優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)暗紋東方鲀冷藏期間品質(zhì)變化影響及致腐能力分析

馮豪杰，藍(lán)蔚青,2,3,*，臧一宇，唐書文，劉大勇，徐 逍，周大鵬，謝 晶,2,3,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.食品科學(xué)與工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306；4.江蘇中洋生態(tài)魚類股份有限公司，江蘇 南通 226600）

暗紋東方鲀（Takifugu obscurus），又名河鲀，為鲀科東方鲀屬，是淡海水洄游魚類，主要分布在我國近海和長江中下游。其肉質(zhì)鮮嫩，脂肪與蛋白質(zhì)含量豐富，深受廣大消費(fèi)者喜愛[1]。2019年我國河鲀魚的淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)9 911 t[2]，市場需求量逐年遞增。

冷藏是水產(chǎn)品的常用保鮮方法，但部分微生物在低溫下仍能快速生長，導(dǎo)致水產(chǎn)品發(fā)生腐敗變質(zhì)[2]。盡管魚類最初的微生物群由大量微生物組成，但在其貨架期結(jié)束時(shí)，只有少數(shù)微生物群占主導(dǎo)地位，稱其為優(yōu)勢(shì)腐敗菌[3]。優(yōu)勢(shì)腐敗菌能產(chǎn)生大量腐敗代謝產(chǎn)物，通過分解蛋白質(zhì)和脂肪產(chǎn)生異味，腐敗活性強(qiáng)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，新鮮魚在冷藏條件下的優(yōu)勢(shì)腐敗菌主要為假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、希瓦氏菌屬（Shewanellaspp.）與氣單胞菌屬（Aeromonasspp.）等[4]。腐敗希瓦氏菌（S.putrefaciens）為革蘭氏陰性好氧菌，具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解和產(chǎn)生硫化氫、三甲胺、生物胺等胺類化合物的能力[5]。李萌等[6]研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌（P.fluorescens）是導(dǎo)致冷藏河鲀魚片腐敗變質(zhì)的主要腐敗菌。在冷藏及有氧條件下，熒光假單胞菌會(huì)產(chǎn)生蛋白酶、脂酶等，生成令人不快的異味，具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力[7]。此外，Zhang Caili等[8]研究發(fā)現(xiàn)，將氣單胞菌和假單胞菌聯(lián)合接種會(huì)加速草魚的腐敗過程，促進(jìn)生物膜形成；Wang Hang等[9]將氣單胞菌、假單胞菌與腐敗希瓦氏菌分別接種到冷藏草魚上，發(fā)現(xiàn)氣單胞菌與假單胞菌會(huì)引起揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、生物胺含量快速增長，而腐敗希瓦氏菌會(huì)產(chǎn)生更多的揮發(fā)性化合物。然而，關(guān)于暗紋東方鲀優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)其品質(zhì)變化影響與致腐能力分析鮮見研究。

基于此，本課題組前期從貯藏末期暗紋東方鲀中分離出P.fluorescens和S.putrefaciens，并將其以單一和聯(lián)合法接種至暗紋東方鲀，通過測(cè)定微生物（菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)、希瓦氏菌數(shù)）、理化（pH值、TVB-N含量、K值、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活力）、蛋白質(zhì)（總巰基含量、肌原纖維碎片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）、內(nèi)源熒光強(qiáng)度（intrinsic fluorescence intensity，IFI））等指標(biāo)，結(jié)合核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI），并通過腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子評(píng)價(jià)，綜合表征兩種優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)冷藏暗紋東方鲀品質(zhì)變化及致腐能力影響。本研究有助于進(jìn)一步探究魚類優(yōu)勢(shì)腐敗菌的致腐機(jī)制，為開發(fā)暗紋東方鲀的新型靶向保鮮技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

P.fluorescens與S.putrefaciens均為本課題組前期研究分離所得，現(xiàn)保藏于課題組實(shí)驗(yàn)室。

暗紋東方鲀，體質(zhì)量（450±50）g，體長（20.0±1.5）cm，購自江蘇中洋生態(tài)魚類股份有限公司，置于泡沫箱增氧保持鮮活狀態(tài)，1 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

