四種消毒劑對豬圓環(huán)Ⅱ型病毒核酸降解效果研究

李 博，李仁祥，黃榮珍，王貴平，劉自逵

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

1 前言

豬圓環(huán)病毒（PCV）是動物無囊膜病毒，最早在20 世紀(jì)90 年代初從患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的豬中分離到的[1-3]，可引起多種疾病感染[1-3]。PCV2 暴發(fā)和蔓延，給全球養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。生物安全防控是養(yǎng)殖場防控傳染病第一道防線。當(dāng)前豬傳染病防控形勢依然復(fù)雜嚴(yán)峻，消毒在生物安全防控中具有不可替代的重要性。養(yǎng)殖場常用實時熒光定量PCR 檢測病毒核酸[4]，以此來評估消毒效果。多種消毒劑都可以加速病毒核酸降解，但在養(yǎng)殖場實際生產(chǎn)應(yīng)用中能否有效降解核酸并使之轉(zhuǎn)陰，還需進(jìn)一步研究。本試驗?zāi)M養(yǎng)殖場4 個生物安全防控場景，探究四種常見消毒劑對豬圓環(huán)Ⅱ型病毒核酸降解的差異性，為豬傳染性疾病防控實踐提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 病料樣品

感染PCV2 患豬內(nèi)臟和糞便來自于湖南省株洲市某規(guī)模化豬場。

2.1.2 試劑盒

病毒DNA/RNA 提取試劑盒（上海基靈生物科技有限公司；生產(chǎn)批號：NCE012，有效期：20230120）。豬圓環(huán)病毒Ⅱ型熒光PCR 核酸檢測試劑盒（湖南冠牧生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：2021004，有效期：20220713）。

2.1.3 消毒劑

進(jìn)口過硫酸氫鉀復(fù)合物粉(A）：推薦使用稀釋濃度1:200, 朗盛化學(xué)（中國）有限公司；國產(chǎn)過硫酸氫鉀復(fù)合物粉（B），推薦使用稀釋濃度1:200，湖南加農(nóng)正和生物技術(shù)有限公司，商品名:滅毒威甲；燒堿（C），推薦使用稀釋濃度1:50，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃戊二醛（D），推薦使用稀釋濃度1:50，湖南加農(nóng)正和生物技術(shù)有限公司。

2.1.4 磷酸鹽緩沖液: 準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉2.83 g和磷酸二氫鉀1.36 g，加入蒸餾水1000 mL，待完全溶解后，調(diào)pH至7.2～7.4，于121℃滅菌20 min 備用。

2.1.5 戊二醛中和劑: 準(zhǔn)確稱量吐溫-80 3 mL和甘氨酸1 g，溶于97 mL PBS 中，121℃高壓滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆肹5]。

2.1.6 過硫酸氫鉀中和劑:準(zhǔn)確稱取硫代硫酸鈉300 mg，溶于100 mL 磷酸鹽緩沖液中，121℃高壓滅菌20 min，4℃保存?zhèn)溆肹6]。

2.1.7 2%燒堿溶液中和劑配制:等當(dāng)量的鹽酸。

2.1.8 試驗時間和場地

2021 年12 月20 日～2022 年1 月6 日在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物免疫實驗室（室內(nèi)）和實驗樓外地面（室外）進(jìn)行。試驗前和試驗后對場地進(jìn)行消毒處理，生物安全措施均完備。

2.2 試驗方法

2.2.1 病毒液制備

病毒液制備:取含有PCV2 患豬腎臟0.1 g 裝入1.5 mL 離心管中，加入1 mL 生理鹽水，充分研磨，反復(fù)凍融3 次。10000 r/min，離心5 min。取上清液用QPCR 驗證，分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 消毒劑配制

進(jìn)口過硫酸氫鉀復(fù)合物粉和國產(chǎn)過硫酸氫鉀復(fù)合物粉均按照1:200 比例配制，戊二醛溶液按1:50 比例配制，燒堿按照1:50 比例配制。

2.2.3 場景模擬

（1）場景1：室外車輛輪胎糞便：將病毒原液用生理鹽水稀釋后與豬糞便混合，使混合后的PCV2核酸CT 值在33-36，制備成低病毒含量樣品。將其涂抹到室外車輛輪胎四處部位。

（2）場景2：模擬室外露天地面糞便：將病毒原液用生理鹽水稀釋后與豬糞便混合，使混合后的PCV2 核酸CT值在33～36，制備成低病毒含量樣品。將其涂抹到室外露天地面上，分別涂抹四處部位。

（3）場景3：模擬室內(nèi)地面糞便：分別在4℃、25℃、37℃條件下，將病毒原液用生理鹽水稀釋后與豬糞便混合，使混合后的PCV2 核酸CT 值在33-36，制備成低病毒含量樣品。將其涂抹到四個相同的搪瓷盤上。

（4）場景4：模擬豬場室內(nèi)地面尿液中:在4℃、25℃、37℃條件下，分別取50 μL 稀釋好的病毒液加入450 μL 消毒液，同時設(shè)置對照組，50 μL 稀釋好的病毒液加入450 μL 生理鹽水（病毒液與消毒劑比例為1:9）。本實驗于2022 年1 月3 日～2022 年1 月6 日在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物免疫實驗室進(jìn)行。

