miR-375調(diào)控PIAS1對急性胰腺炎腺泡細胞增殖、凋亡的影響

杜慧清 杜慧靜 耿棟棟

(1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院急診科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院急診科)

急性胰腺炎(AP)是急診科常見急腹癥的主要類型，根據(jù)疾病嚴重程度分為輕度、中度及重度，而重度AP患者治療后預后較差且具有較高的死亡率〔1〕。胰腺腺泡細胞凋亡與增殖比例失衡是導致AP發(fā)生及發(fā)展的重要原因之一〔2〕。因而如何抵抗胰腺腺泡細胞凋亡及促進細胞增殖對研制AP新型治療藥物有重要參考價值。研究表明在AP大鼠胰腺中信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子1的活化抑制蛋白(PIAS1)的表達水平顯著降低，其表達水平與AP病情嚴重度呈負相關(guān)，并可作為預測病情嚴重程度及預后的重要指標〔3〕。沉默PIAS1基因表達可增強雨蛙肽活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3凋亡途徑而促使胰腺腺泡細胞凋亡進而促進炎癥的發(fā)生〔4,5〕，結(jié)果表明PIAS1可參與AP發(fā)生及發(fā)展過程，但關(guān)于其具體作用機制尚未完全闡明。相關(guān)研究對胰腺炎組、正常組進行芯片分析發(fā)現(xiàn)在AP患者血清中微小RNA-375(miR-375)表達上調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-375可通過靶向YAP1抑制胰腺細胞增殖〔6,7〕。但miR-375對AP腺泡細胞的影響及其機制研究尚未完全闡明。經(jīng)靶基因預測軟件分析發(fā)現(xiàn)PIAS1可能是miR-375的靶基因，由此猜測miR-375可能通過調(diào)控PIAS1表達進而參與AP發(fā)生及發(fā)展過程。因此，本研究用雨蛙素(CAE)處理胰腺腺泡細胞株 AR42J構(gòu)建AP模型，觀察miR-375、PIAS1表達，并分析下調(diào)miR-375表達后其對AR42J細胞增殖及凋亡的影響，初步探討其是否通過調(diào)控PIAS1表達而發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胰腺腺泡細胞株 AR42J購自美國ATCC細胞保藏中心。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；CAE購自上海博研生物工程研究中心；胰蛋白酶與胎牛血清均購自武漢碧云天生物有限公司；Trizol試劑與Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；RIPA細胞裂解液購自上海博彩生物科技有限公司；兔抗鼠B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)多克隆抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗均購自美國Santa Cruz公司；兔抗鼠CyclinD1、P21一抗購自武漢博士德生物技術(shù)公司；GAPDH一抗購自美國Abcam公司；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自上海士鋒生物科技有限公司；miR-375模擬物(miR-375 mimics)、miR-375抑制劑(anti-miR-375)及其相應(yīng)陰性對照均購自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；si-PIAS1、si-NC均購自廣州銳博生物科技有限公司；Gene TailorTMSite-Directed Mutagenesis System試劑盒購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自美國Biovision公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 胰腺泡AR42J細胞放入含有10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，待細胞穩(wěn)定傳代2～3代后進行轉(zhuǎn)染。收集處于對數(shù)生長期AR42J細胞，胰蛋白酶消化細胞后接種于6孔板，轉(zhuǎn)染前1 d更換不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基，不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基分別稀釋Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、anti-miR-NC、anti-miR-375、miR-NC、miR-375、si-NC、si-PIAS1，最終促使其終濃度為100 nmol/L的轉(zhuǎn)染混合液，將anti-miR-NC、anti-miR-375、miR-NC、miR-375分別轉(zhuǎn)染至AR42J細胞，分別為anti-miR-NC組、anti-miR-375組、miR-NC組、miR-375組，同時將anti-miR-375與si-NC、si-PIAS1分別共轉(zhuǎn)染至AR42J細胞，分別為anti-miR-375+si-NC組、anti-miR-375+si-PIAS1組。轉(zhuǎn)染后放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)6 h后將培養(yǎng)基更換為RPMI1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2構(gòu)建AP模型 造模前1 d將生長狀態(tài)良好的AR42J細胞以每孔5.5×104個細胞的密度接種于6孔板，每孔加入RPMI1640完全培養(yǎng)基(1 ml/孔)，放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h，加入10 nmol/L CAE處理細胞24 h〔8〕，振蕩混勻，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集AR42J細胞，同時將CAE處理后的AR42J細胞作為AR42J+CAE組，未經(jīng)CAE處理的AR42J細胞作為AR42J組。1.2.1各轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后12 h，用濃度為10 nmol/L的CAE刺激細胞24 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞進行后續(xù)研究。