平板計(jì)數(shù)瓊脂、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（trypticase soy broth，TSB）、鐵瓊脂青島海博生物技術(shù)有限公司；氧化鎂、硼酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；巰基含量測(cè)試盒、黃嘌呤氧化酶測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec2300型凱氏定氮儀 瑞士FOSS公司；e2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司；F-4600型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；JX-05型拍打式無菌均質(zhì)器上海凈信實(shí)業(yè)有限公司；BIOBASE-EL10A型自動(dòng)酶標(biāo)儀濟(jì)南中安生物技術(shù)服務(wù)有限公司；NMI20-015V-I型低場核磁共振儀 上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 暗紋東方鲀的預(yù)處理

將鮮活暗紋東方鲀冰水致死，處理后用無菌水清洗，再用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液擦拭表面，將所有暗紋東方鲀放在無菌工作臺(tái)中用紫外線（18 W）照射殺菌30 min進(jìn)行無菌化處理[10]。

1.3.2 菌懸液制備與菌株接種

分別挑取P.fluorescens、S.putrefaciens單菌落接種于TSB中，37 ℃搖床培養(yǎng)16～18 h，以1%（體積分?jǐn)?shù)，后同）的接種量傳代后在37 ℃搖床培養(yǎng)16～18 h直至菌落總數(shù)達(dá)1×109CFU/mL，分別將P.fluorescens、S.putrefaciens菌懸液以1%的接種量接種于TSB中，37 ℃搖床培養(yǎng)16～18 h直至菌落總數(shù)達(dá)1×109CFU/mL，分別取P.fluorescens菌懸液、S.putrefaciens菌懸液、等體積的P.fluorescens菌懸液與S.putrefaciens菌懸液，用無菌生理鹽水稀釋到1×106CFU/mL進(jìn)行接種，每種菌懸液配制5 L。

將處理好的魚樣隨機(jī)分成4 組，每組10 條（每2 條魚用1 L菌懸液進(jìn)行接種），P.fluorescens接種（P.fluorescensinoculation，PI）組在制備好的P.fluorescens菌懸液中浸漬10 min；S.putrefaciens接種（S.putrefaciensinoculation，SI）組在S.putrefaciens菌懸液中浸漬10 min；聯(lián)合接種（PI+SI）組：在混合菌懸液中浸漬10 min；對(duì)照組（CK）：在無菌水中浸漬10 min，每組10 條。浸漬后瀝干，裝入無菌聚乙烯袋，于4 ℃貯藏10 d，定期取魚背部肌肉進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的分析。在貯藏初期（0 d）、中期（6 d）和末期（10 d）測(cè)定IFI并進(jìn)行MRI分析，其余指標(biāo)每隔2 d進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 微生物指標(biāo)的測(cè)定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[11]測(cè)定菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)、希瓦氏菌數(shù)。

1.3.4 理化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.4.1 pH值

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》[12]進(jìn)行pH值測(cè)定，平行測(cè)定3 次。

1.3.4.2 TVB-N含量

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[13]進(jìn)行樣品TVB-N含量的測(cè)定。

1.3.4.3K值與XOD活力

稱取5 g魚肉樣品，參考Huang Zhan等[14]法進(jìn)行K值參數(shù)的測(cè)定，按公式（1）計(jì)算。XOD活力采用XOD試劑盒測(cè)定。

式中：CATP、CADP、CAMP、CIMP、CHxR、CHx分別表示三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosinic acid，IMP）、次黃嘌呤核苷（inosine，HxR）和次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）含量/（μmol/g）。

1.3.5 蛋白質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.5.1 總巰基含量

總巰基含量參考試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5.2 肌原纖維碎片化指數(shù)

參考時(shí)海波等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。2 g魚肉加入20 mL MFI提取緩沖液，12 000 r/min冰浴均質(zhì)30 s，12 000×g冷凍離心15 min后重復(fù)上述步驟于沉淀中加入15 mL MFI緩沖液混勻，過雙層紗布，濾液為肌原纖維蛋白溶液。考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定其質(zhì)量濃度，酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm波長處的吸光度A540nm，按公式（2）計(jì)算MFI。

1.3.5.3 內(nèi)源熒光強(qiáng)度

參考Cao Yungang等[16]的方法略作修改測(cè)定IFI。用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液將肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度稀釋至0.1 mg/mL后進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長300～400 nm。

