禽白血病病毒p27蛋白多克隆抗體的制備及POCT檢測(cè)方法的建立

邵 穎，黃 燕，楊 艷，龔柳菲，宋祥軍，涂 健，祁克宗

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

禽白血病病毒(Avianleukosisvirus，ALV)是可引起家禽的淋巴性白血病和髓樣性白血病等腫瘤疾病的致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒，是給全球范圍內(nèi)家禽產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的病原體之一[1-4]。ALV天然條件下僅傳染雞，以垂直傳播為主要的傳播形式，會(huì)導(dǎo)致病雞的免疫防控能力降低，進(jìn)一步造成患病雞多重傳染[5]。依據(jù)病毒包膜糖蛋白的抗原構(gòu)造、宿主范疇以及不同毒株之間的彼此干擾等，可將ALV劃分為A～K 11個(gè)亞群[6]，其中J亞群(ALV-J)危害最大，給全球范圍內(nèi)家禽產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了不可估計(jì)的損失[7-9]。ALV的編碼區(qū)含編碼基因gag、pol和env共 3個(gè)，ALV-p27存在于gag基因上并在ALV各亞群中有高度的同源性和保守性，其翻譯的p27蛋白是病毒的核心蛋白，是免疫學(xué)方法檢測(cè)ALV選擇的主要抗原成分[10-11]。

ALV實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)方法有病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、間接免疫熒光測(cè)定(IFA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，一般都對(duì)專業(yè)操作要求高、操作復(fù)雜且儀器昂貴，不適用于大規(guī)模的臨床檢測(cè)[12-14]。此外，由于某些內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如EAV-HP家族)可能表達(dá)p27蛋白，因此它會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的假陽(yáng)性高[15]，所以，迫切需要一種用于診斷ALV的快速和準(zhǔn)確的方法。

即時(shí)檢驗(yàn)(Point-of-care testing，POCT)是在現(xiàn)場(chǎng)使用便攜式分析儀和快速診斷套件進(jìn)行的實(shí)時(shí)檢查，相比實(shí)驗(yàn)室檢查的繁瑣，其操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、不需要專業(yè)技術(shù)人員操作，可實(shí)現(xiàn)樣本的快速檢測(cè)[16-18]。目前，POCT技術(shù)已研發(fā)出一系列產(chǎn)品在多個(gè)領(lǐng)域得到初步推廣，未來(lái)發(fā)展前景良好[19]。熒光免疫層析技術(shù)(Lateral flow immunoassay，LFIA)是基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的新型膜檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是將特異性識(shí)別待檢物質(zhì)的抗原(或抗體)和二抗分別固定在硝酸纖維素膜(NC膜)上，形成檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，以ALV的p27蛋白制備多克隆抗體，從而建立熒光微球免疫層析試紙條檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，靈敏度高[20]。

因此，本研究通過(guò)制備禽白血病病毒p27多克隆抗體為基礎(chǔ)，初步建立了POCT熒光微球免疫層析定性檢測(cè)ALV的方法，旨在為禽白血病的檢測(cè)提供一種更為簡(jiǎn)便的方法，為基層獸醫(yī)臨床檢測(cè)提供便利。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

pGEX-6P-1質(zhì)粒、pET-32a(+)質(zhì)粒、大腸桿菌、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞、禽白血組織樣品均由獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG均購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司。

試驗(yàn)動(dòng)物，1只2 kg左右的新西蘭白兔，6只BALB/c小鼠飼養(yǎng)在動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物房。

硝酸纖維素膜(NC膜)、PVC底板、吸水紙、樣品墊均為必歐瀚生物技術(shù)(合肥)有限公司提供。

主要試劑：2×Taq Master Mix、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase、SYBR Green Ⅰ熒光染料，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、Protein A+G Agarose購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；未標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自博士德生物有限公司。

1.2 p27基因的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建

參考本實(shí)驗(yàn)室保存的pGEX-6p-1、pET-32a線性化質(zhì)粒，利用Oligo軟件設(shè)計(jì)帶同源臂的p27的特異性引物，送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，以本實(shí)驗(yàn)室保存的ALV-p27基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增目的片段。引物序列如下(劃線部分為同源臂序列)：