1.2.3qRT-PCR實驗 收集各組AR42J細胞置于1.5 ml離心管內(nèi)，經(jīng)低溫快速離心后棄上清，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，加入1 ml Trizol試劑提取細胞總RNA，應(yīng)用NanoDrop2000測定RNA濃度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR，反應(yīng)體系為20 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，ddH2O補足至20 μl。擴增條件為95℃預變性5 min循環(huán)1次，95℃變性30 s循環(huán)35次，60℃退火30 s循環(huán)35次，72℃延伸30 s循環(huán)35次。miR-375以U6為內(nèi)參基因，PIAS1以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算miR-375、PIAS1 mRNA相對表達量。每組實驗均設(shè)置3次重復。

1.2.4Western印跡 取對數(shù)生長期AR42J細胞，預冷PBS洗滌細胞，4℃，1 200 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，離心半徑 6 cm，離心后棄上清，加入RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠與濃縮膠，將配置完成的SDS-PAGE凝膠放入含有1×蛋白電泳緩沖液的電泳槽內(nèi)，蛋白樣本上樣(50 μg/孔)，電泳反應(yīng)條件為分離膠前90 V 30 min，隨后120 V 90 min，濕轉(zhuǎn)膜儀將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，2 h后取膜置于5%脫脂奶粉封閉液內(nèi)室溫條件下封閉2 h，加入PIAS1、CyclinD1、P21、Bcl-2、Bax蛋白(稀釋比均為1∶500)及GAPDH一抗(稀釋比1∶1 000)，4℃條件下孵育過夜，次日用TBST洗滌3次×10 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗(稀釋比1∶5 000)，室溫條件下孵育60 min，TBST洗滌3次×10 min，滴加ECL試劑顯影，置于凝膠成像分析系統(tǒng)曝光并掃描圖片，應(yīng)用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，各蛋白均以GAPDH為內(nèi)參進行半定量分析。每組實驗均設(shè)置3次重復。

1.2.5細胞增殖實驗 取各組對數(shù)生長期AR42J細胞，以每孔3×104個細胞的密度接種于96孔板，加入適量RPMI1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為24 h、48 h、72 h時向每孔加入質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液20 μl，放入37℃、 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，更換培養(yǎng)基，每孔加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，置于搖床內(nèi)振蕩混勻，應(yīng)用酶標儀檢測各孔在490 nm處的光密度值(OD)。

1.2.6流式細胞議檢測細胞凋亡 取1.2.1與1.2.2中各組對數(shù)生長期的AR42J細胞，加入100 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC，室溫條件下避光孵育15 min，加入5 μl PI染色液，避光振蕩10 min充分混勻，加入400 μl結(jié)合緩沖液，充分混勻，置于流式細胞儀檢測AR42J細胞凋亡率。

1.2.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?利用TargetScan 靶基因預測庫預測miR-375的靶基因，將含有miR-375與PIAS1 3′UTR的結(jié)合位點序列的PCR擴增產(chǎn)物載入pGL3質(zhì)粒的Xbal酶切位點構(gòu)建pGL3-WT-PIAS1野生型報告基因質(zhì)粒，應(yīng)用Gene TailorTMSite-Directed Mutagenesis System試劑盒突變miR-375與PIAS1 3′UTR的結(jié)合位點，構(gòu)建pGL3-MUT-PIAS1突變型真核表達載體。取AR42J細胞分別轉(zhuǎn)染后分為4組：miR-NC組(轉(zhuǎn)染野生型WT-PIAS1質(zhì)粒與miR-NC)；miR-375組(轉(zhuǎn)染野生型WT-PIAS1質(zhì)粒與miR-375 mimics)；miR-NC組(轉(zhuǎn)染野生型MUT-PIAS1質(zhì)粒與miR-NC)；miR-375組(轉(zhuǎn)染野生型MUT-PIAS1質(zhì)粒與miR-375 mimics)。細胞轉(zhuǎn)染24 h后用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-375、PIAS1在胰腺腺泡細胞AR42J和CAE作用的AR42J細胞中的表達 AR42J+CAE組miR-375明顯高于AR42J組，而PIAS1蛋白水平明顯低于AR42J組(均P<0.05)，見圖1、表1。表明CAE可促使AR42J細胞中miR-375的表達上調(diào)，而抑制PIAS1表達。

