納米酶在食品檢測中的應(yīng)用研究進展

李芙蓉，向發(fā)椿，曹麗萍，邵 勇，佘永新，鄭鷺飛，金茂俊，金 芬，王 靜，李崇瑛*，王珊珊,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081；2.成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，四川 成都 610059）

食品安全問題已成為全世界共同面臨的重大挑戰(zhàn)，其不僅會對人類健康造成巨大危害，還會嚴(yán)重制約進出口貿(mào)易及工業(yè)發(fā)展[1-2]。因此，開發(fā)高效的食品安全精準(zhǔn)檢測技術(shù)對保障食品安全至關(guān)重要。氣相色譜、高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等色譜方法是當(dāng)前食品安全監(jiān)測中最常用的檢測技術(shù)[2-4]。雖然其具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點，但也存在設(shè)備較為昂貴、耗時長、操作相對復(fù)雜、對技術(shù)人員專業(yè)要求高等缺點，無法滿足食品生產(chǎn)、加工、流通和銷售全鏈條實時有效監(jiān)控的需求[1]。因此，開發(fā)簡單、準(zhǔn)確、經(jīng)濟的現(xiàn)場快速檢測技術(shù)成為研究熱點。

天然酶具有催化活性高、底物特異性強等優(yōu)點，作為核心識別材料或標(biāo)記物在酶抑制法和免疫分析法等常用快速檢測技術(shù)中發(fā)揮著重要作用。但受其本身的局限性，諸如難以制備和提純、成本高、穩(wěn)定性差、貯存條件苛刻等的影響，限制了其應(yīng)用和推廣[5]。鑒于此，部分環(huán)糊精、金屬復(fù)合物、聚合物、超分子化合物、納米酶等人工模擬酶相繼被開發(fā)出來。納米酶是一類具有類酶催化活性的納米材料[1]。自2007年研究人員發(fā)現(xiàn)磁性Fe3O4納米材料本身具有類似辣根過氧化物酶（peroxidase horseradish，HRP）的催化活性[6]，可催化H2O2氧化四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）和鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）等顯色底物顯色后，納米酶備受矚目，已成為分析傳感、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域的研究熱點[7-8]。金屬（單金屬及合金）納米材料[8]、碳納米管[9]、石墨烯及其衍生物[10]、鈰氧化物[11]、釩氧化物[12]、鈷氧化物[13]等一系列納米材料被發(fā)現(xiàn)具有類酶活性。與天然酶相比，納米酶除具有穩(wěn)定性高、成本低、可批量生產(chǎn)、貯存期長等優(yōu)點外，其表面易修飾和功能可裁剪的特性為實現(xiàn)不同場景的應(yīng)用提供了可能[14]。

近年來，隨著納米科學(xué)、傳感技術(shù)、理論計算等領(lǐng)域的發(fā)展，納米酶在食品安全領(lǐng)域取得了突飛猛進的發(fā)展，展現(xiàn)出極具潛力的應(yīng)用前景[1,15-16]。本文結(jié)合近年來國內(nèi)外的相關(guān)研究成果，詳述貴金屬、金屬氧化物、碳材料、金屬有機框架材料等常見納米酶材料的模擬酶特性及其催化機理，納米酶傳感器的原理及其在農(nóng)藥、獸藥、無機離子、真菌毒素、食源性病原體、違禁添加物、酚類化合物等食品污染物快速檢測領(lǐng)域中最新應(yīng)用進展，最后在此基礎(chǔ)上，展望了納米酶應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)和未來發(fā)展趨勢，以期為新型納米模擬酶傳感器的設(shè)計、性能提升及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 納米酶類型及催化機理

納米酶是一類具有類酶活性的納米材料。由于其獨特的物理化學(xué)性質(zhì)，已成為最具前景的天然酶替代材料之一，在分析傳感、疾病診斷和治療、環(huán)境保護、抗菌等方面展示出巨大的應(yīng)用前景[7-8,15-16]。依據(jù)催化活性，可將納米酶分為類過氧化物酶、類過氧化氫酶、類超氧化物歧化酶、類氧化酶和類水解酶等[7]。納米酶催化活性主要取決于表面電子轉(zhuǎn)移過程。為設(shè)計新型納米酶材料、提高其催化活性、拓寬其應(yīng)用范圍，近年來，研究者利用電子自旋共振技術(shù)（electron spin resonance，ESR）、密度泛函理論（density functional theory，DFT）計算、X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）、電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）、酶穩(wěn)態(tài)動力學(xué)表征等多種技術(shù)對納米酶的催化機理開展了理論研究。目前，研究人員已發(fā)現(xiàn)金屬、金屬氧化物/硫化物、碳納米材料、金屬有機框架材料等納米材料具有模擬酶活性，并對其催化活性和催化機理進行了分析探索。

1.1 貴金屬納米酶

常見的貴金屬納米酶主要包括金（Au）、銀（Ag）、鉑（Pt）、鈀（Pd）等及其所形成的合金材料。這些納米酶大多具有類氧化酶、類過氧化物酶、類過氧化氫酶、類超氧化物歧化酶以及類水解酶等多種催化活性，其中以其作為過氧化物酶和氧化酶在分析傳感領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛。貴金屬納米酶的催化活性緣于其表面對底物的吸附、活化和電子轉(zhuǎn)移，受材料尺寸、形貌、表面修飾物、pH值等因素影響。Shen Xiaomei等[8]通過DFT計算和輔助實驗對貴金屬Au、Ag、Pt、Pd及其合金的類氧化酶和類超氧化物歧化酶活性進行研究。結(jié)果表明，貴金屬可通過催化氧氣分子分解為氧原子進而吸附TMB、抗壞血酸等有機底物中的氫原子，從而實現(xiàn)氧氣對底物的氧化（方程（1）、（2）），且其活性取決于金屬組成和晶面暴露程度，催化活性從高到低依次為Pd（111）＞Pt（111）＞＞Au（111）、Ag（111）。當(dāng)作為超氧化歧化酶時，其催化機理如方程（3）～（4）所示，O2-·可與水反應(yīng)生成HO2·，而HO2·極易被吸附在重金屬表面重排生成H2O2和O2（圖1）。

圖1 HO2·在Au（111）（A）和Pt（111）（B）晶面上重排機理[8]Fig.1 Rearrangements of two HO2· groups on (111) facets of Au (A)and Pt (B)[8]

此外，研究者也對貴金屬的類過氧化物酶活性和類過氧化氫酶活性也進行了探討。相關(guān)研究表明貴金屬對過氧化氫的催化機理主要受pH值影響，在低pH值條件下H2O2在金屬表面發(fā)生堿性分解，貴金屬（Au、Ag、Pd和Pt）表現(xiàn)出類過氧化物酶活性，而在高pH值條件下，H2O2在金屬表面發(fā)生酸性分解，表現(xiàn)出類過氧化氫酶活性[17]。

1.2 金屬氧化物

金屬氧化物基納米酶主要指過渡金屬氧化物，包括鐵氧化物、鈰氧化物、錳氧化物、銅氧化物、鈷氧化物、釩氧化物等。與貴金屬基納米酶不同，金屬元素價態(tài)的改變對其催化活性起著決定作用。

