OT百合Conca d’Or無病毒原原種直接再生體系建立

李雪艷 白一光 胡新穎 王偉東 周俐宏 楊迎東

摘要：OT百合品種Conca d’Or在生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，但病毒病危害嚴(yán)重，組織培養(yǎng)技術(shù)是獲得無病毒種球的主要方式，因此亟需建立Conca d’Or無病毒原原種直接再生體系。以Conca d’Or種球?yàn)樵嚥?，?yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測獲得無CMV、LSV、LMoV病毒的種球，剝?nèi)∑渲型鈱喻[片通過組培獲得無菌試管苗，以無菌苗鱗片為次級外植體，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑對試管內(nèi)小鱗莖直接再生的影響。無病毒小鱗莖試管內(nèi)直接再生最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L KT，誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)系數(shù)分別為100.00%、5.81;小鱗莖膨大最佳培養(yǎng)基為MS+90 g/L蔗糖;生根最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA，移栽成活率可達(dá)100.00%。本研究建立了觀賞百合Conca d’Or無病毒原原種試管鱗莖高效直接再生體系。

關(guān)鍵詞：百合;無病毒原原種;試管小鱗莖;直接再生;培養(yǎng)基

中圖分類號： S682.2+65.04+3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0037-05

收稿日期：2021-04-29

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金（編號：2019-MS-193、2019-ZD-0379）;遼寧省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（編號：2020JH2/10200016）;遼寧省科技特派團(tuán)項(xiàng)目（編號：2020JH5/10100010）。

作者簡介：李雪艷（1986—），女，山東煙臺人，博士，助理研究員，主要從事百合栽培與育種研究。E-mail：lixueyan321@163.com。

通信作者：楊迎東，碩士，研究員，主要從事百合栽培與育種研究。E-mail：yangyingdong2011@163.com。

百合極具觀賞價值、經(jīng)濟(jì)價值與食藥用價值，在發(fā)展特色農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)、實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村振興中具有重要作用。OT百合雜種系品種Conca d’Or，植株高挺、花朵碩大、色澤嬌黃、香味濃郁，擁有很高的市場認(rèn)可度，是近年來切花市場主流的百合品種之一?，F(xiàn)階段我國生產(chǎn)用Conca d’Or種球全部來自國外進(jìn)口，價格昂貴、質(zhì)量不穩(wěn)定、帶病毒率高，嚴(yán)重制約百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展。此外，目前國內(nèi)普遍缺乏無病毒百合種球資源，國內(nèi)流行的百合品種，種球病毒感染率高達(dá)80%以上[1]，造成百合莖、葉片和花的畸形或斑駁、植株矮小、叢簇、退化甚至死亡[2-3]。組織培養(yǎng)繁殖速度快、繁殖系數(shù)大、繁殖后代整齊一致、可獲得無病毒苗，是主要的百合無性繁殖方式。因此獲得Conca d’Or無病毒原原種對百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

百合離體再生途徑有器官直接發(fā)生途徑、器官間接發(fā)生途徑、胚狀體發(fā)生途徑等[4]，器官直接再生具有無污染、繁育周期短、小鱗莖無畸形的優(yōu)點(diǎn)，是百合工廠化生產(chǎn)的主要技術(shù)手段。目前以Conca d’Or的鱗片、子房為材料，已誘導(dǎo)得到愈傷組織、不定芽、小鱗莖等[5-7]。但現(xiàn)有組培體系誘導(dǎo)周期長、誘導(dǎo)率偏低且未進(jìn)行病毒檢測，擴(kuò)繁得到的后代不能保證為無毒原原種，制約其工廠化應(yīng)用。目前尚無以無病毒Conca d’Or百合種球試管再生的研究報(bào)道，本研究旨在建立Conca d’Or無病毒鱗莖試管內(nèi)高效直接再生體系，從而提高誘導(dǎo)率，縮短培養(yǎng)周期，快速獲得大量Conca d’Or無病毒原原種，提升我國切花產(chǎn)業(yè)質(zhì)量。本研究以經(jīng)RT-PCR檢測無黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、百合無癥病毒（lily symptomless virus，LSV）、百合斑駁病毒（lily mottle virus，LMoV）的Conca d’Or種球中外層鱗片為初級外植體，以無菌試管苗的鱗片為次級外植體，研究不同種類與濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對Conca d’Or小鱗莖直接再生的影響，篩選出百合Conca d’Or種球在外植體接種、增殖、生根等階段的最佳培養(yǎng)基配方，建立高效Conca d’Or無病毒小鱗莖試管內(nèi)直接再生體系，為百合種球工廠化繁育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2019年10月在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所組織培養(yǎng)室進(jìn)行。OT百合Conca d’Or組培無菌苗，小鱗莖周徑大于1 cm，外植體接種原始材料為荷蘭進(jìn)口種球，鱗莖周徑14～16 cm。