2.2.4 消毒

場景1、2、3 中分別用100 mL 的消毒劑A、消毒劑B 和消毒劑D 潑灑。場景4 中用消毒劑A、消毒劑B、消毒劑C 和消毒劑D。同時設(shè)對照組，向?qū)φ战M中潑灑等量生理鹽水。分別反應(yīng)0h（消毒前）、0.5h、1 h、3 h、5 h 和7 h 后取 樣，進(jìn)行QPCR 取樣檢測。

2.2.5 取樣和檢測方法

（1）取樣：場景1、2、3 中用生理鹽水浸濕的無菌棉簽在每個時間點對消毒后樣品采樣，放到1.5 mL 離心管中，向離心管中加入100 μL 生理鹽水和900 μL 中 和劑。震蕩混勻，10000 r/min，離心1 min 后作為待測樣品備用；場景4 中，從樣品中抽取200 μL 作為待測樣品。

（2）QPCR 檢測：從待測樣品中抽取200 μL，進(jìn)行核酸提取，用實時熒光定量PCR 檢測PCV2 核酸相對含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 場景1 消毒效果評估

仔豬轉(zhuǎn)群后地面糞便表面消毒效果評估見表1。該試驗是在室外進(jìn)行的，進(jìn)行試驗當(dāng)天，氣溫2℃～7℃，試驗期間一直有微小雨霧。室外車輛輪胎表面場景下，三種消毒劑對帶毒固體表面消殺后，從表1 中可以看出PCV2 核酸轉(zhuǎn)陰時間，消毒劑A（7h）、消毒劑B（7h）、消毒劑D（5 h）。在第7 h 三種消毒劑和對照組檢測PCV2 的核酸均為陰性。戊二醛溶液在該場景中消毒較有優(yōu)勢。

表1 三種消毒劑對室外輪胎表面上PCV2 病毒核酸降解效果

3.2 場景2 消毒效果評估

室外露天地面糞便中PCV2 核酸降解試驗結(jié)果見表2。試驗當(dāng)天，氣溫6℃～10℃，陰天。室外露天地面糞便場景中三種消毒劑對PCV2 消殺后，PCV2 核酸降解效果跟同時間點對照組的效果均差別不大。

表2 三種消毒劑對室外地面上PCV2 病毒核酸降解效果

3.3 場景3: 室內(nèi)地面糞便中PCV2 核酸降解試驗

（表3～表5）

表3 三種消毒劑4℃條件下對PCV2 病毒核酸降解效果(室內(nèi)地面)

表5 三種消毒劑37℃條件下對PCV2 病毒核酸降解效果(室內(nèi)地面)

不同溫度下三種消毒劑對室內(nèi)地面糞便中PCV2 消殺后，在不同時間點對PCV2 核酸進(jìn)行取樣檢測。PCV2 核酸轉(zhuǎn)陰分別為：消毒劑A（4℃，＞7h;25℃，5 h;37℃，＞7h）、消毒劑B（4℃，＞7h;25℃，7 h;37℃，＞7h）；消毒劑D（4℃，＞7 h;25℃，7 h;37℃，5 h）。

室內(nèi)地面糞便場景中，在4℃條件下三種消毒劑在不同時間點對PCV2 核酸降解效果和對照組差別不大。室內(nèi)地面糞便場景中，25℃條件下進(jìn)口過硫酸氫鉀復(fù)合物（A 消毒劑）5 h 能將PCV2 核酸降解為陰性。所以春秋季節(jié)推薦使用進(jìn)口過硫酸氫鉀復(fù)合物（A 消毒劑）對室內(nèi)地面糞便消毒。37℃條件下，戊二醛溶液（D 消毒劑）在5 h 內(nèi)可以將PCV2 核酸降解為陰性；進(jìn)口過硫酸氫鉀復(fù)合物粉和國產(chǎn)過硫酸氫鉀復(fù)合物粉，對PCV2 核酸降解效果跟同時間點的對照組差別不大。所以夏季推薦使用戊二醛溶液對室內(nèi)地面糞便消毒。

表4 三種消毒劑25℃條件下對PCV2 病毒核酸降解效果(室內(nèi)地面)

3.4 場景4: 室內(nèi)地面尿液中PCV2 核酸降解試驗（表6 ～表8）

表6 四種消毒劑4℃條件下對PCV2 病毒核酸降解效果(地面尿液)

表8 四種消毒劑37℃條件下對PCV2 病毒核酸降解效果(地面尿液)

不同溫度下四種消毒劑對室內(nèi)地面尿液中PCV2 消殺后，在不同時間點檢測PCV2 核酸。在消殺后，PCV2 核酸轉(zhuǎn)陰時間：消毒劑A（4℃，＞7h;25℃，＞7 h;37℃，3 h）、消毒劑B （4℃，＞7 h;25℃，3 h；37℃，3 h）、消毒劑C（4℃，＞7 h;25℃，＞7 h;37℃，＞7 h）、消毒劑D（4℃，＞7 h;25℃，＞7 h;37℃，3 h）。

