基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“檳榔-草果-厚樸”配伍治療糖尿病腎病作用機(jī)制探討

白曉甜 南 征 宋超群 劉世林

糖尿病腎?。―iabetic kidney disease，DKD）是臨床常見的糖尿病并發(fā)癥。2019 年流行病學(xué)調(diào)查顯示[1]，全球20～70 歲成年人中糖尿病發(fā)病率高達(dá)9.3%，而DKD 患病人數(shù)隨糖尿病發(fā)病率升高也成比例增長。DKD 以持續(xù)性蛋白尿和腎功能進(jìn)行性下降為主要表現(xiàn)，并且多伴有高血壓和眼底病變，最后進(jìn)展為終末期腎病。研究顯示，DKD為發(fā)達(dá)國家和地區(qū)終末期腎病的首要原因。對于此病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多從降血糖、降血壓、降血脂、抗炎、抗氧化應(yīng)激等方面治療[2]。中醫(yī)藥在此病的治療上發(fā)揮了其獨(dú)特優(yōu)勢[3]。尚鑫等[4]應(yīng)用參芪地黃湯治療早期糖尿病腎病，患者SCR、BUN、UAER等指標(biāo)均較治療前明顯改善。王澤等[5]研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸可降血糖、血壓、血脂，改善腎功能，對于肝腎陰虛型糖尿病腎病療效確切。吳修紅等[6]將當(dāng)歸補(bǔ)血湯加味用于糖尿病腎病的治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可明顯改善患者腎功能，增強(qiáng)患者免疫機(jī)能并且減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)。南征教授將“檳榔-草果-厚樸”三藥應(yīng)用于糖尿病腎病的治療，經(jīng)過多年臨床實(shí)踐，收獲良效。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法[7]，從檳榔、草果、厚樸三味藥的成分及作用靶點(diǎn)出發(fā)，分析其治療糖尿病腎病的作用機(jī)制，為導(dǎo)師南征教授運(yùn)用此三味藥治療本病提供相關(guān)佐證，并為糖尿病腎病的治療提供相關(guān)理論參考。

1 資料與方法

1.1 藥物成分篩選及其靶點(diǎn)收集和規(guī)范應(yīng)用TCMSP 平 臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharamacology Database and Analysis Platform）對檳榔、草果、厚樸三味中藥化學(xué)成分進(jìn)行搜索，并根據(jù)ADME 參數(shù)進(jìn)行篩選，保留口服生物利用度（OB）≥30%同時(shí)類藥性（DL）≥0.18的活性成分。同時(shí)通過查閱三味藥物治療糖尿病腎病有關(guān)資料補(bǔ)充相關(guān)活性成分。最后通過TCMSP 平臺收集活性成分作用靶點(diǎn)，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫對相關(guān)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范。

1.2 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)將藥物、成分、靶點(diǎn)相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并根據(jù)degree 值提取相關(guān)性強(qiáng)的活性成分。

1.3 疾病靶點(diǎn)收集和規(guī)范應(yīng)用GeneCards、DrugBank、OMIM、TTD 四個(gè)數(shù)據(jù)庫，以糖尿病腎病為主題詞進(jìn)行檢索，收集、篩選并匯集糖尿病腎病中相關(guān)基因，同樣用UniProt數(shù)據(jù)庫規(guī)范相關(guān)靶點(diǎn)名稱。

1.4 確定藥物與疾病的交集靶點(diǎn)將收集好的藥物相關(guān)靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），繪 制Venny圖，獲取“檳榔-草果-厚樸”藥對與糖尿病腎病的交集靶點(diǎn)。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將所獲取的藥物與疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0 平臺（https://www.string-db.org/），將物種設(shè)定為“Homo sapiens”，設(shè)定最小互相作用值（minimum required interaction score）>0.9，其余設(shè)置為默認(rèn)值，獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)），并將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)處理。

1.6 藥物與疾病靶點(diǎn)功能與通路富集分析將檳榔、草果、厚樸三味藥物治療糖尿病腎病的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），選擇物種為Homo sapiens 進(jìn)行生物學(xué)功能及通路的富集分析，并應(yīng)用相關(guān)平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.7 藥物活性成分-疾病-靶點(diǎn)-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建檳榔、草果、厚樸成分-糖尿病腎病-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分靶點(diǎn)獲取通過TCMSP 平臺，初步獲得檳榔化學(xué)成分52 種，篩選之后獲得8 種；初步獲得草果化學(xué)成分59 種，篩選后獲得8 種；初步獲得厚樸化學(xué)成分139 種，篩選后獲得2 種。因篩選具有相關(guān)局限性，故通過收集相關(guān)文獻(xiàn)補(bǔ)充檳榔成分1種，厚樸成分2 種。經(jīng)過篩選和補(bǔ)充，三藥的主要成分包括槲皮素（quercetin）、和厚樸酚（honokiol）、厚樸酚（Magnolol）、(+)-表兒茶素（ent-Epicatechin）、原花青素B1（Procyanidin B1）等，具體成分見表1。通過對成分的再次檢索，獲得檳榔、草果、厚樸活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)分別為41 個(gè)、174 個(gè)和94 個(gè)，三藥靶點(diǎn)匯集并去重后共獲得靶點(diǎn)191個(gè)。