芐基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、激動素（KT）、蔗糖、瓊脂，均為分析純，購自北京康貝斯生物科技有限公司;多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、DNA Marker，購自天根生化科技（北京）有限公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Promega公司;瓊脂糖，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基準(zhǔn)備

試驗(yàn)采用MS固體培養(yǎng)基（含MS基本培養(yǎng)基，蔗糖30 g/L，瓊脂6.5 g/L，pH值為5.8），根據(jù)小鱗莖發(fā)生、膨大、生根3個發(fā)育階段設(shè)計(jì)不同的植物生長調(diào)節(jié)劑配方試驗(yàn)，于121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2.2 無病毒原始試驗(yàn)材料準(zhǔn)備

提取鱗片RNA，RNA質(zhì)量和濃度檢測合格后用于后續(xù)cDNA合成。根據(jù)CMV、LSV、LMoV已公布的序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，PCR體系采用Ex Taq PCR System（TaKaRa），產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測無病毒的種球用于培養(yǎng)無菌苗。

1.2.3 小鱗莖誘導(dǎo)試驗(yàn)

取無菌苗的鱗片，沿四周邊緣切去0.2 cm，然后沿鱗片基部橫向切成0.2～0.3 cm的小塊，接種至不同配方培養(yǎng)基，切面接觸培養(yǎng)基，每瓶接種3～6片，每個處理10瓶，于（25±1） ℃的培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)。接種45 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)系數(shù)。

1.2.4 小鱗莖膨大試驗(yàn)

將大小一致的小鱗莖轉(zhuǎn)入添加30、60、90、120、150 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中，45 d 后調(diào)查小鱗莖的周徑。

1.2.5 小鱗莖生根試驗(yàn)

將直徑1 cm的小鱗莖接種于添加不同濃度NAA（0.1、0.2、0.5 mg/L）、IBA（0.01、0.10 mg/L）的培養(yǎng)基中，45 d后調(diào)查根長、生根率及根數(shù)。

1.2.6 練苗移栽

將生根后的組培苗移至冷庫，4 ℃ 低溫處理3個月后將小鱗莖從瓶中取出，洗去根部附著的瓊脂，隨后消毒30 min，最后栽植于草炭和蛭石混合基質(zhì)（體積比為1 ∶1）中，于日光溫室中培養(yǎng)。定植后30 d，統(tǒng)計(jì)小苗移栽成活率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析方法

小鱗莖誘導(dǎo)率=產(chǎn)生小鱗莖的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%;

小鱗莖誘導(dǎo)系數(shù)=產(chǎn)生的小鱗莖數(shù)量/產(chǎn)生小鱗莖的外植體總數(shù);

生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%。

試驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，定期觀測并調(diào)查數(shù)據(jù)。各處理之間差異顯著性用DPS 7.05軟件分析，統(tǒng)計(jì)方法采用鄧肯新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 無CMV、LSV、LMoV病毒的Conca d’Or種球的獲得