1.3.6 核磁共振成像分析

將魚塊用保鮮膜包裹，放入核磁檢測(cè)管中。參照Lan Weiqing等[17]的方法進(jìn)行MRI分析。

1.3.7 致腐能力分析

參考趙宏強(qiáng)等[18]的方法分析兩種腐敗菌在不同接種方式處理后的致腐能力，以冷藏初期與末期時(shí)單位數(shù)量腐敗菌產(chǎn)生的TVB-N含量為檢測(cè)指標(biāo)。腐敗代謝產(chǎn)物產(chǎn)量因子由公式（3）計(jì)算得出。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s法進(jìn)行顯著性分析和多重比較，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀微生物變化的影響

微生物的生長代謝是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主因，可通過微生物指標(biāo)來判定其新鮮度。當(dāng)菌落總數(shù)高于7.0（lg（CFU/g））時(shí)，代表魚不可食用[19]。不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀微生物變化影響如圖1所示。

圖1 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀菌落總數(shù)（A）、假單胞菌數(shù)（B）與希瓦氏菌數(shù)（C）變化的影響Fig.1 Effects of different inoculation methods on total viable count (A), Pseudomonas count (B) and Shewanella count (C) in refrigerated obscure pufferfish

由圖1A可見，CK組樣品的初始菌落總數(shù)為（3.05±0.05）（lg（CFU/g）），表明其新鮮度較好。而PI組、SI組與PI+SI組樣品的菌落總數(shù)分別為（3.32±0.10）、（3.33±0.03）、（3.39±0.07）（lg（CFU/g）），且隨著貯藏時(shí)間的延長，其增長快速。從第2天開始，PI+SI組樣品的菌落總數(shù)總體顯著高于其他組，但在貯藏末期與SI組差異不明顯，PI+SI組和SI組在貯藏第8天時(shí)的菌落總數(shù)已達(dá)腐敗限值，表明此時(shí)腐敗產(chǎn)物大量積累，使魚肉發(fā)生腐敗變質(zhì)。其中，3 個(gè)接種組在貯藏末期的菌落總數(shù)較接近。

各組樣品的假單胞菌數(shù)（圖1B）與希瓦氏菌數(shù)（圖1C）生長趨勢(shì)同菌落總數(shù)變化相似。SI組從貯藏第6天起，希瓦氏菌數(shù)顯著高于其他組，并在貯藏結(jié)束時(shí)達(dá)（8.61±0.06）（lg（CFU/g））。Zhuang Shuai等[20]發(fā)現(xiàn)新鮮淡水魚的腐敗微生物主要包括假單胞菌、氣單胞菌和希瓦氏菌，這些微生物具有較強(qiáng)的致腐能力。還有研究發(fā)現(xiàn)，魚肉腐敗時(shí)出現(xiàn)的不良風(fēng)味和有害代謝產(chǎn)物同假單胞菌、希瓦氏菌的產(chǎn)生有關(guān)[21]。

2.2 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀pH值與TVB-N含量變化的影響

由表1可知，各組樣品的初始pH值在6.52～6.64，貯藏期間呈先降后升趨勢(shì)?？赡苡捎隰~體死后，乳酸在魚體內(nèi)開始堆積，ATP逐漸分解成磷酸等酸性物質(zhì)，造成pH值降低。而在貯藏中后期，魚體進(jìn)入自溶階段，蛋白質(zhì)開始分解，氨基酸和胺類等含氮物質(zhì)大量出現(xiàn)，使pH值升高[22]。由表可見，CK、PI、SI、PI+SI組的pH值先下降，其在貯藏末期分別達(dá)到6.72±0.01、6.82±0.02、6.92±0.02和6.89±0.03，3 個(gè)接種組樣品在貯藏結(jié)束時(shí)的pH值都顯著高于CK組。

表1 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀pH值與TVB-N含量變化的影響Table 1 Effects of different inoculation methods on pH and TVB-N contents of refrigerated obscure pufferfish