鐵氧化物納米酶包括Fe3O4、Fe2O3、MFe2O4（M為鈷（Co）、錳（Mn）、鋅（Zn））等，可模擬過氧化物酶、氧化酶和過氧化氫酶等天然酶的催化活性。其中，F(xiàn)e3O4納米粒子自被發(fā)現(xiàn)可催化H2O2-TMB顯色反應(yīng)以來，由其生物相容性好、易于修飾且具有獨特的磁學(xué)特性，在H2O2、葡萄糖、有機污染物等傳感分析檢測方面取得了廣泛的應(yīng)用[18]。穩(wěn)態(tài)動力學(xué)和催化實驗表明，其催化H2O2-TMB反應(yīng)的機理為乒乓機理，與HRP相比，其對H2O2親和力減弱，對TMB親和力增強，溫度和酸堿耐受性更強[6]。分子機理研究表明，F(xiàn)e2+和Fe3+之間的轉(zhuǎn)化是其呈現(xiàn)高過氧化物酶活性的關(guān)鍵。其催化反應(yīng)動力學(xué)曲線也基本符合米氏動力學(xué)規(guī)律。

鈰氧化物納米粒子由于同時存成Ce3+和Ce4+兩種價態(tài)，且具有氧空位結(jié)構(gòu)，因而具備了多種酶活性，比如過氧化物酶、過氧化氫酶、氧化酶和超氧化物歧化酶[11]。氧化鈰中Ce3+/Ce4+比例以及溶液pH值對其類酶活性具有重要影響。Asati等[19]發(fā)現(xiàn)氧化鈰可在無外加氧化劑的情況下使有機底物顯色，證明其具有氧化酶活性，并將其作為HRP酶的替代物用于酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）中。研究結(jié)果表明，酸性條件和減小粒徑尺寸有利于提高其氧化酶活性。Heckert等[20]的研究表明Ce3+/Ce4+也能發(fā)生類芬頓反應(yīng)，催化H2O2產(chǎn)生羥自由基，其催化機理如方程（5）～（7）。隨后，Jiao Xue等[21]證明了氧化鈰納米粒子具有類過氧化物酶活性，并采用比色法實現(xiàn)了葡萄糖的快速測定。Pirmohamed等[22]研究發(fā)現(xiàn)氧化鈰還具有類過氧化氫酶活性和類超氧化物歧化酶活性，并通過EPR分析證明當(dāng)氧化鈰納米粒子Ce3+/Ce4+比例相對較低時，類過氧化氫酶活性占主導(dǎo)地位，反之，類超氧化物歧化酶活性占主導(dǎo)地位。當(dāng)其作為超氧化物歧化酶時，催化機理如方程（8）～（9）所示；當(dāng)其作為過氧化氫酶時，通過兩個半反應(yīng)催化H2O2，一個H2O2分子與Ce4+通過氧化還原反應(yīng)生成質(zhì)子、氧氣和Ce3+；另一個H2O2分子結(jié)合在氧空位上，將Ce3+氧化為Ce4+并釋放出H2O分子[23]。

除鐵氧化物和鈰氧化物外，研究者也開發(fā)了GeO2、V2O5以及Co3O4等金屬氧化物納米酶。Liang Xin等[15]采用水熱法合成了只具有類過氧化物酶活性而不具備氧化酶活性GeO2納米酶。穩(wěn)態(tài)動力學(xué)和·OH熒光測試結(jié)果表明，與HRP和Fe3O4等不同，其催化H2O2氧化TMB過程中，不產(chǎn)生·OH和O2-·等自由基，而是生成GeO2-H2O2-TMB三元復(fù)合物中間體。V2O5納米顆粒具有類鹵素過氧化物酶、類谷胱甘肽過氧化物酶和類氧化酶活性，可在H2O2存在下催化鹵離子生成次鹵酸、催化谷胱甘肽生成氧化型谷胱甘肽，也可在不加H2O2條件下催化TMB顯色，用于谷胱甘肽的比色法測定[12]。Mu Jianshuai等[24]發(fā)現(xiàn)Co3O4納米粒子具有類過氧化物酶和類過氧化氫酶活性。穩(wěn)態(tài)動力學(xué)實驗表明，其對底物TMB的親和力高于HRP，對底物H2O2的親和力低于HRP，其類過氧化物酶活性緣于Co3O4納米酶加速TMB與H2O2間轉(zhuǎn)移電子，而不是因為羥自由基的生成。Qin Wenjie等[13]發(fā)現(xiàn)Co3O4具有氧化酶活性，研究表明，Co3O4的類氧化酶催化活性并非源自·OH或O2-·自由基的產(chǎn)生，而是來源于Co3O4納米酶加速TMB和吸附在其表面的氧氣間的電子轉(zhuǎn)移。

1.3 碳基納米材料的催化機理

碳基納米材料主要包括富勒烯、石墨烯、碳納米管及它們的衍生物等，因其獨特的物理化學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)引起了科學(xué)家們對其作為模擬酶的研究興趣。目前碳基納米材料已被證實具有類過氧化物酶、類超氧化物歧化酶和類水解酶活性[25]，其中以其作為過氧化物酶模擬酶的機理研究和應(yīng)用最為廣泛。

Li Ruimin等[10]發(fā)現(xiàn)富勒烯的衍生物C60[C(COOH)2]2具有類過氧化物模擬酶活性。研究表明，C60[C(COOH)2]2類過氧化酶活性主要與C60獨特的電子共軛結(jié)構(gòu)有關(guān)，TMB通過π-π相互作用吸附在碳籠表面，其分子內(nèi)氨基的孤對電子轉(zhuǎn)移至碳籠，使碳籠的電子密度和遷移率得以提高，進而加速了碳籠到H2O2的電子轉(zhuǎn)移。Sun Hanjun等[26]通過對其表面—C＝O、—O＝CO—、—C—OH等不同官能團進行消除，結(jié)合實驗數(shù)據(jù)和理論計算對GODs的類過氧化物酶催化機理進行了探索。結(jié)果表明，—C＝O和—O＝CO—分別作為催化活性位點和底物結(jié)合位點，對石墨烯量子點（graphene quantum dots，GODs）納米酶活性具有促進作用，而—C—OH的存在會抑制GODs的催化活性。Zhao Ruisheng等[9]利用DFT進一步從分子層面揭示了納米碳氧化物的類過氧化物酶催化機理。結(jié)果表明，共軛大π鍵的存在對其類過氧化物酶活性至關(guān)重要，—COOH可輔助H2O2產(chǎn)生·OH進而氧化TMB。此外，單壁碳納米管、螺旋狀碳納米管、光致發(fā)光氮化碳點、多色發(fā)光碳納米顆粒和碳量子點也都被證明具有過氧化物酶的活性[10]。

為進一步提高碳基納米酶的催化活性、賦予材料新的性能，研究者們采用摻雜技術(shù)和雜化技術(shù)，開發(fā)了Co、Cu、Fe等金屬或非金屬摻雜碳基納米材料以及血紅素/石墨烯、納米金/石墨烯、普魯士藍/碳納米管等納米雜化材料，拓展了碳基納米材料作為納米酶在生物傳感等方面的應(yīng)用。例如，Mu Jianshuai等[27]制備了Co摻雜的類石墨相碳化氮（Co-g-C3N4），并發(fā)現(xiàn)Co摻雜有利于TMB-g-C3N4-H2O2間的電子轉(zhuǎn)移，可顯著提升g-C3N4的類過氧化物酶活性。Qiu Na等[28]設(shè)計合成了三維石墨烯磁性納米材料（three-dimensional graphene/mesoporous Fe3O4，3D GF/M-Fe3O4），并發(fā)現(xiàn)由于3D GF和M-Fe3O4的協(xié)同作用，復(fù)合材料類過氧化酶活性遠(yuǎn)高于3D GF和M-Fe3O4。