32a-p27-F：CAAGGCCATGGCTGATATCATGCCTGT

AGTGATTAAGACAG；32a-p27-R：CGGAGCTCGAATTCG

GATCTTAGGCCGCGGCTATGCCT。

6P-1-p27-F：TCCCGGGTCGACTCGAGATGCCTG

TAGTGATTAAGACAG；6P-1-p27-R：TCCCGGGTCGA

CTCGAGTTAGGCCGCGGCTATGCCT。

反應(yīng)完成后，回收帶同源臂的目的片段，與本實(shí)驗(yàn)室保存的線性化pGEX-6P-1、pET-32a質(zhì)粒載體分別進(jìn)行連接，配成10 μL體系。再將PCR管置于冰上冷卻5 min后，加入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，混勻加入700 LB培養(yǎng)基，5 000 r/min離心3 min。取沉淀涂布在含有Amp抗性的LB平板上。PCR篩選出的陽(yáng)性質(zhì)粒，抽提質(zhì)粒，將提取質(zhì)粒的DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，用含Amp的平板進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落擴(kuò)增培養(yǎng)后，PCR鑒定后由公司測(cè)序，驗(yàn)證序列的正確性。

1.3 誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白

分別取1 mL經(jīng)鑒定過(guò)的含陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-32a-p27和pGEX-6P-1-p27的BL21菌液轉(zhuǎn)接到含Amp(1 μg/mL)LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)3～4 h，至OD值達(dá)到0.4～0.6即可；加入誘導(dǎo)劑(IPTG)至終濃度為0.5 mmol/L，放入16 ℃、120 r/min的搖床培養(yǎng)16 h?？召|(zhì)粒菌液作為對(duì)照菌。離心收集菌體，PBS重懸菌體后超聲破碎至澄清，分別收集全菌液、沉淀、上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，對(duì)其表達(dá)情況與可溶性進(jìn)行分析。

16 ℃下IPTG誘導(dǎo)16 h的空載質(zhì)粒溶液、未誘導(dǎo)陽(yáng)性重組菌溶液、誘導(dǎo)后陽(yáng)性重組菌溶液、誘導(dǎo)后的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.4 重組蛋白的純化

分別將帶有His標(biāo)簽的p27蛋白和帶有GST標(biāo)簽的重組蛋白，按照His柱標(biāo)簽蛋白純化試劑盒和GST柱標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行純化操作，用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。

1.5 多克隆抗體的制備與鑒定

免疫之前分別對(duì)小鼠、白兔進(jìn)行采血，分離出陰性血清-80 ℃保存?zhèn)溆?。然后按照BCA試劑盒測(cè)定His-p27蛋白與GST-p27蛋白的濃度，用PBS進(jìn)行稀釋處理。首次免疫，His-p27融合蛋白與弗氏完全佐劑等量混合，振蕩儀振蕩乳化，不會(huì)分層即可，免疫BALB/c小鼠7只，每只小鼠100 μg，背部多點(diǎn)皮下注射；14 d后第2次免疫，融合蛋白與弗氏不完全佐劑等容量混合，同樣處理后，每只小鼠50 μg，背部注射；每隔14 d免疫1次，一共免疫5次。最后一次向腹腔注射融合蛋白。結(jié)束后分離陽(yáng)性血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩ST-p27蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻后，注射新西蘭大白兔1只，7 d 1次，共5次。心臟采血，分離陽(yáng)性血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 血清型效價(jià)的測(cè)定

首先確定GST-p27蛋白與His-p27蛋白最佳包被濃度，根據(jù)最佳稀釋比例分別測(cè)定鼠源多克隆抗體和兔源多克隆抗體的血清效價(jià)。分別將純化后的GST-p27蛋白與His-p27蛋白用包被液進(jìn)行梯度稀釋，置于37 ℃恒溫箱2 h。每孔加入 PBST、封閉液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱 2 h。棄去封閉液，洗滌3次。分別向酶標(biāo)板中加入100 μL按梯度稀釋的鼠血清和兔血清作為待測(cè)樣品，以鼠陰性血清、兔陰性血清作為陰性對(duì)照，37 ℃恒溫箱放置1 h。鼠血清中加入100 μL按1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG，兔血清中加入100 μL按1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，37 ℃恒溫箱放置1 h。避光加入100 μL TMB顯色液，避光反應(yīng)30 min。每孔加入100 μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。計(jì)算分析 P/N值確定融合蛋白最佳包被濃度。根據(jù)最佳包被濃度測(cè)定抗體效價(jià)。陽(yáng)性血清與陰性血清按照 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800梯度稀釋。按照上述試驗(yàn)步驟，最后得到數(shù)值計(jì)算分析P/N值，確定多克隆抗體效價(jià)。