圖1 PIAS1蛋白的表達

表1 miR-375、JAK2在胰腺腺泡細胞AR42J和CAE作用的AR42J細胞中的表達

2.2抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞增殖的影響 通過向AR42J細胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-375及其陰性對照，并用CAE刺激后構(gòu)建AP模型，用qRT-PCR實驗檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，anti-miR-375組AR42J細胞中miR-375的表達水平顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功。MTT實驗檢測細胞增殖，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-375組AR42J細胞增殖活性均明顯增強(均P<0.05)。表明抑制miR-375表達可有效促進AR42J細胞增殖。Western印跡檢測細胞增殖相關(guān)蛋白表達，anti-miR-375組AR42J細胞中CyclinD1表達水平較anti-miR-NC組顯著升高(P<0.05)，而P21表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖2、表2。表明抑制miR-375表達可通過上調(diào)CyclinD1表達及下調(diào)P21表達進而促進AR42J細胞增殖。

圖2 增殖相關(guān)蛋白的表達

2.3抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測AR42J細胞凋亡，結(jié)果顯示，anti-miR-375組細胞凋亡率明顯低于anti-miR-NC組(P<0.05)。表明抑制miR-375表達可抑制AR42J細胞凋亡。Western印跡檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白表達，結(jié)果顯示，與anti-miR-NC組比較，anti-miR-375組AR42J細胞中Bcl-2表達水平顯著升高，而Bax表達水平顯著降低(均P<0.05)。表明抑制miR-375表達可通過上調(diào)Bcl-2表達及下調(diào)Bax表達進而抑制AR42J細胞凋亡。見圖3、表3。

A：抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的影響；B：抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡蛋白表達的影響圖3 抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的影響

表3 抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的影響

2.4miR-375靶向、調(diào)控PIAS1 TargetScan靶基因預測數(shù)據(jù)庫對miR-375的靶基因進行預測，檢索結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-375與PIAS1的3′UTR序列存在結(jié)合位點，見圖4。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示共轉(zhuǎn)染miR-375 mimics、野生型WT-PIAS1載體的實驗組中，miR-375組WT-PIAS1顯著低于miR-NC組(P<0.05)，兩組MUT-PIAS1比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。表明miR-375可直接靶向PIAS1。進一步研究結(jié)果顯示，miR-375組PIAS1 mRNA及蛋白的表達水平顯著低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-375組PIAS1 mRNA及蛋白的表達水平顯著高于anti-miR-NC組(P<0.05)，見圖5、表5。表明miR-375可靶向調(diào)控PIAS1的表達。

圖4 PIAS1的3′UTR含有miR-375的互補序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖5 miR-375調(diào)控PIAS1的表達

表5 miR-375調(diào)控PIAS1的表達

2.5抑制PIAS1表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞增殖的促進作用 為明確抑制miR-375表達是否通過上調(diào)PIAS1表達進而促進CAE作用的AR42J細胞增殖，通過回復實驗將anti-miR-375與si-PIAS1共轉(zhuǎn)染AR42J細胞，Western印跡結(jié)果顯示anti-miR-375+si-PIAS1組PIAS1蛋白及細胞活性均顯著低于anti-miR-375+si-NC組(均P<0.05)，而P21蛋白顯著高于anti-miR-375+si-NC組(P<0.05)。見圖6、表6。表明抑制PIAS1表達可逆轉(zhuǎn)抑制miR-375對AR42J細胞增殖的促進作用。

1～4:anti-miR-NC組、anti-miR-375組、anti-miR-375+si-NC組、anti-miR-375+si-PIASI組；圖7同圖6 抑制PIAS1表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞增殖相關(guān)蛋白的表達

2.6抑制PIAS1表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的抑制作用 流式細胞儀檢測共轉(zhuǎn)染anti-miR-375與si-PIAS1后AR42J細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與anti-miR-375+si-NC組比較，anti-miR-375+si-PIAS1組AR42J細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，而Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖7、表7。表明抑制PIAS1表達可逆轉(zhuǎn)抑制miR-375對AR42J細胞凋亡的抑制作用。