1.4 金屬有機框架材料的催化機理

金屬有機框架化合物（metal organic frameworks，MOFs）是由無機金屬離子和有機配體通過配位鍵自組裝得到的具有特定孔徑結(jié)構(gòu)的多孔納米材料。由于其具有比表面積大、易于修飾、孔道多樣、功能可調(diào)、富含不飽和金屬中心等特點，已成為納米酶領(lǐng)域的研究熱點。

Fe、Co、Cu是常用的構(gòu)建MOFs基納米酶的金屬中心。據(jù)報道，MIL-53(Fe)、MIL-68、MIL-100、MIL-101、Fe-MIL-88NH2等MIL系列MOFs、Cu-MOFs、Co-MOFs以及Co/2Fe-MOFs均具有類過氧化物酶活性[14]，其催化機理為芬頓/類芬頓反應(yīng)，催化H2O2生成·OH。此外，Ce-MOFs可作為氧化酶的模擬酶[29]。與CeO2相比，Ce-MOFs具有更高的類氧化酶活性，這可能是其具有較大的比表面積且與TMB間有較強的π-π相互作用引起的。除MOFs自身具有模擬酶活性外，還可通過對MOFs進行化學(xué)修飾或者制備MOFs復(fù)合物提高催化性能。Chen Weihai等[30]首先以2,2-二吡啶-5,5-二羧酸為有機配體，以Zr4+為金屬中心制備了UiO（University of Oslo）型MOFs，再通過Cu2+與聯(lián)吡啶配位獲得了Cu2+后修飾的MOFs基納米酶Cu2+-NMOFs。研究表明，與Cu2+單獨使用或Cu2+與聯(lián)吡啶混合使用相比，Cu2+-NMOFs對H2O2-多巴胺的催化效率顯著提高，說明Cu2+-NMOFs的催化活性緣于Cu2+-雙吡啶復(fù)合物和MOFs的協(xié)同作用。此外，Cu2+-NMOFs還可催化H2O2-Amplex紅、H2O2-魯米諾、H2O2-NADH等反應(yīng)體系，有利于實現(xiàn)多目標(biāo)的多模式檢測。He Li等[31]采用原位合成法制備了AuNPs/MOFs納米復(fù)合物，結(jié)果表明，該法制備的AuNPs/MOFs對H2O2-TMB的催化效率遠(yuǎn)高于物理混合物制備的AuNPs/MOFs以及AuNPs或MOFs單獨使用，推測其較高的催化活性是AuNPs和MOFs的協(xié)同作用加速了自由基·OH、O2-·、O2的生成導(dǎo)致的。

除MOFs外，MOFs衍生物也被發(fā)現(xiàn)具有類酶活性[32]。例如，Li Siqi等[33]以ZIF-67為前驅(qū)體，通過熱解一步制備了具有氧化酶活性的Co、N共摻雜的多孔碳納米雜化物（Co,N co-doped hierarchically porous carbon，Co,NHPC），可有效催化O2氧化TMB、1,2-二氨基苯和2,2’-疊氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽等顯色劑顯色。活性氧測試結(jié)果表明，在催化反應(yīng)中主要生成了O2和O2·自由基。Co,N-HPC的高比表面積和多孔結(jié)構(gòu)使溶解氧得以快速擴散到催化活性位點。

2 納米酶在食品檢測中的應(yīng)用

納米酶由于具有活性可調(diào)、功能可控、易于修飾、成本低、易于批量生產(chǎn)、環(huán)境耐受性好、穩(wěn)定性高等獨特優(yōu)勢，近年來，作為天然酶的新興替代物，在食品安全領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。研究者利用污染物與納米酶的相互作用、污染物對納米酶催化體系的調(diào)控作用、或?qū)⒓{米酶作為標(biāo)記物，開發(fā)出大量基于納米酶的高性能光學(xué)、電化學(xué)、質(zhì)量型傳感器，用于食品中農(nóng)藥、獸藥、真菌毒素、病原體、重金屬、違禁添加物等污染物的檢測（表1）。

表1 納米酶在食品檢測中的應(yīng)用Table 1 Applications of nanozymes in food safety detection

續(xù)表1

2.1 農(nóng)藥殘留檢測

農(nóng)藥在防治農(nóng)作物病蟲害、提高農(nóng)作物品質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的投入品。然而隨著農(nóng)藥的廣泛使用，尤其是其過量和不合理使用，所造成的農(nóng)產(chǎn)品、水、土壤和空氣中農(nóng)藥殘留污染問題日益突出。由于大多數(shù)農(nóng)藥難以降解，且具有一定的毒性，殘留在食品和環(huán)境中的農(nóng)藥通過食物鏈、呼吸和皮膚接觸進入人體后，會導(dǎo)致慢/極性中毒，對人體造成較大危害。為實現(xiàn)農(nóng)藥殘留的快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測，研究者們開發(fā)出一系列基于納米酶的農(nóng)藥殘留快速分析方法并取得了較好的應(yīng)用效果。

Fe3O4納米酶首先被開發(fā)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析。Guan Guijian等[34]將Fe3O4作為過氧化物酶模擬酶催化魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在乙醇存在的情況下，超氧陰離子被清除，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)被顯著抑制，進而通過滅線磷和乙醇與Fe3O4納米粒子的競爭結(jié)合作用，建立了turn-on模式的有機磷化學(xué)發(fā)光檢測方法。隨后，研究者們報道了基于CeO2

[35]、GeO2[15]、NiO[36]等金屬氧化物納米酶的農(nóng)藥殘留速測方法。Wei Jinchao等[35]研究發(fā)現(xiàn)CeO2具有類磷酸水解酶活性，可催化甲基對氧磷水解生成黃色的對硝基苯酚，進而以熒光碳點為探針，通過對硝基苯酚對碳點熒光的猝滅作用，實現(xiàn)了花旗參和飲用水中甲基對氧磷的熒光速測，檢出限為3.75×10-2nmol/L。Liang Xin等[15]合成了具有類過氧化物酶活性的GeO2納米顆粒，可在H2O2存在下催化TMB顯色，進一步將其與酶抑制法聯(lián)用，構(gòu)建了GeO2-乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）反應(yīng)體系用于有機磷農(nóng)藥的檢測。其檢測機理為乙酰硫代膽堿在AChE作用下水解生成可降解GeO2的硫代膽堿，抑制顯色反應(yīng)發(fā)生；而當(dāng)體系中存在對氧磷時，AChE活性被抑制，顯色反應(yīng)得以進行。結(jié)果表明，所制備的GeO2納米酶在pH 4～7條件下均具有較高催化活性，熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性均優(yōu)于HRP，此外，與Fe3O4、NiFe2O4、Co3O4、CuO等類過氧化物酶相比，具有更高的催化速率（vm＝23.4×10-8mol/（L·s））和底物親和力，且極易被硫代膽堿降解；同時，由于其只具備過氧化物酶活性、不具備氧化酶活性，且為白色，顯著消除了納米粒子自身顏色和內(nèi)在氧化活性對比色檢測的干擾，因此大大提高了結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度。該法線性范圍為1×10-13～5×10-11mol/L，檢測限為1.4×10-5nmol/L，為實現(xiàn)水和果汁中有機磷農(nóng)藥殘留量的精準(zhǔn)測定提供了新途徑。Khairy等[36]開發(fā)了一種簡單靈敏的基于NiO納米酶修飾的絲網(wǎng)印刷電極。由于NiO對對硫磷具有較強的吸附作用，該電化學(xué)傳感器檢測限為24 nmol/L，靈敏度高、抗干擾能力強，可實現(xiàn)對水、尿液和蔬菜等多種樣品中有機磷殘留量的快速測定。