如圖1所示，種球1和8中檢測到CMV病毒，種球2和7檢測到LMoV病毒，種球4和6檢測到LSV病毒，種球5既檢測到LSV病毒又檢測LMoV病毒，種球3和9沒有檢測到CMV、LSV、LMoV病毒，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 不同濃度6-BA、NAA對無菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響

由表1可知，6-BA與NAA可促使Conca d’Or百合無菌苗鱗片誘導(dǎo)分化，各處理誘導(dǎo)系數(shù)均可達(dá)到3.1以上。隨著6-BA與NAA濃度的增加，小鱗莖誘導(dǎo)系數(shù)先增加后降低，其中處理2即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA的誘導(dǎo)系數(shù)最高。然而，各處理間的小鱗莖誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)系數(shù)均無顯著差異。此外，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中同時添加6-BA與NAA，會導(dǎo)致誘導(dǎo)的小鱗莖出現(xiàn)畸形，即鱗片呈蓮座狀簇?fù)恚▓D2-A），而蓮座化的小鱗莖在后續(xù)增殖與膨大培養(yǎng)中仍會表現(xiàn)為畸形，不適于百合種球的工廠化生產(chǎn)。因此，6-BA與NAA不利于Conca d’Or百合小鱗莖的直接再生。

2.3 不同濃度2，4-D對無菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響

將Conca d’Or百合無菌苗鱗片接種到添加了不同濃度2，4-D的培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鱗片基部可直接誘導(dǎo)分化得到小鱗莖，且小鱗莖形狀周正無畸形（圖2-B），表明2，4-D適于Conca d’Or百合無菌苗鱗片直接誘導(dǎo)分化小鱗莖。由表2可知，不同濃度2，4-D的小鱗莖誘導(dǎo)率都可達(dá)到100.00%，且誘導(dǎo)效果要好于6-BA和NAA。此外，發(fā)現(xiàn)較高濃度的2，4-D有利于Conca d’Or小鱗莖的誘導(dǎo)，當(dāng)2，4-D濃度在1.0～2.5 mg/L時，小鱗莖誘導(dǎo)系數(shù)無顯著差異，均在4.4以上，其中以1.5 mg/L 2，4-D誘導(dǎo)效果最佳。

2.4 不同濃度2，4-D、KT對無菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響

由表3可知，與僅添加2，4-D相比，培養(yǎng)基中同時添加2，4-D與KT更有利于Conca d’Or百合試管內(nèi)小鱗莖的直接再生，其小鱗莖誘導(dǎo)系數(shù)要高于單獨(dú)添加2，4-D，這說明生長素與細(xì)胞分裂素配比更有利于Conca d’Or小鱗莖的直接誘導(dǎo)再生。此外，不同濃度2，4-D與KT組合，小鱗莖的誘導(dǎo)率基本可達(dá)到100.00%。而當(dāng)2，4-D為2.0 mg/L、KT為0.05 mg/L時，小鱗莖的誘導(dǎo)系數(shù)最高，可達(dá)到5.81，最適于Conca d’Or小鱗莖的試管內(nèi)直接再生（圖2-C）。

2.5 不同濃度NAA、KT對無菌苗鱗片直接再生小鱗莖的影響

添加不同濃度NAA、KT可促進(jìn)無菌苗鱗片直接再生小鱗莖。由表4可知，不同濃度NAA與KT處理對Conca d’Or鱗片再生小鱗莖誘導(dǎo)率影響差異不大，均可達(dá)到97.00%以上。與同為細(xì)胞分裂素的6-BA不同，KT與NAA配比可誘導(dǎo)出球形周正的小鱗莖，不會產(chǎn)生無蓮座化現(xiàn)象（圖2-D）。當(dāng)MS培養(yǎng)基中添加0.10 mg/L NAA與0.10 mg/L KT時，試管內(nèi)小鱗莖誘導(dǎo)系數(shù)可達(dá)到3.83。