表1 檳榔-草果-厚樸三藥主要成分表

2.2 藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖制作根據(jù)藥物成分及靶點(diǎn)制作相關(guān)network 文件和type 文件，并將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。通過軟件內(nèi)置Network Analyzer，根據(jù)degree 值提取位于前十的活性成分為槲皮素（quercetin）、和厚樸 酚（honokiol）、厚 樸 酚（Magnolol）、桉 葉 油 醇（Eucalyptol）、(+)-表兒茶素（ent-Epicatechin）、(-)-兒茶素[(-)-catechin]、原花青素B1（Procyanidin B1）、鄰苯二甲酸二己酯（WLN:6OVR BVO6）、(4E,6E)-1,7-二(4-羥基苯基)-4,6-庚二烯-3-酮[(4E,6E)-1,7-bis(4-hydroxyphenyl)hepta-4,6-dien-3-one]、新 橙 皮 苷（Neohesperidin）。主要成分degree值見表2。

圖1 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 關(guān)鍵成分degree值表

2.3 疾病相關(guān)靶點(diǎn)獲取從GeneCards 數(shù)據(jù)庫中獲取糖尿病腎病靶點(diǎn)3459個(gè)，設(shè)定Score>中位數(shù)后獲取靶點(diǎn)1751 個(gè)，通過DrugBank、OMIM、TTD 三個(gè)數(shù)據(jù)庫對糖尿病腎病靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充，經(jīng)過匯總?cè)ブ貜?fù)值后共獲得糖尿病腎病靶點(diǎn)1784個(gè)。

2.4 藥物與疾病的交集靶點(diǎn)獲取將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)分別導(dǎo)入相關(guān)網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），繪制藥物疾病靶點(diǎn)交集Venny 圖，見圖2，并獲取藥物與疾病的交集靶點(diǎn)，共115個(gè)。

圖2 檳榔-草果-厚樸與糖尿病腎病交集靶點(diǎn)Venny圖

2.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將所獲取的藥物與疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0 平臺，經(jīng)過最小互相作用值>0.9 篩選后獲得靶點(diǎn)104 個(gè)，并構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI 網(wǎng)絡(luò)），并將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，利用軟件的NetworkAnalyzer功能對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，使PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)根據(jù)degree值呈現(xiàn)大小與顏色深淺的變化（節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深表示degree 值高），見圖3。再根據(jù)degree值排序獲得藥物作用于疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)為AKT1、MAPK1、TP53、IL6、VEGFA等。

圖3 “檳榔-草果-厚樸”糖尿病腎病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 生物學(xué)功能與通路富集分析將檳榔-草果-厚樸與糖尿病腎病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物學(xué)功能及通路的富集分析，并對結(jié)果進(jìn)行可視化，如圖4～圖7。

圖4～圖7 藥物治療疾病靶點(diǎn)功能與通路的富集分析圖

2.7 藥物成分-疾病-靶點(diǎn)-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建制作成分、疾病、靶點(diǎn)、通路相關(guān)network 文件和type 文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建藥物成分-疾病-靶點(diǎn)-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)圖，同樣使用Network Analyzer 功能對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，使PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)根據(jù)degree 值呈現(xiàn)大小與顏色深淺的變化（節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深表示degree值越高），見圖8?？芍?，關(guān)鍵靶點(diǎn)為AKT1、MAPK1、TP53、IL6、VEGFA；關(guān)鍵 通 路為PI3K-Akt、HIF-1、MAPK、FoxO等信號通路。