除金屬氧化物外，貴金屬、碳納米材料也作為模擬酶廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的快速測定。Singh等[37]利用馬拉硫磷對Pd-Au納米棒類過氧化物酶活性的抑制作用，以鄰苯二胺為顯色底物，基于Pd-Au納米棒催化H2O2氧化鄰苯二胺顯色，提出了一種簡單、靈敏、無標(biāo)記的馬拉硫磷比色測定法，檢出限為1.8×102nmol/L，低于我國GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定飲用水中馬拉硫磷的限量值（0.05 mg/L）。研究結(jié)果表明，所制備的Pd-Au納米酶在酸性條件（pH 2.0～6.0）具有較高催化活性，在堿性條件下，活性較低，動力學(xué)參數(shù)Km和Kcat均優(yōu)于HRP，且由于其對馬拉硫磷分子中R—S—R’基團較強的親和力，使得馬拉硫磷對其催化位點具有較強的吸附抑制作用，從而使該法對巴拉松、毒死蜱等有機磷以及硫酸鋅等金屬鹽無交叉反應(yīng)，具有超高的選擇性。為進一步提高特異性，Weerathunge等[38]以核酸適配體為識別元件，利用銀納米粒子的類過氧化物酶活性，對毒死蜱進行了比色法測定。該法檢測原理為當(dāng)核酸適配體吸附在Ag表面時，可有效抑制Ag納米酶活性，從而減弱H2O2-TMB顯色反應(yīng)程度；當(dāng)體系中加入毒死蜱，適配體從納米酶表面解離，納米酶活性得以恢復(fù)，顯色反應(yīng)增強。結(jié)果表明，與敵敵畏等其他有機磷及噻蟲嗪等非有機磷農(nóng)藥相比，該法對毒死蜱具有較好的特異性和選擇性，檢出限為3.2×104nmol/L，低于GB 5749—2006規(guī)定飲用水中毒死蜱的限量值（0.03 mg/L），可滿足檢測需求。本課題組以分子印跡聚合物為識別材料，以半抗原修飾的PtNPs為三唑磷競爭物，利用PtNPs的類過氧化物酶活性催化H2O2氧化TMB生成具有較強拉曼信號的藍色氧化產(chǎn)物TMB2+，實現(xiàn)了水和梨中三唑磷的比色法和表面拉曼增強光譜法雙模式測定，檢出限為3.2 nmol/L[7]，低于歐盟標(biāo)準(zhǔn)（EU）2017/626《歐盟農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫-農(nóng)藥殘留和最大殘留水平》規(guī)定的梨中三唑磷的最大殘留限量（0.01 mg/kg）。Zhu Yunyao等[16]制備了具有類過氧化物酶活性的氮摻雜石墨烯、氮/硫摻雜石墨烯和石墨烯氧化物3 種納米酶材料，并用其構(gòu)建了檢測芳香族農(nóng)藥的比色納米酶傳感器陣列（圖2）。3 種雜原子摻雜的石墨烯納米酶可催化H2O2氧化TMB，發(fā)生明顯的顯色反應(yīng)；當(dāng)芳香族農(nóng)藥被石墨烯吸附時，納米酶的活性位點被掩蓋，導(dǎo)致其類過氧化物酶活性降低，顯色程度減弱。由于不同的芳香族農(nóng)藥對3 種納米酶的抑制作用不同，所制備的納米酶傳感器陣列可成功分辨出5×103～5×105nmol/L的5 種農(nóng)藥，并區(qū)分每種農(nóng)藥的不同濃度以及兩種混合農(nóng)藥的不同比例。該研究提供了一種交叉響應(yīng)且成本經(jīng)濟的速測方法，為農(nóng)藥的殘留測定提供了新思路。

圖2 基于雜原子摻雜的石墨烯納米酶農(nóng)藥陣列檢測示意圖[16]Fig.2 Schematic diagram of nanozyme sensor arrays based on heteroatom-doped graphene for detecting pesticides[16]

納米酶的活性對檢測靈敏度和準(zhǔn)確度具有重要影響，設(shè)計合成雜化材料是提高納米酶活性的有效手段。Chang Yachu等[39]合成了CuO/MWCNTs納米雜化材料。結(jié)果表明，CuO/MWCNTs比MWCNTs具有更高的類過氧化物酶催化活性，可通過加速電子轉(zhuǎn)移過程有效催化H2O2氧化熒光紅燃料，進而通過草甘膦對其活性的吸附抑制作用，構(gòu)建了水中草甘膦的熒光速測方法。該法不僅靈敏度高（檢出限為4.0 nmol/L，低于GB 5749—2006規(guī)定的飲用水中草甘膦的限量值0.7 mg/L），且對草甘磷具有良好的選擇性，在快速篩查草甘磷方面具有較好的應(yīng)用前景。Bagheri等[40]開發(fā)了一種具有類過氧化物酶活性的Fe3O4@ZIF-8納米酶，并結(jié)合AChE和膽堿氧化酶（choline oxidase，CHO），以對苯二甲酸為熒光底物，通過Fe3O4@ZIF-8對H2O2-對苯二甲酸的催化反應(yīng)和二嗪農(nóng)對AChE的抑制作用構(gòu)建了二嗪農(nóng)的熒光傳感器。研究表明，所制備的Fe3O4@ZIF-8較Fe3O4和ZIF-8具有更高的類過氧化物酶活性，且具有優(yōu)異的磁性和穩(wěn)定性，至少可重復(fù)回收利用10 次。該法線性范圍為0.5～500.0 nmol/L，檢測限為0.2 nmol/L，可實現(xiàn)水和果汁中有機磷農(nóng)藥的準(zhǔn)確快速測定。

2.2 金屬離子檢測

重金屬離子難以生物降解，且極易通過食物鏈大量蓄積在人體內(nèi)，對人體消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)造成不可逆的傷害，危害極大。因此，開發(fā)靈敏、快速、簡便的重金屬檢測方法，一直是食品安全監(jiān)測領(lǐng)域的研究熱點。

