(qiáng)以及對自身生活品質(zhì)的關(guān)注，利用環(huán)境友好的有益微生物進(jìn)行防治植物病害已成為保障農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要手段，引起越來越多的重視。然而，生防微生物在田間應(yīng)用時(shí)常因定殖能力差而導(dǎo)致病害防治效果不理想[4-5]。因此，生防微生物在植株體內(nèi)有效定殖是其發(fā)揮防病和促生作用的前提與關(guān)鍵因素。生防微生物的定殖研究備受植物病理工作者的關(guān)注。近年來，標(biāo)記基因技術(shù)的建立和發(fā)展為原位實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的觀測微生物的定殖及其與植物的互作提供了強(qiáng)有力的工具。其中，GFP具備無需外源反應(yīng)底物、操作簡單、檢測方便以及可原位實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察等特點(diǎn)，已經(jīng)成為當(dāng)代研究目標(biāo)微生物在自然環(huán)境中的釋放、生存、定殖以及與植物互作等最為成功的標(biāo)記基因[10-11]。但研究表明，GFP在微生物體內(nèi)的高效表達(dá)會(huì)造成某些標(biāo)記菌株額外的代謝負(fù)擔(dān)，可能影響其生理代謝活動(dòng)和生物學(xué)功能[20]。本研究成功將攜帶GFP的質(zhì)粒pGFP4412導(dǎo)入解淀粉芽孢桿菌Bam22中，標(biāo)記菌株Bam22-GFP與野生菌株Bam22在生長和抑菌能力等方面無明顯差異，說明pGFP4412的導(dǎo)入和GFP蛋白的表達(dá)并未對該菌株的生長和生防功能產(chǎn)生明顯的影響，而且質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性較好。這與采用質(zhì)粒pGFP4412進(jìn)行熒光標(biāo)記蠟樣芽胞桿菌[21]、枯草芽孢桿菌[22]等菌株的結(jié)果一致。

解淀粉芽孢桿菌Bam22菌株的成功標(biāo)記為研究其在植物體內(nèi)的定殖情況奠定了良好的基礎(chǔ)。對油菜采用Bam22-GFP菌液灌根法處理，發(fā)現(xiàn)Bam22-GFP能通過根部進(jìn)入油菜內(nèi)部，并在植物體內(nèi)傳導(dǎo)，從根部傳導(dǎo)至莖部和葉部。在測定時(shí)間內(nèi)油菜各組織菌落數(shù)量均表現(xiàn)出先上升后下降趨勢，根部菌落數(shù)顯著高于莖和葉，說明采用灌根法尤其利于菌株在根部的定殖，適合用于防治油菜根部病害，如油菜根腫病。下一步將采用噴葉法研究Bam22在油菜體內(nèi)的定殖情況和對葉部病害的防治效果。

田間根腫菌存在多優(yōu)勢小種混生現(xiàn)象，導(dǎo)致抗病品種抗性不穩(wěn)定，目前根腫病的防治主要依賴于大量化學(xué)藥劑灌根處理。但大量使用化學(xué)農(nóng)藥容易導(dǎo)致抗藥菌株產(chǎn)生，造成環(huán)境污染，引起人畜中毒等問題[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在灌根后45天仍然能在油菜植株各組織檢測到標(biāo)記菌株存在，采用Bam22進(jìn)行油菜種子包衣處理或苗期灌根處理，理論上可抑制油菜根圍根腫菌休眠孢子的萌發(fā)，并且持效期較長。為此，發(fā)展以Bam22為主的有益微生物防治措施或許是目前解決十字花科作物根腫病危害的理想途徑。Bam22除了可以抑制油菜根腫菌休眠孢子的萌發(fā)外，還對多種其他植株的病原真菌具有較好的抑制效果。然而，筆者只研究了Bam22-GFP在油菜體內(nèi)的定殖情況，該菌株能否在其他植物體內(nèi)穩(wěn)定定殖，進(jìn)而發(fā)揮防治效果，還需進(jìn)一步研究，為大范圍推廣Bam22提供依據(jù)。

綜上，本研究明確了淀粉芽孢桿菌Bam22在油菜上的定殖動(dòng)態(tài)和規(guī)律，有助于進(jìn)一步了解菌株的防病促生機(jī)制，為制定科學(xué)施用技術(shù)和該菌株的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。