圖8 成分-疾病-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

3.1 “檳榔-草果-厚樸”的作用檳榔為達(dá)原飲之君藥，草果、厚樸為達(dá)原飲之臣藥，三藥共同構(gòu)成了達(dá)原飲開達(dá)膜原、辟穢化濁的基礎(chǔ)。檳榔是棕櫚科植物檳榔的干燥成熟種子[8]，功能殺蟲、行氣、利水、消積、截瘧。草果為姜科植物草果的干燥成熟果實(shí)，有燥濕溫中、截瘧除痰之功效。厚樸為木蘭科植物厚樸的干燥干皮、根皮、枝皮，可行氣燥濕消痰、下氣除滿平喘。三藥皆為辛溫之藥，相輔相成，功效顯著。檳榔雖歸經(jīng)于陽明[9]，其疏利之性卻能透腸胃、搜膜原；草果雖歸于脾經(jīng)，其烈性卻可透脾臟達(dá)膜原；厚樸行氣散結(jié)之力強(qiáng)，可在兩藥引導(dǎo)之下直擊伏于膜原之邪并導(dǎo)之以出。歷代醫(yī)家多應(yīng)用達(dá)原飲治療瘧疾、疫戾之病?，F(xiàn)代醫(yī)家在此基礎(chǔ)上，將達(dá)原飲應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域。楊進(jìn)教授[10]將達(dá)原飲的治療思路運(yùn)用到多種疾病的治療上，將檳榔、草果、厚樸三藥應(yīng)用于濕濁郁閉三焦之口腔潰瘍、干燥綜合征等。吳耀南[11]運(yùn)用達(dá)原飲治療慢性肝病，認(rèn)為此病為邪氣伏于膜原，故從膜原論治。陳蓓華[12]以檳榔、草果、厚樸為主藥治療小兒病毒性腦炎，總有效率達(dá)90.5%。林霜霜[13]還將達(dá)原飲加減應(yīng)用于小兒腸系膜淋巴結(jié)炎。在新型冠狀病毒肺炎的治療上，余漢先[14]認(rèn)為，達(dá)原飲能祛胸中膜原之邪，若理化檢查符合肺外帶、肺下葉毛玻璃影等指征時(shí)可以達(dá)原飲為底方進(jìn)行治療，對患者病情有顯著的改善作用。田和炳[15]將檳榔、草果、厚樸作為新型冠狀病毒肺炎瘥后防復(fù)的宣透方，以達(dá)膜原清透余邪，改善瘥后不適癥狀。

“膜原”一詞最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，其廣泛分布在人體，內(nèi)與臟腑相連，外與體表相通，并與三焦有關(guān)。明代吳又可在《溫疫論》提出疫戾邪氣從口鼻侵犯人體，病位不在臟腑和經(jīng)絡(luò)，而為半表半里之膜原，并運(yùn)用達(dá)原飲開達(dá)膜原、辟穢化濁以治療瘟疫之氣伏于膜原[16]。南征教授在繼承膜原理論的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為，膜原非獨(dú)疫病可侵入，頑固、穢濁之邪同樣可入膜原[17]。消渴腎病是由于消渴日久，臟腑功能失常，毒邪伏于膜原，損傷腎絡(luò)所致，關(guān)鍵病機(jī)為毒損腎絡(luò)。本病之毒邪深藏膜原，故藥難及，邪難出。所以在治療時(shí)運(yùn)用“達(dá)膜原”的方法，用達(dá)原飲中三味主藥檳榔、草果、厚樸，其中檳榔辛散化濁，厚樸行氣散結(jié)，草果芳香辟穢。三藥合用可直達(dá)膜原，使深伏之毒邪潰敗，祛毒邪外出，在本病的治療上發(fā)揮了重要作用。

3.2 “檳榔-草果-厚樸”的藥理學(xué)分析現(xiàn)代藥理研究顯示，檳榔的成分有生物堿、酚類、氨基酸、維生素等[18]。具體成分包括原花青素A1、原花青素B1等，這類物質(zhì)具有良好的抗氧化作用，可以應(yīng)用于氧化應(yīng)激損傷造成的多種慢性疾病。袁列江等[19]在研究檳榔提取物時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同提取方式提取的檳榔活性成分均能在抗氧化方面發(fā)揮相應(yīng)作用。姚起鑫等[20]研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿能夠調(diào)節(jié)糖代謝及脂代謝，其降糖原理是減少肝臟糖異生。草果中含有多種活性成分[21]，如酚類、黃酮、揮發(fā)油、花青素以及微量元素等，揮發(fā)油為其主要成分,草果揮發(fā)油[22]的兩種成分可協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抗腫瘤。草果甲醇提取物具有抗氧化活性作用，還可降低甘油三酯和血糖。厚樸的化學(xué)成分[23]主要為酚性化合物及揮發(fā)油等。厚樸酚、和厚樸酚為主要酚類活性物質(zhì)，可明顯改善機(jī)體糖脂代謝，同時(shí)抗炎、抗氧化，和厚樸酚還有治療腹瀉、抗抑郁、降血糖的作用。厚樸揮發(fā)油（主要為桉葉油醇）及黃酮等成分也有良好的抗炎、抗氧化作用。