研究表明，金屬粒子可增強或抑制納米酶的催化活性。據(jù)此，Gao Zhuangqiang等[41]設(shè)計了一種具有類過氧化物酶活性的聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）修飾的鉑納米立方顆粒（Pt@PVP），通過Ag+對其表面活性位點的吸附占據(jù)所導(dǎo)致的模擬酶活性減弱，H2O2-TMB顯色反應(yīng)程度降低，構(gòu)建了一種檢測水中Ag+的比色傳感器（圖3）。該傳感器線性范圍為10-5～10-7mol/L，與其他基于納米金的比色法相比，具有靈敏度高（檢測限為8×10-2nmol/L）、響應(yīng)速度快（6 min）等優(yōu)勢，且由于Ag+和Pt@PVP間面心立方晶格和PVP的協(xié)同相互作用，對Ag+顯示出較強的特異性，抗干擾能力強，可滿足我國對自來水中Ag的檢測需求（限量值為0.05 mg/L）。氨基酸對納米酶反應(yīng)催化體系具有一定調(diào)控作，基于納米酶-氨基酸-金屬離子三者相互作用，研究人員開發(fā)了系列檢測方法。Zhang Wenchi等[42]采用組氨酸（His）對鈀納米粒子（Pd nanoparticles，PdNPs）的類過氧化物酶活性進行調(diào)控。His修飾可改變PdNPs的粒徑大小、元素價態(tài)和表面性質(zhì)，與純PdNPs相比，His-Pd納米酶尺寸更小、Pd0（零價態(tài)Pd）含量更高、親水性更好，因而其對H2O2-TMB顯色反應(yīng)的催化能力得以顯著提高。而當(dāng)體系中存在Ag+時，Ag+與His間的強相互作用可將His改性劑從納米酶表面剝落，從而降低其催化活性。利用該原理在可在30～300 nmol/L的線性范圍內(nèi)實現(xiàn)了對水中Ag+的準(zhǔn)確特異性測定，檢測限為4.7 nmol/L?；贖g2+和半胱氨酸（Cys）的相互作用，Mohammadpour等[43]以碳點（carbon dots，CDs）作為過氧化物酶模擬酶開發(fā)了比色傳感器，Hg2+檢出限為23 nmol/L。半胱氨酸作為一種強大的抗自由基生物分子，當(dāng)其加入反應(yīng)體系后，能夠成功抑制陽離子自由基的生成，阻止底物TMB的藍色氧化產(chǎn)物出現(xiàn)。而Hg2+對半胱氨酸具有較強的親和力，使得顯色產(chǎn)物藍色陽離子正常生成，顯色程度隨Hg2+濃度增加而增強。聚集誘導(dǎo)發(fā)光增強效應(yīng)在傳感分析領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，因此，研究者們開始探索聚集效應(yīng)對納米酶活性的影響。Liao Hong等[44]研究發(fā)現(xiàn)Pb2+可通過誘導(dǎo)谷胱甘肽修飾的AuNCs聚集從而極大地提高AuNPs的類過氧化物酶活性（對H2O2-TMB反應(yīng)的催化活性提高了近10 倍）。在此基礎(chǔ)上，建立了一種簡便、可靠的比色法用于Pb2+檢測，線性范圍為2.0×103～2.5×105nmol/L，檢測限為2×103nmol/L，在環(huán)境和食品樣品中重金屬離子速測方面具有較好的潛在應(yīng)用價值。Jiang Cuifeng等[45]證明了Hg2+對殼聚糖修飾的AuNPs類過氧化物酶活性具有聚集誘導(dǎo)增強效應(yīng)，并據(jù)此建立了一種免標(biāo)記、簡單、快速的Hg2+可視化檢測方法。

圖3 基于PVP修飾的Pt納米酶的Ag＋比色法檢測原理[41]Fig.3 Schematic illustration of the principle of the PVP-capped Pt nanozyme assay for colorimetric detection of Ag+[41]

K+、Fe2+等雖然是人體必需的金屬離子，但其攝入過量也會對人體健康造成較大威脅，因此，建立該類離子的速測方法對保障人體健康也具有重要意義。Chen Zhengbo等[46]研究表明在AuNPs表面修飾K+的核酸適配體可通過提高AuNPs負(fù)電荷密度增強AuNPs與帶正電的TMB的親和力，進而提高電子轉(zhuǎn)移速度，增強AuNPs的類過氧化物酶活性；而當(dāng)目標(biāo)離子K+存在時，適配體與K+特異性結(jié)合并離開AuNPs表面，導(dǎo)致AuNPs催化活性下降。Chen Zhengbo等利用該原理制備了一種簡單靈敏的比色傳感器，用于K+測定，該法檢測限為6×10-2nmol/L，靈敏度比其他光學(xué)檢測方法提高了2～9 個數(shù)量級，且具有較好的選擇性。與目標(biāo)物抑制納米酶催化活性不同。有研究表明Fe2+可以顯著提高MoS2納米片類過氧化物酶的活性[47-48]。研究者基于這種協(xié)同增強效應(yīng)分別構(gòu)建了免標(biāo)記的比色和熒光傳感器，用于測定水中Fe2+，檢出限分別為7 nmol/L和3.5 nmol/L。

2.3 獸藥殘留檢測

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，獸藥被廣泛應(yīng)用于動物疾病的預(yù)防、控制和治療以及動物生理機能的調(diào)節(jié)。然而過量殘留在肉、蛋、奶等動物源性食品中的獸藥及其代謝物將通過食物鏈累積，對人類健康造成威脅。因此，建立快速、有效、可靠的獸藥殘留檢測方法，對保障國民安全具有重大意義。近年來，研究人員已基于納米酶開發(fā)出靈敏、經(jīng)濟、可靠、便捷的獸藥檢測方法，并成功用于牛奶[50,52-53]、蜂蜜[50-51]、雞蛋[50]等樣品的檢測。

抗生物分子可直接與納米酶發(fā)生相互作用進而調(diào)節(jié)其催化活性，基于此，Wang Yilin等[49]構(gòu)建了基于Fe3O4NPs的比色傳感器，用于測定四環(huán)素類抗生素。四環(huán)素類抗生素分子對Fe3O4表面的Fe2+和Fe3+具有很強的親和力，所形成的Fe3O4-四環(huán)素復(fù)合物可通過芬頓反應(yīng)催化H2O2氧化TMB，且對H2O2-TMB的催化反應(yīng)效率優(yōu)于Fe3O4NPs。該方法對土霉素、四環(huán)霉素、強力霉素的檢出限分別為26、45、48 nmol/L。

獸藥殘留具有濃度低、殘留種類多樣以及所處于的樣品基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)多等特點。如將納米酶與特異性識別元件相結(jié)合，將有效提高檢測靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性，解決痕量獸藥難以精準(zhǔn)定量的問題?？贵w可有效識別目標(biāo)物，提高檢測精準(zhǔn)度。Chang Honghong等[50]制備了殼聚糖修飾的AgI/TiO2納米粒子，該復(fù)合材料在pH 3下具有優(yōu)異的光催化活性。由于AgI和TiO2能級匹配，AgI/TiO2異質(zhì)結(jié)有利于光生電子和空穴的分離，光生空穴可促使TMB氧化，光生電子可通過還原O2生成超氧陰離子自由基從而氧化TMB，進而將抗體偶聯(lián)在AgI/TiO2上，Chang Honghong等[50]通過磁珠標(biāo)記氯霉素和氯霉素對抗體的競爭結(jié)合作用，開發(fā)了氯霉素的光響應(yīng)比色法免疫分析法。結(jié)果表明，由于復(fù)合材料的光催化活性優(yōu)于AgI和TiO2自身，基于AgI/TiO2構(gòu)建的比色傳感器靈敏度優(yōu)于基于AgI和TiO2構(gòu)建的比色傳感器，此外，該傳感器僅需加入底物TMB，無需使用H2O2，靈敏度高（檢出限為3×10-2nmol/L）、特異性好、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高，可成功應(yīng)用于牛奶、蜂蜜、雞蛋等多種復(fù)雜基質(zhì)；同時其提出的光響應(yīng)策略為納米酶在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新方向。核酸適配體不但與目標(biāo)分子具有高親和力和特異性結(jié)合作用，還可調(diào)控納米酶活性。將核酸適配體與納米酶結(jié)合，既能對目標(biāo)物實現(xiàn)特異性捕獲，有效避免干擾，還有利于基于納米酶-適配體-目標(biāo)物三者相互作用發(fā)展新的傳感基元和檢測模式。Wang Chunshuai等[51]基于適配體對AuNPs類過氧化物酶活性的抑制作用和目標(biāo)物誘導(dǎo)適配體置換機理，實現(xiàn)了卡那霉素的超靈敏電化學(xué)檢測。AuNPs可催化H2O2與硫氨酸反應(yīng)生成氧化硫氨酸，適配體的修飾使AuNPs催化活性被抑制。當(dāng)體系中存在卡那霉素時，由于其與適配體高的親和力特異性識別作用形成卡那霉素-適配體復(fù)合物，使得適配體從AuNPs表面脫落，AuNPs類過氧化物酶活性得以恢復(fù)，觀測到明顯的電化學(xué)信號。該法線性范圍為0.1～60.0 nmol/L，檢測限為6×10-2nmol/L，靈敏度優(yōu)于GB/T 22995—2008《蜂蜜中鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》限量（0.005 mg/kg），可成功應(yīng)用于蜂蜜中卡那霉素的檢測。Yan Jiao等[52]基于磺胺地索辛適配體對AuNPs類過氧化物酶活性的抑制作用，以TMB為顯色底物，采用比色法測定了牛奶樣品中的磺胺地索辛殘留量。該法線性檢測限為32 nmol/L，可在15 min內(nèi)完成。類似的，Zhao Jing等[53]以鏈霉素適配體為特異性識別元件，以2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）為顯色底物，建立了基于AuNPs類過氧化物酶活性的比色傳感器，實現(xiàn)了牛奶樣品中鏈霉素的快速測定，檢出限為86 nmol/L，低于GB/T 22969—2008《奶粉和牛奶中鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定的牛奶中鏈霉素的最大殘留限量（0.02 mg/kg）。上述基于適配體-納米酶構(gòu)建的傳感檢測方法具有簡選擇性好、抗干擾能力強、靈敏度高、響應(yīng)速度快等優(yōu)點，且無需依賴大型儀器，在動物源性食品中痕量獸藥殘留日常檢測方面具有較大潛力。