在4℃、25℃、37℃條件下，燒堿對PCV2 核酸降解效果與對照組沒有明顯差別。國產(chǎn)過硫酸氫鉀復(fù)合物粉在25℃、37℃條件下均能將PCV2 核酸降解為陰性，戊二醛在37℃條件下均能將PCV2核酸降解為陰性。戊二醛對皮膚和呼吸道有刺激性，所以推薦使用國產(chǎn)過硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑在該場景中使用。

表7 四種消毒劑25℃條件下對PCV2 病毒核酸降解效果(地面尿液)

4 結(jié)論

在場景1，室外帶毒的車輪胎表面消毒中，戊二醛溶液對PCV2 核酸降解效果相對較好，推薦使用戊二醛溶液對室外帶毒的車輪胎表面消毒。在場景2，室外露天地面糞便消毒中，推薦使用進(jìn)口過硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒。

在場景3，室內(nèi)地面糞便消毒中，春秋季節(jié)，推薦使用進(jìn)口過硫酸氫鉀復(fù)合物對室內(nèi)地面糞便消毒；夏季，推薦使用戊二醛溶液對室內(nèi)地面糞便消毒。

在場景4，豬場室內(nèi)地面尿液場景中，推薦使用進(jìn)口過硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒。

5 討論

豬圓環(huán)病毒目前流行最廣發(fā)病率較高的一種豬傳染性疾病[7]，可以引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。PCV2 感染的患豬能引起免疫抑制，導(dǎo)致其他病毒和細(xì)菌的繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬行業(yè)造成了巨大的損失[8]。評估四種消毒劑PCV2 核酸降解的差異，可以給養(yǎng)殖場的生產(chǎn)實踐提供有效臨床依據(jù)，對建立完善消毒程序，指導(dǎo)科學(xué)生產(chǎn)，有效和合理使用消毒劑具有實際意義。

在室內(nèi)地面尿液中PCV2 核酸降解試驗中，燒堿溶液在7 小時內(nèi)不能降解PCV2 核酸。燒堿溶液中的OH- 能夠水解病原微生物的蛋白質(zhì)外殼和核酸，使其變性，可以滅活病毒，OH- 對磷酸二酯鍵中的P 原子的攻擊會引起環(huán)狀2” ，3” 磷酸二酯中間體的形成。這種不穩(wěn)定的中間體經(jīng)過水解，得到2” 或3” 磷酸單酯。DNA 缺少2” OH- ，不能形成環(huán)狀磷酸二酯中間體，并且磷酸二酯鍵也不能水解，故對堿有一定抗性。有相關(guān)研究結(jié)果表明，燒堿能有效滅活PRV 和ASFV 等病毒[9]。但本試驗中燒堿溶液在7 小時內(nèi)對PCV2 核酸均沒有降解效果，其中的原因還需要進(jìn)一步探索。

在豬場室內(nèi)地面液體場景中，進(jìn)口過硫酸氫鉀復(fù)合物粉、國產(chǎn)過硫酸氫鉀復(fù)合物粉、戊二醛溶液對PCV2 核酸降解效果會隨著溫度的升高而提高。有相關(guān)研究證明，0℃～40 ℃，戊二醛溶液的消殺效果隨著溫度的升高而增強[10]。過硫酸氫鉀復(fù)合物粉使病原微生物蛋白質(zhì)變性、改變細(xì)胞膜的通透性；干擾病原菌DNA 和RNA 的合成，從而殺死病原菌。有相關(guān)研究證明，過硫酸氫鉀復(fù)合物粉能對病毒核酸有效降解[11]，與本試驗結(jié)果基本一致。

進(jìn)口過硫酸氫鉀復(fù)合物粉、國產(chǎn)過硫酸氫鉀復(fù)合物粉、戊二醛溶液消殺后，在患豬舍地面上帶毒糞渣的場景中PCV2 轉(zhuǎn)陰時間長于室內(nèi)地面尿液中場景中 PCV2 轉(zhuǎn)陰時間?？赡苁且驗榧S渣中有機物干擾作用，當(dāng)病原微生物和有機物混合, 有機物阻止消毒劑與病原微生物直接接觸，使消毒劑作用減弱。應(yīng)該提高消毒劑濃度和延長消毒時間或者在對豬舍環(huán)境進(jìn)行消毒前，應(yīng)徹底去除圈舍內(nèi)糞便、墊料等污染物，以免有機物影響消毒效果。

室外車輛輪胎糞便、室外露天地面糞便中場景中受到外界低溫和糞渣中有機物因素的影響，進(jìn)口過硫酸氫鉀復(fù)合物粉、國產(chǎn)過硫酸氫鉀復(fù)合物粉、戊二醛溶液對PCV2 核酸降解效果不理想。在室外條件下，溫度、有機物、天氣等因素都會影響消毒劑對PCV2 核酸降解效果。在實際生產(chǎn)過程中，建議選擇消毒效果較強、受有機物影響小的消毒劑。