TVB-N是由于魚類死后受到微生物和自身內(nèi)源酶的作用，蛋白質(zhì)分解生成的一些堿性含氮類物質(zhì)，通常微生物的生長與TVB-N含量的升高存在相關(guān)性[23]。由表1可知，4 組樣品的初始TVB-N含量在8.53～9.67 mg N/100 g，其在整個(gè)貯藏過程中均呈增長趨勢(shì)，這與Li Peiyun等[24]研究結(jié)果一致。SI組和PI+SI組樣品在貯藏末期的TVB-N含量分別達(dá)到（19.95±0.78）mg N/100 g與（20.08±0.24）mg N/100 g。而CK組與PI組樣品在貯藏末期的TVB-N含量為（16.91±0.37）mg N/100 g與（17.24±0.44）mg N/100 g?？梢?，SI組和PI+SI組樣品的TVB-N含量顯著高于CK組與PI組。

2.3 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀K值與XOD活力變化的影響

K值是反映水產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)。通常認(rèn)為，K值低于20%為生鮮品，K值在20%～40%為一級(jí)鮮度，40%～60%為二級(jí)鮮度，高于60%即為腐敗變質(zhì)[25]。由圖2可知，樣品的初始K值在（5.85±0.28）%，表明其新鮮程度高。4 組樣品的K值在貯藏前2 d增長緩慢，隨后快速增長，且CK組樣品的增長速度明顯低于其他3 組。PI+SI組樣品在貯藏第10天的K值為（71.64±0.64）%，已超腐敗限值，而PI組與SI組樣品的K值分別為（65.40±0.88）%和（67.90±0.63）%，此時(shí)CK組K值僅為（55.33±0.51）%。由此表明，P.fluorescens和S.putrefaciens可使魚肉中ATP降解為HxR和Hx，促進(jìn)微生物的生長代謝，導(dǎo)致其鮮度下降。

圖2 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀K值變化的影響Fig.2 Effects of different inoculation methods on K value of refrigerated obscure pufferfish

XOD是催化Hx轉(zhuǎn)化成尿酸的關(guān)鍵酶，可用來評(píng)價(jià)細(xì)菌降解Hx的能力。由表2可知，各組樣品的XOD活力在貯藏時(shí)間內(nèi)均有波動(dòng)，總體呈下降趨勢(shì)。其中，PI組樣品的XOD活力下降后，在貯藏結(jié)束時(shí)又達(dá)到最高值，而PI+SI組樣品在貯藏第6天達(dá)到最高值，隨后又開始下降。由此說明，除魚類肌肉產(chǎn)生的Hx，還有P.fluorescens會(huì)導(dǎo)致Hx的積累。CK組和SI組樣品中的XOD活力整體低于PI組，可能由于HxR還未完全轉(zhuǎn)化為Hx。Liu Xiaochang等[26]研究優(yōu)勢(shì)腐敗菌對(duì)冷藏鳙魚的致腐能力，結(jié)果得出XOD活力在貯藏期間也呈波動(dòng)趨勢(shì)，與本研究結(jié)果一致。

表2 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀XOD活力變化的影響Table 2 Effects of different inoculation methods on XOD activity of refrigerated obscure pufferfish U/g

2.4 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀總巰基含量與MFI變化的影響

由圖3A可知，各組總巰基含量隨著貯藏時(shí)間的延長而降低。貯藏10 d后，CK、PI、SI和PI+SI組樣品的總巰基含量相比初始值分別降低38.80%、55.22%、50.58%和55.37%?？値€基含量的降低說明魚肉蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，巰基氧化為二硫鍵或產(chǎn)生二硫化合物[27]。結(jié)果表明，P.fluorescens和S.putrefaciens均會(huì)加速蛋白質(zhì)氧化過程。Qian Yunfang等[28]研究S.putrefaciens對(duì)冷藏太平洋白蝦的致腐能力，結(jié)果得出S.putrefaciens能明顯導(dǎo)致肌原纖維蛋白降解。

魚死后，魚肉在肌肉中鈣蛋白酶的作用下，引起相關(guān)肌原纖維蛋白發(fā)生降解，造成肌原纖維斷裂[29]。MFI可反映肌原纖維斷裂的程度。由圖3B可知，各組樣品的MIF隨貯藏時(shí)間的延長而升高。3 個(gè)接種組的MFI在貯藏后期均顯著高于CK組（P＜0.05），尤其是PI+SI組，在貯藏結(jié)束時(shí)MFI達(dá)到54.15±0.21。由結(jié)果可知，相比于P.fluorescens，S.putrefaciens更能造成肌原纖維斷裂。