2.4 真菌毒素檢測

真菌毒素是真菌在適宜條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，是食品和飼料的主要污染物之一。由于真菌的廣泛存在，雖然可在農(nóng)作物生長、采后貯藏及加工過程中加以控制減少真菌毒素污染，但不能完全將其消除。相關(guān)研究表明，即使是低劑量真菌毒素的攝入，也可能會造成肝臟、腎臟或神經(jīng)毒性甚至死亡。為保障人體健康，近年來，研究者們開發(fā)了基于納米酶傳感器用于真菌毒素的檢測，與傳統(tǒng)分析方法相比，具有操作簡單、檢測成本低、靈敏、快速、可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)點。

比色法由于具有可視化、成本低、便捷等獨特優(yōu)勢，受到了人們廣泛關(guān)注。Lai Wenqiang等[54]采用酶串聯(lián)催化放大策略，構(gòu)建了一種靈敏度有效提高的新型黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）比色免疫傳感器。研究表明，二維結(jié)構(gòu)MnO2納米片的超高比表面積使得其對TMB的吸附能力較強，進而對TMB氧化具有優(yōu)異的類氧化酶催化活性，抗壞血酸可以溶解MnO2生成Mn2+，催化反應(yīng)終止，反應(yīng)體系顯色程度減弱，而抗壞血酸氧化酶的存在可有效減弱這一過程，顯色程度隨抗壞血酸氧化酶濃度增加而增強?；诖耍芯空呃每箟难嵫趸?AFB1標(biāo)記的納米金和磁珠偶聯(lián)AFB1-牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），采用競爭反應(yīng)模式，結(jié)合MnO2-TMB顯色體系，成功測定了花生中AFB1的濃度，檢出限為2×10-2nmol/L，遠(yuǎn)低于GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對食品中AFB1的限量（0.005～0.020 mg/kg）。該法耦合天然酶-模擬酶催化反應(yīng)，具有靈敏度高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，對基于納米酶傳感器的痕量目標(biāo)物分析提供了新途徑。除抗體外，研究者也開發(fā)基于適配體識別作用的納米酶傳感器用于真菌毒素的檢測。Huang Lunjie等[55]設(shè)計了具有類氧化酶活性的MnCo2O4納米酶，結(jié)果表明，MnCo2O4可作為氧化酶催化TMB顯色，且由于晶體表面Co3+/Co2+和Mn3+/Mn2+氧化還原催化循環(huán)的協(xié)同作用，MnCo2O4催化活性優(yōu)于Co3O4、Mn3O4、MnO2、CeO2、MnFe2O4等金屬氧化物。赭曲霉素A（ochratoxin A，OTA）適配體的加入使得MnCo2O4表面活性位點被屏蔽，抑制了MnCo2O4-TMB間的電子轉(zhuǎn)移效率，使顯色反應(yīng)程度減弱；加入OTA后，適配體與OTA形成復(fù)合物，從納米酶表面脫落，MnCo2O4活性恢復(fù)。依據(jù)該原理，Huang Lunjie等[55]構(gòu)建了玉米樣品中OTA的高靈敏、高選擇性比色檢測方法，檢測限0.19 nmol/L，赭曲霉素B、赭曲霉素C、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1均無干擾，因此該方法可用于食品中OTA的風(fēng)險監(jiān)測（OTA限量值0.005～0.010 mg/kg）。類似的，Sun Shumin等[56]利用玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）適配體對AuNPs-H2O2-TMB催化體系的抑制作用，實現(xiàn)了玉米和玉米油中ZEN的測定，該方法法檢出限為31 nmol/L。Tian Fengyu等[57]報道了堿性磷酸酶-MnO2類氧化酶串聯(lián)催化放大體系用于果汁中痕量OTA測定的方法，檢測限為6.9×10-2nmol/L。該法以適配體作為識別元素，實現(xiàn)了OTA的高效捕獲；通過生物素-鏈霉親和素反應(yīng)和寡核苷酸雜交策略，設(shè)計制備了親和素修飾磁珠-生物素標(biāo)記適配體-生物素標(biāo)記互補DNA-親和素標(biāo)記堿性磷酸酶復(fù)合物，既避免了復(fù)雜的共價偶聯(lián)過程，也有利于分離富集；以堿性磷酸酶-抗壞血酸-2-磷酸體系通過抗壞血酸磷酸酯水解產(chǎn)物抗壞血酸還原MnO2生成Mn2+調(diào)控MnO2-TMB反應(yīng)程度進行信號多級放大，對構(gòu)建基于適配體的納米酶傳感器具有較好的通用性。

除比色傳感器外，研究者們也探索了電化學(xué)、熒光等傳感檢測方法。Shu Jian等[58]設(shè)計合成了一種PtNPs/CoTPP/rGO納米復(fù)合材料，并以其作為HRP酶替代物標(biāo)記AFB1抗體，建立了高靈敏的競爭型電化學(xué)免疫傳感器，成功用于花生樣品中AFB1的測定。該方法不但檢測限（1.6×10-2nmol/L，5 pg/mL）遠(yuǎn)低于GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定的花生中最大殘留限量（0.02 mg/ kg），準(zhǔn)確度和精密度也可媲美商業(yè)試劑盒，且具有更快速便捷的優(yōu)勢，在食品中AFB1的日常檢測中具有較廣的應(yīng)用前景。Bagheri等[59]報道了一種應(yīng)用分子印跡聚合物（molecular imprintedpolymer，MIP）提高納米酶傳感器靈敏度和特異性的方法。其以展青霉素為模板分子、以具有類過氧化物酶活性的基于銀鋅納米顆粒的金屬有機框架（Ag nanoparticle/Zn-based MOF nanocomposite，AgNPs/Znbased MOF）為載體，通過溶膠-凝膠印跡技術(shù)制備AgNPs@ZnMOF@MIP納米復(fù)合材料，通過分子印跡薄層對展青霉素的特異性吸附以及展青霉素對AgNPs/Znbased MOF催化位點的屏蔽抑制作用，以對苯二甲酸為熒光催化底物，設(shè)計了一種靈敏可靠的展青霉素的熒光傳感器。該法檢測限為60 nmol/L、特異性好，可成功應(yīng)用于環(huán)境水和蘋果汁中展青霉素的測定。

