江蘇省連云港市草莓根腐病病原菌的分離及鑒定

夏艷秋 鄭宇慧 嚴(yán)浩 張悅 陳靜 楊杰 朱強(qiáng)

摘要：草莓根腐病是影響草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一，其發(fā)病廣，危害重。本研究采用組織分離法，從連云港市東海縣黃川鎮(zhèn)草莓基地根腐病病害植株上分離草莓根腐病病原菌，采用rDNA-ITS序列分析方法結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行菌種鑒定。結(jié)果表明，共分離獲得5株典型病原真菌，包括4個(gè)種，分別是串珠鐮刀菌、棒孢擬盤多毛孢、膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌。果皮粗提物可以有效抑制草莓根腐病病菌。分離鑒定草莓根腐病病原菌，對(duì)分析草莓根腐病病原菌生物多樣性、創(chuàng)建病原菌快速檢測(cè)方法、深入研究草莓根腐病病害原因及綜合防治均具有理論價(jià)值及實(shí)踐意義。

關(guān)鍵詞：草莓;根腐病;病原菌;分離;鑒定

中圖分類號(hào)：S436.68+4 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）02-0085-06

收稿日期：2021-04-10

基金項(xiàng)目：江蘇省政策引導(dǎo)類計(jì)劃蘇北科技專項(xiàng)（編號(hào)：LYG-SZ201806）;連云港市“521工程”專項(xiàng)（編號(hào)：LYG52105-2018046）。

作者簡(jiǎn)介：夏艷秋（1978—），女，江蘇徐州人，碩士，講師，從事生物發(fā)酵、生物防治等生物工程技術(shù)研究。E-mail：1121409728@qq.com。

通信作者：朱 強(qiáng)，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事生物防治及果蔬生理等農(nóng)業(yè)技術(shù)研究。E-mail：zq7685@163.com。

聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織發(fā)布，2008—2018年，全球草莓產(chǎn)量增長(zhǎng)了39.4%[1]。江蘇省是我國(guó)排名第4的優(yōu)質(zhì)草莓主產(chǎn)區(qū)，連云港市東海縣黃川鎮(zhèn)草莓基地被譽(yù)為“中國(guó)草莓第一鎮(zhèn)”，草莓種植多以小規(guī)模為主，采用簡(jiǎn)單易行的連作栽培[2]。然而連作栽培易引起土傳病害也是不爭(zhēng)的事實(shí)，尤以草莓根腐病發(fā)病廣、危害重，且具有逐年上升趨勢(shì)，已成為草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一[3]。草莓根腐病由多種病原引起，各地區(qū)差異極大，連云港地區(qū)鮮有報(bào)道。欲保質(zhì)增產(chǎn)，穩(wěn)做“第一”，當(dāng)務(wù)之急是弄清當(dāng)?shù)夭葺〔≡N類及發(fā)病規(guī)律，并探尋綜合防治措施。筆者所在課題組長(zhǎng)期從事草莓病害治理、高質(zhì)繁育及加工等科研與實(shí)踐工作，取得一定成效，本研究主要對(duì)江蘇省連云港市草莓根腐病病原菌進(jìn)行篩選、分離及鑒定，以期為明確草莓根腐病病害原因及生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

草莓病株樣本于2020年3月采集于江蘇省連云港市東?？h黃川鎮(zhèn)草莓基地，經(jīng)鳳舞劍副教授鑒定為典型根腐病病株。

1.2 草莓根腐病病原菌的分離

取草莓根腐病病株，自來水沖洗2～3次，將初步清洗后的植株病害部位剪切成1 cm×2 cm小塊，用無菌鑷子夾取置于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液中浸泡30 s后，用無菌水沖洗，然后置于0.1%的氯化汞中浸泡1 min，用無菌水沖洗，最后用無菌紗布拭去表面水分。用無菌組培刀將病害組織切成 0.5 cm×0.5 cm 組織塊，置于PDA培養(yǎng)基上28 ℃條件下培養(yǎng)2～5 d。挑取不同形態(tài)的菌株分離培養(yǎng)，多次純化培養(yǎng)后保藏備用[4]。

1.3 草莓根腐病病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 （1）平板扦片法：將上述病原菌置于PDA培養(yǎng)基上28 ℃條件下培養(yǎng)，在菌絲生長(zhǎng)初期，插入已滅菌的蓋玻片，待菌絲延伸至蓋玻片上，用乳酸、石炭酸、棉蘭染色，觀察菌絲生長(zhǎng)及形態(tài)特征。（2）顯微鏡法：挑取菌絲，制作水浸片直接觀察。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