圖3 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀總巰基含量（A）和MFI（B）變化的影響Fig.3 Effects of different inoculation methods on sulfhydryl content (A)and MFI (B) of refrigerated obscure pufferfish

2.5 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀內(nèi)源熒光強(qiáng)度變化的影響

色氨酸是一種芳香族氨基酸，存在于天然蛋白質(zhì)的內(nèi)核中，可反映蛋白質(zhì)展開的程度。由于肌球蛋白在頭部和桿部存在色氨酸殘基，因此內(nèi)源熒光光譜可用來檢測(cè)色氨酸的熒光強(qiáng)度和蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)變化[30]。由圖4可知，各組樣品的肌原纖維蛋白在335 nm波長處熒光強(qiáng)度最高。其中，PI+SI組樣品在貯藏期間的熒光強(qiáng)度下降明顯，貯藏到第10天后，其相比于初始強(qiáng)度下降了46.82%，其次是SI組和PI組。熒光強(qiáng)度的降低與色氨酸吲哚側(cè)鏈的變性和暴露有關(guān)[31]。結(jié)果表明，P.fluorescens和S.putrefaciens的接種導(dǎo)致魚肉蛋白中的色氨酸殘基暴露和蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖4 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀內(nèi)源熒光光譜變化的影響Fig.4 Effects of different inoculation methods on intrinsic fluorescence intensity of refrigerated obscure pufferfish

2.6 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀MRI圖像變化的影響

低場核磁共振結(jié)合MRI分析可通過偽彩圖亮度變化直觀反映魚肉樣品中水分遷移及含量變化情況。通常紅色代表高質(zhì)子密度區(qū)域，表明該部分水分含量越高；藍(lán)色代表低質(zhì)子密度區(qū)域，表明水分含量越低[32]。由圖5可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，魚肉的MRI圖由紅色趨于藍(lán)色，顏色逐漸變暗，表明暗紋東方鲀貯藏期間的持水性開始降低，該變化趨勢(shì)與Wang Xinyun等[33]的研究結(jié)果一致。其中，以PI+SI組樣品變化趨勢(shì)最為明顯，其次是SI組，再次是PI組，CK組變化最小。由此可知，微生物的作用促進(jìn)其品質(zhì)下降與持水性降低，進(jìn)一步導(dǎo)致魚肉的肌肉蛋白變性降解。

圖5 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀MRI偽彩圖像變化的影響Fig.5 Effects of different inoculation methods on false-color images of water proton density of refrigerated obscure pufferfish

2.7 不同接種方式對(duì)冷藏暗紋東方鲀致腐能力的影響

不同腐敗菌的生長代謝存在差異，因此，可通過TVB-N含量與菌落總數(shù)結(jié)合得出的產(chǎn)量因子反映腐敗菌的致腐能力。如表3所示，通過產(chǎn)量因子可得出P.fluorescens和S.putrefaciens聯(lián)合接種組的致腐能力最強(qiáng)，其次是S.putrefaciens，而P.fluorescens的致腐能力最弱。但聯(lián)合接種與單一接種的產(chǎn)量因子較為相近，可見S.putrefaciens和P.fluorescens聯(lián)合接種后未表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。

表3 不同接種方式的產(chǎn)量因子Table 3 Yield factors for different inoculation methods

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)主要研究了河鲀魚中的兩種優(yōu)勢(shì)腐敗菌單一或聯(lián)合接種對(duì)其冷藏期間品質(zhì)變化影響及致腐能力影響。結(jié)果表明，相比于PI組和SI組，PI+SI組中的微生物數(shù)量、TVB-N含量與K值增長更為明顯，使其蛋白質(zhì)氧化加速，且水分流失最嚴(yán)重。結(jié)合產(chǎn)量因子得出，P.fluorescens和S.putrefaciens聯(lián)合接種的致腐能力最強(qiáng)，但未表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用，其次是S.putrefaciens，而P.fluorescens致腐能力最弱。本研究有助于加深對(duì)水產(chǎn)品腐敗菌相互作用方式的了解，可為后續(xù)暗紋東方鲀的冷藏保鮮提供理論參考。