圖7 抑制PIAS1表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡蛋白的表達

表7 抑制PIAS1表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-375對CAE作用的AR42J細胞凋亡的抑制作用

3 討 論

AP發(fā)病機制涉及多層面、多階段及多基因等調(diào)控過程導致臨床尚無有效治療手段，研究過程中采用來自大鼠胰腺腺泡細胞瘤的AR42J細胞進行研究，相關(guān)報道指出AR42J細胞具有易培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率高及CAE刺激反應(yīng)大等優(yōu)點〔9，10〕。因而本研究采用AR42J細胞構(gòu)建AP模型。相關(guān)研究〔11〕表明miRNA表達異常與AP發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。但miRNA與AP發(fā)生機制的內(nèi)在聯(lián)系尚未完全闡明，因此本研究進一步探討miRNA與AP發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系，以期進一步揭示AP發(fā)病機制。

miR-375表達水平升高可提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激水平進而促使胰島β細胞凋亡導致2型糖尿病病情加重〔12〕。研究〔13，14〕表明miR-375是胰腺發(fā)育過程中特異性表達的miRNA分子之一，其表達水平與胰腺形態(tài)及功能維持密切相關(guān)，通過抑制miR-375表達可抑制糖尿病胰島β細胞凋亡進而達到治療糖尿病目的。李鴻翔等〔15〕研究表明miR-375可作為致病因素促進高血壓頸動脈斑塊陽性疾病發(fā)生及發(fā)展過程。抑制miR-375表達可通過調(diào)控PDK-1-AKT信號通路進而減弱心肌梗死后的炎癥反應(yīng)及左心室功能障礙〔16〕。本研究結(jié)果說明miR-375可能在AP發(fā)生過程中發(fā)揮促進作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-375后CAE作用的AR42J細胞增殖活性明顯增強，而細胞凋亡率明顯降低，并可明顯促進CyclinD1、Bcl-2表達，而抑制p21、Bax表達，其中CyclinD1可促進細胞周期進入S期進而調(diào)控細胞周期增殖，p21可抑制CyclinD1表達進而誘導細胞周期停滯于S期〔17〕。細胞凋亡是炎性反應(yīng)等生理或病理條件下激活膜信號系統(tǒng)進而激活內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶活性導致其自然死亡，而Bcl-2、Bax通常是調(diào)節(jié)細胞凋亡的主要因子，其中Bcl-2可抑制細胞凋亡，而Bax可促進細胞凋亡〔18〕。由此可知，抑制miR-375表達可通過調(diào)控細胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達進而促進CAE作用的AR42J細胞增殖及抑制細胞凋亡。

PIAS1具有明顯抗炎作用，研究〔19〕表明PIAS1可通過抑制炎癥微環(huán)境下胃癌細胞發(fā)生的上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化進程進而抑制腫瘤細胞遷移及侵襲。Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號轉(zhuǎn)導途徑激活與AP炎癥細胞過度激活密切相關(guān)，并可誘導AP促炎介質(zhì)聚集進而加重AP疾病嚴重程度〔20〕。因而抑制JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導途徑激活可有效控制AP炎癥反應(yīng)。進一步研究表明PIAS1是JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導途徑的負向調(diào)控因子，其可有效抑制其活化進程〔21，22〕。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果表明CAE作用的AR42J細胞中PIAS1的表達水平明顯降低，AR42J細胞中miR-375與PIAS1呈負相關(guān)，由此推測miR-375是否為PIAS1的上游調(diào)控基因。通過靶基因預測軟件分析顯示miR-375與PIAS1存在結(jié)合位點，進一步采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測證實PIAS1是miR-375的靶基因，同時通過qRT-PCR與Western印跡驗證miR-375與PIAS1的調(diào)控關(guān)系，結(jié)果表明miR-375可負性調(diào)控PIAS1的表達。為驗證miR-375是否可通過靶向調(diào)控PIAS1表達進而參與AP發(fā)生及發(fā)展過程，本研究提示抑制miR-375可通過上調(diào)PIAS1表達進而抑制CAE作用的AR42J細胞凋亡并促進細胞增殖進而減緩疾病進展。