2.5 食源性病原體檢測

食源性病原體是指引發(fā)食源性疾病的細(xì)菌、病毒、寄生蟲和部分真菌，主要包括大腸桿菌O157:H7、李斯特菌、綠膿桿菌、阪崎腸桿菌、痢疾桿菌、沙門氏菌和諾如病毒等，由其造成的食品污染已在全世界范圍內(nèi)引起了廣泛的關(guān)注。酶聯(lián)免疫法是該類污染物檢測中最常用的方法之一。采用納米酶代替天然生物酶，可有效避免生物酶應(yīng)用面臨的缺陷，提高檢測靈敏度、穩(wěn)定性和效率并降低成本。

大腸桿菌O157:H7是一種嚴(yán)重危害人類健康的致病菌。Han Jiaojiao等[60]以Pd-PtNPs納米酶標(biāo)記抗體，基于雙抗夾心建立了大腸桿菌O157:H7的側(cè)向免疫層析法，用于牛奶中大腸桿菌O157:H7的測定。結(jié)果表明，制備的Pd-Pt納米酶具有優(yōu)異的類過氧化物酶活性，可有效催化H2O2-TMB顯色反應(yīng)，顯著提高了靈敏度，檢出限為9×102CFU/mL。采用同樣的雙抗夾心原理，Jiang Ta等[61]以Pt-AuNPs納米酶為抗體標(biāo)記物，通過其催化H2O2氧化TMB，實現(xiàn)了大腸桿菌O157:H7的免疫層析可視化測定，檢出限為102CFU/mL，遠(yuǎn)優(yōu)于膠體金試紙條和商業(yè)試紙條（105～107CFU/mL）。Wang Zonghan等[62]制備了甘露糖修飾的普魯士藍納米酶，以其作為H2O2-TMB顯色信號催化放大探針和大腸桿菌O157:H7特異性識別材料，通過形成抗體-大腸桿菌O157:H7-納米酶夾心結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了水、西瓜汁、牛奶和紫甘藍中大腸桿菌O157:H7的可視化分析，檢出限為102CFU/mL。上述檢測方法操作簡便，無需細(xì)菌培養(yǎng)、核酸提取等預(yù)處理，可實現(xiàn)病原體的快速現(xiàn)場篩查，對其他食源性病原體的檢測具有較好的通用性和借鑒意義。單核細(xì)胞增生李斯特菌是最常見、最致命的食源性病原體之一，可引起神經(jīng)和免疫系統(tǒng)感染。Zhang Lisha等[63]設(shè)計制備了一種具有類過氧化物酶活性的Fe3O4磁納米粒子團簇（Fe3O4nanoparticle cluster，F(xiàn)e3O4NPC），并將其偶聯(lián)適配體，利用對李斯特菌識別位點與適配體不同的萬古霉素，采用比色夾心法測定了牛奶樣品中李斯特菌的含量。研究結(jié)果表明，由于Fe3O4NPs間的群體協(xié)同效應(yīng)，F(xiàn)e3O4NPC對H2O2-TMB的催化活性遠(yuǎn)優(yōu)于Fe3O4NPs，以其作為信號放大探針，有效提高了靈敏度，檢出限為5.4×103CFU/mL，同時由于采用三明治夾心法，該方法具有較好的特異性。Liu Yushen等[64]開發(fā)了一種基于Ag納米酶調(diào)控AuNPs聚集形態(tài)的比色傳感器。鄰苯二胺可誘發(fā)羧基修飾的AuNPs聚集，而AgNCs催化鄰苯二胺氧化，使聚集體解聚，溶液由藍色變?yōu)榧t色?；谶@一原理，利用適配體修飾的磁珠和抗體修飾的AgNCs捕獲李斯特菌形成三明治結(jié)構(gòu)，結(jié)合磁分離技術(shù)，實現(xiàn)了豬肉中李斯特菌的準(zhǔn)確測定，同時靈敏度得以提升，檢測限為10 CFU/mL。阪崎腸桿細(xì)菌對免疫力較低者及嬰幼兒具有較大危害，感染嚴(yán)重可引起敗血癥、腦膜炎等。Zhang Li等[65]報道了一種基于生物酶-納米酶串聯(lián)催化和雙抗夾心法的試紙條，用于阪崎腸桿細(xì)菌活菌的檢測。該法采用單疊氮溴化丙啶區(qū)分阪崎腸桿細(xì)菌活菌和死菌、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)進行信號放大及DNA定量、Fe3O4類過氧化物酶納米酶催化H2O2氧化二氨基聯(lián)苯胺顯色，靈敏度與膠體金試紙條相比顯著提高（檢測限為2 CFU/mL），為開發(fā)快速、高靈敏的活菌現(xiàn)場檢測提供了有利的工具。Weerathunge等[66]利用諾如病毒與其核酸適配體的高親和力和核酸適配體對AuNPs類過氧化物酶催化活性的吸附抑制作用實現(xiàn)了諾如病毒的檢測。該法抗干擾能力強、可適用多種檢測場景，且與常規(guī)ELISA試紙條、石墨烯/納米金標(biāo)記抗體ELISA等現(xiàn)有方法相比在靈敏度（30 MNV/mL）和響應(yīng)時間（10 min）上均展現(xiàn)出較大優(yōu)勢，對其他病原體的實時現(xiàn)場快速檢測具有較好的借鑒意義。

2.6 其他污染物的檢測

除上述物質(zhì)外，納米酶還可用于食品中其他污染物的檢測中，如蘇丹紅I、三聚氰胺、克倫特羅、萊克多巴胺等違禁添加物、對苯二酚、對硝基苯酚等有機污染物、NO2-、CN-等無機物。

濫用禁用添加物所造成的食品安全問題屢見報道。蘇丹紅I具有強烈的致癌作用，已被國家癌癥研究機構(gòu)列為三類致癌物，嚴(yán)禁在食品中添加。然而由于其顏色鮮艷、不易褪色、價格低廉，仍然被不法分子大量使用在食品生產(chǎn)加工過程中。Palanisamy等[67]首次制備了Graphene/β-CD/PtNPs復(fù)合材料，并通過其開發(fā)出一種靈敏可靠的新型電化學(xué)傳感器，用于測定食品中的蘇丹紅I。循壞伏安法實驗結(jié)果表明，將PtNPs沉積在Graphene/β-CD表面，有利于增加蘇丹紅I的吸附位點并加快電極和蘇丹紅I間的電子轉(zhuǎn)移，因此，與Graphene/β-CD和PtNPs單獨修飾的電極相比，Graphene/β-CD/PtNPs修飾的電極對蘇丹紅I的電催化活性較強，可顯著提高檢測靈敏度。該法可實現(xiàn)辣椒粉、辣椒醬、番茄醬和番茄沙司中蘇丹紅I的測定，檢測限為1.6 nmol/L。三聚氰胺可提高蛋白質(zhì)檢測值，然而其長期攝入會導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)中膀胱、腎產(chǎn)生結(jié)石甚至誘發(fā)膀胱癌，因此，國家嚴(yán)格限制其作為食品添加劑使用，并規(guī)定了食品中三聚氰胺的限量值（嬰幼兒配方食品：1 mg/kg；其他食品：2.5 mg/kg，參考GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》）。Ni Pengjuan等[68]發(fā)現(xiàn)三聚氰胺可通過誘導(dǎo)AuNPs聚集提高其類過氧化物酶活性，并利用該原理偶聯(lián)TMB-H2O2反應(yīng)，開發(fā)了比色傳感器，紫外-可見光譜的檢出限為0.2 nmol/L，肉眼觀察的檢出限為5×102nmol/L，可成功應(yīng)用于牛奶、奶粉中三聚氰胺的檢測。鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺作為β-受體激動劑，可有效增加肌肉蛋白含量并減低肌肉脂肪組織含量、提高動物生長速度。然而其在動物組織尤其是內(nèi)臟中殘留風(fēng)險較高，會引起頭暈、頭疼、惡心、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡，我國已禁止其作為獸藥和飼料添加劑使用。Zhang Lihui等[69]以具有超高比表面積的氧化鋯為載體制備了(NH4)5PV8Mo4O40/ZrO2納米復(fù)合物。研究表明，由于(NH4)5PV8Mo4O40和ZrO2的協(xié)同作用，該復(fù)合材料修飾的電極具有穩(wěn)定性好、響應(yīng)快速、電催化活性高等優(yōu)點，可用于豬肉樣品中克倫特羅和萊克多巴胺的靈敏、快速檢測，檢出限分別為5.03 nmol/L和9.3×102nmol/L。