1.7 多克隆抗體的Western Blot鑒定

用pGEX-6p-1空載質(zhì)粒菌液作為對(duì)照，對(duì)鼠源多克隆抗體GST-p27蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)印到PVDF膜，加入封閉液37 ℃ 2 h，用一抗稀釋液1∶500稀釋鼠血清，以1∶5 000稀釋HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 為二抗，充分洗滌后，ECL避光顯色。用pET-32a空質(zhì)粒菌液作為對(duì)照，對(duì)兔源多克隆抗體His-p27蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)印到 PVDF 膜，加入封閉液37 ℃ 2 h，以1∶500稀釋的兔血清為一抗，以加入1∶5 000稀釋HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 為二抗。充分洗滌后，用ECL避光顯色。

1.8 POCT試紙條的制備

按照 Protein A/G說(shuō)明書對(duì)兔源多克隆抗體與鼠源進(jìn)行純化，確定用鼠源多克隆抗體偶聯(lián)熒光微球，取500 μL的初洗緩沖液對(duì)熒光微球進(jìn)行初洗、活化后，取沉淀加入含鼠源多克隆抗體偶聯(lián)緩沖液混勻，進(jìn)行偶聯(lián)，超聲重懸2 min，恒溫?fù)u床2 h，1 h超聲重懸1次。偶聯(lián)結(jié)束后取沉淀依次加入微球封閉液和微球稀釋液超聲重懸2 min，即為熒光微球包被的鼠源多克隆抗體，4 ℃避光保存。利用三維噴點(diǎn)平臺(tái)將稀釋好的鼠源多克隆抗體標(biāo)記微球溶液噴涂到5 mm的玻璃纖維膜上，37 ℃烘箱過(guò)夜。將純化后的兔源多克隆抗體IgG、山羊抗兔用抗體稀釋液分別稀釋，用劃膜儀將稀釋好的兔源多克隆抗體和的山羊抗兔劃到NC膜上，作為T線和C線，再進(jìn)行試紙條的組裝。

1.9 POCT試紙的初步應(yīng)用

用待測(cè)樣品滴加至不同pH值的試紙上，確定多克隆抗體包被的最適pH值。收集的不同禽白血病的陽(yáng)性樣本、禽腺病毒的血清、組織稀釋液PBS，分4組檢測(cè)。向樣品孔加入80 μL待檢樣品，每隔30 s加另一個(gè)樣本，15 min后，將試紙條插入熒光讀數(shù)儀，在電腦上觀察結(jié)果，對(duì)NC膜上T峰和C峰的面積進(jìn)行匯總，計(jì)算T/C值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 32a-p27同源臂和6P-1-p27同源臂的擴(kuò)增 帶pET-32a同源臂特異性引物，擴(kuò)增出pET-32a-p27基因片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在730 bp附近出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致(圖1)。

M.DL2000 plus Marker；1，2.pET-32a-p27目的片段。M.DL2000 plus Marker；1，2.pET-32a-p27 target fragment.

帶pGEX-6P-1同源臂特異性引物，擴(kuò)增出pGEX-6P-1-p27基因片段PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在730 bp左右出現(xiàn)目的片段，與預(yù)期目的條帶大小一致(圖2)。

2.1.2 pET-32a-p27和pGEX-6P-1-p27重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-p27的篩選 重組質(zhì)粒菌液經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在720 bp附近出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致，符合預(yù)期結(jié)果(圖3)。

重組質(zhì)粒pET-32-p27的菌液經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在720 bp附近出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致(圖4)。

M.DL2000 plus Marker；1，2.pGEX-6P-1-p27目的片段。M.DL2000 plus Marker；1，2.pGEX-6P-1-p27 target fragment.