2.6 不同濃度蔗糖對小鱗莖膨大的影響

在MS培養(yǎng)基中添加蔗糖可以使小鱗莖體積增大，但增大的幅度隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的升高有顯著不同（圖3）。其中90～120 g/L蔗糖對小鱗莖增大幅度無顯著性差異，而培養(yǎng)基中添加90 g/L蔗糖可使小鱗莖達(dá)到最大周徑4.35 cm，同時小鱗莖生根效果也較好。

2.7 不同濃度IBA、NAA對生根的影響

從表5可以看出，添加不同濃度NAA與IBA時Conca d’Or鱗莖生根率都能達(dá)到100.00%，但是生根效果不同，根長和生根數(shù)方面均有差異。對于根長來說，單獨(dú)添加NAA效果要優(yōu)于單獨(dú)添加IBA，以處理3效果最好;對于生根數(shù)來說，單獨(dú)添加IBA的效果要優(yōu)于單獨(dú)添加NAA。綜上可知，MS+0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L IBA最適合Conca d’Or小鱗莖誘導(dǎo)生根，且生根情況適合移栽（圖2-E）。

2.8 煉苗移栽

經(jīng)煉苗后的組培苗移栽至消毒完全的基質(zhì)中，成活率均達(dá)到100%，并且長勢健壯（圖2-F）。

3 討論與結(jié)論

百合多采用無性繁殖種球，易造成病毒不斷累積，使品種嚴(yán)重退化，失去觀賞價值[8]，因此培育無病毒種球已成為百合生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。利用化學(xué)藥劑或生物制劑難以對病毒病進(jìn)行有效防治， 而目前病毒脫除是獲得百合無病毒植株的主要途徑[9]。隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，目前檢測、鑒定病毒的方法主要有生物學(xué)檢測法、電子顯微鏡檢測法、免疫學(xué)檢測法以及分子生物學(xué)檢測法[10-12]。無病毒百合獲得一般是通過莖尖脫毒[13]、熱處理[14]、超低溫[15]等。但目前脫毒方法存在技術(shù)要求高、操作復(fù)雜、脫毒率低等缺點(diǎn)，本研究通過PCR檢測獲得無病毒百合種球，以此為原始材料進(jìn)行無病毒種球試管內(nèi)直接快繁，周期短、效率高、操作簡單，可以快速獲得大量優(yōu)質(zhì)百合脫毒種苗。

迄今為止，百合試管內(nèi)再生已開展了較多研究[15-20]，目前關(guān)于Conca d’Or百合組織培養(yǎng)的研究相對較少，主要以不定芽誘導(dǎo)和愈傷組織誘導(dǎo)為主，相關(guān)研究結(jié)論不盡相同。其中潘正波等以Conca d’Or的子房為材料，發(fā)現(xiàn)MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 適于愈傷組織的誘導(dǎo)[5];張悅等則認(rèn)為，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA有利于Conca d’Or鱗片誘導(dǎo)不定芽[6];而蔡宣梅等研究發(fā)現(xiàn)，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L 2，4-D可促進(jìn)鱗片再生試管小鱗莖[7]。本試驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)，2.0 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L KT最適于小鱗莖直接形成，這可能與添加的外源激素的種類和濃度配比以及取材時間與接種方式有關(guān)。有研究認(rèn)為50～70 g/L蔗糖最利于Conca d’Or小鱗莖膨大培養(yǎng)[7]，而本研究發(fā)現(xiàn)60～150 g/L蔗糖對小鱗莖膨大均有較好的促進(jìn)效果，但以90 g/L濃度蔗糖效果最佳。

綜上所述，本研究以Conca d’Or無菌苗鱗片為研究對象，建立了無病毒試管小鱗莖直接再生體系，篩選出小鱗莖直接再生最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L KT，小鱗莖膨大最適培養(yǎng)基為MS+90 g/L蔗糖，生根最適培養(yǎng)基為 MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA。

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