據(jù)報道，外源性酚類化合物在食品、環(huán)境樣品中均有檢出，部分被列為3 類致癌物，對人體危害不容忽視。Yang Haiguan等[70]首次證明了CeVO4同時具有類過氧化物酶和氧化酶活性，可催化TMB顯色，其催化H2O2氧化TMB主要因為H2O2分解生成羥自由基，其類氧化物活性主要與活性氧物質(zhì)的生成有關(guān)。由于對苯二酚是一種較強的抗自由基化合物，可抑制CeVO4-TMB催化氧化過程，而間苯二酚和鄰苯二酚不能影響TMB顯色反應(yīng)發(fā)生，故該比色法可成功區(qū)別對苯二酚和鄰/間二苯酚，具有較好的選擇性、特異性和靈敏度（檢出限為40 nmol/L）。4-氨基安替比林與鄰苯二酚、對苯二酚、間苯二酚可在氧化劑存在下生成不同顏色的苯二氮卓類化合物。利用這一原理，Sun Ruiling等[71]開發(fā)了基于血紅素-石墨烯雜化納米片類過氧化物酶活性的比色傳感器，實現(xiàn)了水中鄰苯二酚、對苯二酚、間苯二酚的同時測定，檢出限分別為1.6×106、8.3×105、2.5×106nmol/L。

亞硝酸鹽廣泛存在于自然界中，其也可作為防腐劑和肉制品護色劑用于食品生產(chǎn)中，然而食用亞硝鹽含量較高的食品，會引起呼吸衰竭甚至誘發(fā)癌癥。Zhuang Zhenjing等[72]通過在碳點表面原位還原氯金酸制備了C/AuNPs納米雜化物，并將該雜化物沉積在玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）上用于亞硝酸鹽的電化學(xué)檢測。實驗結(jié)果表明，由于碳點和AuNPs的協(xié)同作用，C/AuNPs修飾的GCE對亞硝酸鹽的氧化展現(xiàn)了良好的電催化活性，可實現(xiàn)水樣中亞硝酸鹽的快速高靈敏檢測（檢測限為60 nmol/L），且方法準(zhǔn)確度可與GB/T 7493—1987《水質(zhì) 亞硝酸鹽氮的測定 分光光度法》相媲美。碘是人體的必需微量元素，其過多或者不足攝入都會引起人體健康風(fēng)險。He Shaobin等[73]制備了羧基殼聚糖修飾的PdNPs，I-可與Pd0形成Pd-I鍵從而占據(jù)PdNPs催化活性位點并誘導(dǎo)其聚沉，導(dǎo)致PdNPs對H2O2-TMB反應(yīng)的催化活性下降，顯色減弱。利用這一原理，He Shaobin等[73]采用比色法實現(xiàn)了水中I-的分析，檢出限為0.19 nmol/L。

3 結(jié) 語

納米酶由于兼具天然酶的催化活性以及易于修飾、可裁剪性強、制備簡單、可適用于極端環(huán)境、便于貯存運輸?shù)燃{米材料的獨特優(yōu)勢，已在食品安全檢測領(lǐng)域取得了突飛猛進的發(fā)展。雖然其應(yīng)用有效克服了傳統(tǒng)檢測方法的不足，具備一定的優(yōu)點，促進了食品安全檢測技術(shù)的發(fā)展，但仍面臨著諸多挑戰(zhàn)（表2）。

表2 納米酶應(yīng)用優(yōu)勢與挑戰(zhàn)Table 2 Main advantages and disadvantages of peroxidase-like nanozymes

首先，與天然酶相比，納米酶種類有限且大部分納米酶活性較低，且目前對納米酶的研究主要集中在氧化還原酶模擬酶上，對其他類模擬酶的關(guān)注相對較少。因此，通過材料設(shè)計、形貌、粒徑、結(jié)構(gòu)和組成調(diào)控、表面修飾、元素?fù)诫s、材料復(fù)合等技術(shù)，模擬天然酶活性中心結(jié)構(gòu)和微環(huán)境、精準(zhǔn)控制催化位點、發(fā)揮復(fù)合材料協(xié)同效應(yīng)，以豐富納米酶種類并提高其自身催化性能是未來重要的研究方向之一。

其次，與天然酶可催化特定底物不同，納米酶底物選擇性和特異性較差，如何提升納米酶體系的特異性和選擇性是亟待解決的技術(shù)瓶頸之一。雖然將天然酶與納米酶整合可提高反應(yīng)體系選擇性，但天然酶的引入也帶了天然酶應(yīng)用時所面臨的局限性。發(fā)揮納米酶易修飾的特點，引入分子印跡技術(shù)和核酸適配體等識別技術(shù)等是可嘗試的研究方向。

再次，納米酶的催化機理研究還較為淺顯，導(dǎo)致當(dāng)前納米酶的定向設(shè)計較為困難。利用理論模擬和實驗分析，結(jié)合物理化學(xué)表征手段和人工智能學(xué)習(xí)，深入探索納米酶催化機理，對研究納米酶結(jié)構(gòu)組成和其功能構(gòu)效關(guān)系，依據(jù)應(yīng)用場景合理設(shè)計納米酶功能、調(diào)控納米酶活性，開發(fā)新型多功能納米酶材料，實現(xiàn)復(fù)雜食品基質(zhì)中的痕量污染物分析具有重要意義，是未來的研究熱點。

此外，盡管納米酶已在食品安全領(lǐng)域取得了矚目的研究進展，但目標(biāo)物仍局限在少數(shù)污染物。研究污染物與納米酶相互作用機理，開發(fā)新的傳感策略是拓展納米酶在食品檢測領(lǐng)域應(yīng)用的重點研究方向之一。

最后，當(dāng)前基于納米酶的分析方法多為比色法，雖然比色法具有操作簡單、成本低等優(yōu)勢，但其靈敏度相對較低、易受雜質(zhì)干擾，導(dǎo)致復(fù)雜基質(zhì)中痕量污染物檢測不準(zhǔn)確。如何利用納米酶自身獨特的物理化學(xué)性質(zhì)（磁性、熒光、熱等），將納米酶和化學(xué)發(fā)光、熒光光譜、電化學(xué)、拉曼光譜等技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建多模式、實時、靈敏、準(zhǔn)確的智能檢測技術(shù)是未來的研究趨勢。