M.DL2000 plus Marker；1—3.pGEX-6P-1-p27重組質(zhì)粒。M.DL2000 plus Marker；1—3.pGEX-6P-1-p27 DNA recombinant plasmid.

M.DL2000 plus Marker；1—3.pET-32a-p27重組質(zhì)粒。M.DL2000 plus Marker；1—3.pET-32a-p27 DNA recombinant plasmid.

2.2 重組質(zhì)粒原核表達(dá)產(chǎn)物分析

2.2.1 His-p27和GST-p27融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 如圖5所示，當(dāng)誘導(dǎo)溫度16 ℃，IPTG 0.5 mmol/L，經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳顯示，His-p27融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性上清的形式存在。

10%的SDS-PAGE電泳表明，誘導(dǎo)溫度在28 ℃，IPTG為0.5 mmol/L時(shí)，可溶性目的蛋白的表達(dá)含量較高(圖6)。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-32a空質(zhì)粒；2.His-p27未誘導(dǎo)；3—5.His-p27全菌蛋白、上清和沉淀。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1—3.0.5 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)溫度分別為16，28，37 ℃的上清蛋白；4—6.0.5 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)溫度分別為16，28，37 ℃的包涵體；7—9.0.5 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)溫度分別為16，28，37 ℃的全菌蛋白。

2.2.2 His-p27和GST-p27融合蛋白的純化 當(dāng)溫度

為16 ℃，IPTG 濃度為0.5 mmol/L，His-p27融合蛋白純化的條帶清晰且無(wú)雜帶，達(dá)到預(yù)期效果(圖7)。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.上清；2—3.流穿液；4—9.洗脫蛋白。圖8同。M.Protein Marker weight standard；1.Supernatant；2—3.Protein flow-through fluid；4—9.Eluted protein.The same as Fig.8.

對(duì)GST-p27融合蛋白進(jìn)行純化，12.5%的SDS-PAGE電泳分析純化效果，如圖8所示，在28 ℃，IPTG 0.5 mmol/L，目的條帶明顯且無(wú)雜帶，洗脫結(jié)果良好。

4—8.洗脫蛋白。4—8.Eluted protein.

2.3 多克隆抗體的鑒定

2.3.1 鼠源多克隆抗體血清效價(jià)的測(cè)定 用間接ELISA方法檢測(cè)最后一次免疫后小鼠的血清，結(jié)果顯示(表1)，抗原最佳稀釋度為1∶1 600；在該抗原稀釋濃度下測(cè)定鼠源多克隆抗體血清效價(jià)，結(jié)果(表2)顯示，當(dāng)血清稀釋比例為1∶819 200時(shí)P/N為5.81>2，1∶1 638 400時(shí)P/N為1.10<2，所以鼠源多克隆抗體血清效價(jià)為1∶819 200。試驗(yàn)證明，制備鼠源多克隆抗體的免疫原活性良好，可刺激小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 鼠源抗原稀釋度Tab.1 Mouse-derived antigen dilution

2.3.2 兔源多克隆抗體血清效價(jià)的測(cè)定 兔血清進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，結(jié)果顯示(表3)，抗原最佳稀釋度為1∶1 600；在該抗原稀釋濃度下測(cè)定兔源多克隆抗體血清效價(jià)，結(jié)果顯示(表4)，當(dāng)血清稀釋比例為1：409 600時(shí)P/N為4.33>2，1∶819 200時(shí)P/N為1.95<2，所以兔源多克隆抗體血清效價(jià)為1∶409 600。試驗(yàn)證明，制備兔源多克隆抗體的免疫原活性良好，可刺激兔產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從兔血清分離出良好的多抗用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2 鼠源多克隆抗體血清效價(jià)Tab.2 Mouse-derived polyclonal antibody serum titer

表3 兔源抗原稀釋度Tab.3 Rabbit-derived antigen dilution

表4 兔源多克隆抗體血清效價(jià)Tab.4 Rabbit-derived polyclonal antibody serum titer

2.3.3 鼠源多克隆抗體Western Blot鑒定 如圖9所示，鼠源多克隆抗體與GST-p27融合蛋白在52 ku結(jié)合良好，表明鼠源多克隆抗體的反應(yīng)性和特異性良好。

1.pGEX-6P-1；2.GST-p27蛋白。1.pGEX-6P-1；2.GST-p27 protein.