以往對檳榔、草果、厚樸單獨(dú)的藥理研究很多，但對于三藥共同作用的研究相對缺乏，其對糖尿病腎病治療方面的藥理研究也相對匱乏。本研究通過對檳榔、草果、厚樸三藥的活性成分如槲皮素、和厚樸酚、厚樸酚、(+)-表兒茶素、原花青素B1等的分析，找到其治療糖尿病腎病的相關(guān)靶點(diǎn)共115個(gè)，主要有AKT1、MAPK1、TP53、IL6、VEGFA 等，經(jīng)過通路與生物進(jìn)程分析找到三藥發(fā)揮作用的生物學(xué)通路主要是PI3KAkt、HIF-1、MAPK、FoxO等信號通路。相關(guān)具體分析如下。

3.2.1 藥物活性成分分析 槲皮素為黃酮類化合物，生物活性及藥用價(jià)值都很高，具有抗炎、抗氧化的作用，對糖尿病腎病有很好的療效。靳麗英等[24]通過研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過增強(qiáng)podocin4（足突蛋白）及nephrin（腎病蛋白）的表達(dá)，減少糖尿病腎病足細(xì)胞損傷，從而降低蛋白尿。宋其蔓等[25]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可激活PI3K-Akt 信號通路，從而在糖尿病腎病患者的治療上起到抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)細(xì)胞活力的作用。和厚樸酚為厚樸中含有的小分子多酚[26]，吳芳等[27]研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚具有抗炎、抗菌、抗氧化的作用，對于糖尿病腎病的氧化應(yīng)激損傷具有切實(shí)的治療作用。厚樸酚對GK大鼠糖尿病腎病模型有一定的保護(hù)作用[28]，可降低血糖并降低血漿胰島素，降低尿蛋白，同時(shí)降低內(nèi)生肌酐清除率。(+)-表兒茶素[29]是一種兒茶素和多酚,具有抗氧化活性。原花青素B1[30]是8種原花青素中活性最強(qiáng)的，可清除有毒自由基，并且有抗炎、降血脂等功用，可抑制炎癥反應(yīng)，減輕細(xì)胞損傷，可預(yù)防和治療長期炎癥導(dǎo)致的慢性疾病，如糖尿病及其并發(fā)癥如糖尿病腎病。

3.2.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 AKT1 是AKT 激酶的一種。AKT 可介導(dǎo)葡萄糖的攝取和調(diào)節(jié)[31]。AKT1 調(diào)節(jié)許多過程，包括細(xì)胞存活、增殖、代謝、生長等[32]。MAPK1是MAP 激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分，可介導(dǎo)多種生物學(xué)功能，如細(xì)胞生長、黏附、存活和分化[33]。TP53誘導(dǎo)的TRGAR[34]（凋亡調(diào)節(jié)因子）可維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝。IL6參與免疫、組織再生和新陳代謝，可在組織損傷期間進(jìn)行宿主防御，并可通過GLP-1 介導(dǎo)提高胰島素敏感性，以適應(yīng)胰島素需求的變化[35]。陳麗萍等[36]研究發(fā)現(xiàn)，IL6與糖尿病腎病炎性因子相關(guān)。IL6 可協(xié)調(diào)胰島素需求，但過量會損傷胰島細(xì)胞，且會刺激腎小球膜細(xì)胞增生。VEGFA 可誘導(dǎo)血管通透性增加并抑制細(xì)胞凋亡[37]。VEGF 升高可促使血管內(nèi)皮功能損傷，并損傷腎臟基質(zhì)及其上皮細(xì)胞[38]。

3.2.3 主要通路及功能分析 在糖尿病腎病中，PI3K-Akt 信號通路是一條重要的免疫炎癥機(jī)制通路[39]，可防止細(xì)胞凋亡、加快細(xì)胞增殖，在疾病進(jìn)展過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt信號通路過度激活與本病的發(fā)生密切相關(guān)[40]。HIF-1信號通路可改善缺氧[41]，但也可對本病起到促進(jìn)作用。在糖尿病腎病早期，HIF-1 信號通路主要起保護(hù)作用，但在糖尿病腎病不斷進(jìn)展的過程中，其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用會引起腎臟受損。MAPK 信號通路能對細(xì)胞的代謝凋亡產(chǎn)生調(diào)控作用，可影響組織細(xì)胞糖代謝，從而影響本病進(jìn)展[42]。FoxO 信號通路對葡萄糖產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)錄起到促進(jìn)作用，但是FoxO 依賴的轉(zhuǎn)錄如果增強(qiáng)也會起反向作用，如引發(fā)高血糖。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對“檳榔-草果-厚樸”藥對治療糖尿病腎病的相關(guān)藥理機(jī)制進(jìn)行了初步探究，研究結(jié)果初步預(yù)測了三味藥成分對應(yīng)的靶點(diǎn)作用于本病的相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步將膜原理論應(yīng)用于DKD 的治療提供了先導(dǎo)信息和基礎(chǔ)，也為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究其它方藥的作用機(jī)制提供相應(yīng)借鑒。