采用r DNA-ITS序列分析法：即核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析法，將上述病原菌純培養(yǎng)后提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)定堿基序列。在NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫中，采用BLAST軟件比對(duì)病原菌堿基序列與其他草莓根腐病病菌堿基序列的同源性，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[5]。

1.4 果皮粗提物對(duì)草莓根腐病病原菌的抑制作用

采用牛津杯法測(cè)定果皮粗提物對(duì)草莓根腐病病菌的抑制作用。無菌條件下，將0.1 mL待測(cè)病原菌孢子懸液均勻涂布于PDA固體平板上，用鑷子在其上均勻放置3～4個(gè)牛津杯，杯中加入100 μL待測(cè)果皮提取物樣液，果皮提取物為火龍果果皮提取物、山竹果皮提取物、柚子果皮提取物、桔子果皮提取物、香蕉果皮提取物和石榴果皮提取物。28 ℃條件下培養(yǎng)2～5 d，觀察抑菌效果并測(cè)量抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓根腐病病原菌的分離

采用組織分離法，從連云港市東?？h黃川鎮(zhèn)草莓基地根腐病害植株（圖1-A，圖1-B）上共分離得到4株細(xì)菌（圖1-C），11株真菌（圖1-D）。其中，有5株真菌表現(xiàn)出典型的草莓根腐病病害特征，分別命名為CMGF-1～CMGF-5。

2.2 草莓根腐病病原菌的鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)學(xué)鑒定

從圖2可以看出，病原菌CMGF-1～CMGF-5中，有3株產(chǎn)色素，3株產(chǎn)菌核;5株初生菌絲均為白色，生長(zhǎng)速度快（3～4 d即可鋪滿平板）;5株氣生菌絲發(fā)達(dá)，向空間延伸的能力強(qiáng);其中，CMGF-4菌株生長(zhǎng)速度最快，氣生菌絲為絨狀;3株菌落呈輻射環(huán)狀，2株菌落邊緣不規(guī)則。具體描述如下。

CMGF-1：菌落邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達(dá)呈白色，有黑色菌核形成，不產(chǎn)色素，菌落呈輻射環(huán)狀。

CMGF-2：菌落邊緣錯(cuò)落，氣生菌絲發(fā)達(dá)呈白色，能產(chǎn)生菌核且分布廣，產(chǎn)黃色色素，邊緣菌絲黃色，內(nèi)部菌絲白色，菌落無輻射環(huán)狀。

CMGF-3：菌落邊緣錯(cuò)落，氣生菌絲發(fā)達(dá)呈白色，菌落邊緣形成黑色菌核，產(chǎn)黃色色素，內(nèi)外菌絲均為黃色，菌落無輻射環(huán)狀。

CMGF-4：菌落邊緣整齊，發(fā)達(dá)的白色氣生菌絲形成絨毛狀，不產(chǎn)生菌核，產(chǎn)黑紫色色素，菌落呈輻射環(huán)狀。

CMGF-5：菌落邊緣整齊，氣生菌絲較為發(fā)達(dá)呈白色，不產(chǎn)菌核，不產(chǎn)色素，菌落呈輻射環(huán)狀。

2.2.2 微觀形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.2.1 CMGF-1

從圖3可以看出，氣生菌絲無色無橫隔，孢子梗直而長(zhǎng)，多以分生孢子座產(chǎn)孢，分生孢子呈短桿狀，兩端圓順，孢子無橫隔，脫落孢子盤為簇狀。

2.2.2.2 CMGF-2、CMGF-3

從圖4可以看出，CMGF-2、 CMGF-3氣生菌絲細(xì)長(zhǎng)彎曲有橫隔， 分隔處收縮明顯，分生孢子呈紡錘形或船形，脫落孢子盤為葡萄狀，分生孢子頂端未觀察到附屬絲。2株菌微觀形態(tài)相似，結(jié)合“2.2.1”節(jié)菌落形態(tài)學(xué)特征，判斷為同屬，是否為同種還需進(jìn)一步鑒定。