2.3.4 兔源多克隆抗體Western Blot鑒定 如圖10所示，兔源多克隆抗體與His-p27融合蛋白在44 ku結(jié)合良好，表明兔源多克隆抗體的反應(yīng)性和特異性良好。

1.pET-32a；2.His-p27蛋白。1.pET-32a；2.His-p27 protein.

2.4 禽白血病病毒POCT檢測(cè)方法的建立

2.4.1 鼠源多克隆抗體-微球包被條件的確定 熒光免疫分析儀測(cè)定儀測(cè)定結(jié)果讀數(shù)如表5所示，微球偶聯(lián)鼠源多克隆抗體的最適pH值為6.2。

2.4.2 POCT試紙條的臨床檢驗(yàn)及其圖譜分析 將收集來(lái)的不同樣本用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，熒光免疫分析儀分析結(jié)果，將電腦顯示的T、C面積數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。圖11中T峰為直線，該檢測(cè)樣本與T線上的兔源多克隆抗體無(wú)免疫反應(yīng)，該樣本為陰性；圖12中T峰有明顯的起峰，證明樣本中與T線上兔源多克隆抗體反應(yīng)，該樣本為陽(yáng)性；圖13中 T峰有微弱的起峰，證明樣本中與T線上兔源多克隆抗體反應(yīng)，但是樣本中抗原含量不高。

2.4.3 POCT試紙條臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)分析 表6顯示，該P(yáng)OCT試紙條的特異性良好，禽白血的陽(yáng)性樣品與熒光微球包被的鼠源多克隆抗體結(jié)合良好，其T/C數(shù)據(jù)比其他樣本高，而其他樣本與微球上的鼠源多克隆抗體不結(jié)合，無(wú)T峰，T/C趨近于0。穩(wěn)定性良好，重復(fù)4組，每組數(shù)據(jù)差異不大。

表5 POCT試紙條讀數(shù)結(jié)果Tab.5 POCT test paper reading results

2.4.4 POCT試紙條臨床檢驗(yàn) 圖14-A是試紙條的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；圖14-B是組裝完畢的試紙條。取病禽組織樣本滴入樣品孔中，靜置 15 min后，用紫外聚光燈照射試紙條，可見(jiàn)熒光條帶，圖14-C表明，無(wú)論滴入的樣本是否和熒光微球包被的鼠源多克隆抗體結(jié)合，C線(質(zhì)控線)在紫外燈的照射下均有熒光條帶；僅有陽(yáng)性樣本和熒光微球包被的鼠源多克隆抗體結(jié)合后，在紫外燈的照射下，C線(質(zhì)控線)和T線(檢測(cè)線)才均會(huì)有熒光條帶。

圖11 陰性結(jié)果Fig.11 Negative result

圖12 陽(yáng)性結(jié)果Fig.12 Positive result

圖13 弱陽(yáng)性結(jié)果Fig.13 Weak positive

表6 POCT試紙條讀數(shù)結(jié)果Tab.6 POCT test paper reading results

3 結(jié)論與討論

禽白血病是腫瘤性疾病，其主要導(dǎo)致髓細(xì)胞瘤病和生理血管瘤。自1988年，ALV-J首次從患有髓樣白血病的肉型雞中分離出來(lái)，這種新型的ALV迅速在世界各地傳播。因?yàn)樯袩o(wú)針對(duì)ALV的有效藥物和疫苗，因此，目前的預(yù)防主要取決于檢測(cè)和淘汰，建立無(wú)外源ALV的家禽群。目前，針對(duì)ALV-p27抗原建立的ELISA試劑盒價(jià)格昂貴，不適合大規(guī)模檢驗(yàn)，所以建立一種新型快速便捷的檢測(cè)方法至關(guān)重要。POCT是在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中使用便攜式分析儀和快速診斷工具進(jìn)行的實(shí)時(shí)檢查，是當(dāng)前在臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)市場(chǎng)中發(fā)展最快的新型檢測(cè)方法。

A.試紙條組裝；B.試紙條成品；C.加入樣本后紫外燈照射下試紙條結(jié)果。A.Test strip assembly；B.Test strip finished product；C.Add sample after ultraviolet lamp irradiation test strip result.

本研究成功擴(kuò)增出ALV-p27的目的片段，克隆至pET-32a和pGEX-6P-1質(zhì)粒，構(gòu)建2個(gè)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。重組蛋白的表達(dá)量與溫度、時(shí)間、IPTG的濃度以及轉(zhuǎn)速都有關(guān)，本試驗(yàn)通過(guò)摸索不同的表達(dá)條件，最終使得2種融合蛋白均在上清中得到了良好的表達(dá)。將純化后的His-p27融合蛋白與佐劑等容量混合后作為免疫原免疫BALB/c小鼠，制備鼠源多克隆抗體，并用GST-p27蛋白交叉檢測(cè)小鼠的血清效價(jià)以及進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。同理，將純化后的GST-p27蛋白作為免疫原免疫新西蘭白兔，制備兔源多克隆抗體，并用His-p27蛋白交叉檢測(cè)新西蘭白兔的血清效價(jià)以及進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，以此避免標(biāo)簽蛋白的表達(dá)造成的假陽(yáng)性結(jié)果。選擇制備2個(gè)不同的多抗來(lái)代替單克隆抗體進(jìn)行POCT試紙條的組裝，是由于與制備單克隆抗體相比，制備多克隆抗體所花的時(shí)間和成本更少，且多克隆抗體的“多”克隆性允許結(jié)合靶標(biāo)的多個(gè)抗原決定簇，這使得多克隆抗體在某些測(cè)定中對(duì)多種靶蛋白、細(xì)胞或生物體更加敏感[21]。

本試驗(yàn)選擇鼠源多克隆抗體和熒光微球偶聯(lián)噴涂到結(jié)合墊，兔源多克隆抗體IgG作為檢測(cè)線包被到NC膜上；其次，要選擇合適pH值的包被稀釋液包被鼠源多克隆抗體，使熒光微球更容易和鼠源多克隆抗體結(jié)合，提高包被的成功率；兔源多克隆抗體作為檢測(cè)線(T線)，要摸索最佳的劃線濃度，濃度太低，導(dǎo)致熒光微球-鼠源多克隆抗體-抗原無(wú)法與兔源多克隆抗體結(jié)合，紫外燈下產(chǎn)生假陰性效果；最后，羊抗鼠IgG作為測(cè)試線(C線)，是評(píng)判試紙條質(zhì)量的好壞重要標(biāo)準(zhǔn)，所以確定最佳劃線濃度尤為重要。濃度太低，無(wú)法顯色，直接判斷試紙條無(wú)法使用；濃度太高，導(dǎo)致大部分熒光微球-鼠源多克隆抗體和羊抗鼠IgG結(jié)合，只有小部分熒光微球-鼠源多克隆抗體和兔源多克隆抗體結(jié)合，在紫外燈下，T線亮度很低，C線過(guò)亮，電腦結(jié)果顯示，與T/C面積比值小，造成弱陽(yáng)性甚至假陰性結(jié)果。肉眼觀察，無(wú)論滴入的樣本是否和熒光微球包被的鼠源多克隆抗體結(jié)合，C線在紫外燈的照射下均發(fā)出熒光；僅有陽(yáng)性樣本和熒光微球包被的鼠源多克隆抗體結(jié)合后，在紫外燈的照射下，C線和T線才均會(huì)發(fā)出熒光；若C線未發(fā)出熒光，而T線發(fā)出熒光，表明試紙條損壞，檢測(cè)結(jié)果不具有說(shuō)服力。

本研究基于多抗包被在試紙條，組織研磨液作為待檢樣本，靈敏度和特異性有待提高，而且作為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的便攜式儀器，可以將多抗轉(zhuǎn)換成單抗或者提高包被濃度和劃線濃度以提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。