2.2.2.3 CMGF-4

從圖5可見，CMGF-4氣生菌絲筆直細(xì)長(zhǎng)無橫隔，分生孢子初期為圓潤(rùn)珠狀，以單梗方式產(chǎn)生孢子，分布于孢子絲兩側(cè);后期展開為鐮刀狀，孢子展開后比釋放前直徑變短，孢子兩端鈍圓，多隔，可初步判斷為串珠鐮刀菌[6]。

2.2.2.4 CMGF-5

從圖6可以看出，CMGF-5微觀形態(tài)非常典型。氣生菌絲長(zhǎng)而直且無橫隔，以單梗形式產(chǎn)生孢子，未釋放前，孢子為圓狀，釋放后為鐮刀狀;孢子細(xì)長(zhǎng)且兩端尖銳，長(zhǎng)度明顯大于釋放前圓形孢子直徑，可判斷為尖孢鐮刀菌[6]。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.2.3.1 CMGF-1

從圖7可以看出，CMGF-1與KC010547.1 膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）在進(jìn)化樹中距離最近，相似性為58%，可以判斷為同種，即CMGF-1為膠孢炭疽菌。

2.2.3.2 CMGF-2 從圖8可以看出，CMGF-2與KY_606543.1 棒孢新擬盤多毛孢菌（Neopestalotiopsis clavispora）在進(jìn)化樹中距離最近，相似性為87%，可以判斷為同種，即CMGF-2為棒孢擬盤多毛孢。

2.2.3.3 CMGF-3

從圖9可以看出，CMGF-3與KR_052094.1 棒孢新擬盤多毛孢菌（N. clavispora）在進(jìn)化樹中距離最近，相似性為63%，可以判斷為同種，即CMGF-3為棒孢新擬盤多毛孢菌。圖8、圖9進(jìn)一步印證了CMGF-2、CMGF-3的近緣性，可能為同種的2個(gè)亞種。

2.2.3.4 CMGF-4

從圖10可以看出，CMGF-4與NR_159818.1 串珠鐮刀菌（Fusariumcontinuum）在進(jìn)化樹中距離最近，相似性91%，可以判斷為同種，即CMGF-4為串珠鐮刀菌，印證了“2.2.2”節(jié)中形態(tài)鑒定的結(jié)論。

3 結(jié)論與討論

本研究采用組織分離法，從江蘇省連云港市東海縣黃川鎮(zhèn)草莓基地根腐病病害植株中分離獲得5株草莓根腐病病原菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征以及18S rDNA堿基序列，鑒定CMGF-1為膠孢炭疽菌或其亞種，CMGF-2、CMGF-3為棒孢擬盤多毛孢或其亞種，CMGF-4為串珠鐮刀菌或其亞種，CMGF-5為尖孢鐮刀菌或其亞種。草莓根腐病是由多種病原和環(huán)境互作引起的，連云港市特殊的海洋氣候及鹽堿生境，是否會(huì)改變病原菌的基因構(gòu)型及致病毒力，基于r DNA-ITS序列分析的低相似同源關(guān)系是否與此有關(guān)，還有待于進(jìn)一步深入研究。

草莓根腐病在我國(guó)各地均有發(fā)生。目前研究結(jié)果（表1）表明，草莓根腐病病原多達(dá)20種。從病害看，由絲核菌、鐮刀菌及擬盤多毛孢菌引起的草莓黑根腐病危害最重，影響最大，其病原涉及多個(gè)屬，甚至還包括線蟲類。其次為由膠孢炭疽菌引起的草莓紅中柱根腐病。從地域看，北方發(fā)病頻率更高，以北京市、河北省、山東省、吉林省及江蘇省等最為嚴(yán)重。病原差異主要表現(xiàn)為，北京市周邊病原種類較復(fù)雜，主要為絲核菌屬、鐮刀屬、多毛孢屬、炭疽屬及腐霉屬等;安徽省以尖孢鐮刀菌為主，浙江省以膠孢炭疽菌為主，河南省以鏈格孢菌為主。本次樣本分離自江蘇省，主要以鐮刀屬、多毛孢屬、炭疽屬為主。各地區(qū)草莓根腐病表征不同，相應(yīng)的病原也不同，預(yù)防及治理方式亦要因病而異。

筆者所在課題組初步試驗(yàn)結(jié)果表明，60%以上果皮粗提物均可以抑制草莓根腐病病菌。其中，火龍果果皮提取物的抑菌圈最大的達(dá)2 cm以上，表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌效應(yīng)（圖11），后期將重點(diǎn)研究果皮提取物在草莓病害方面的防治及應(yīng)用。

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