轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾雷公藤甲素脂質(zhì)體的制備與體外評價

楊一帆，梁藝瑤，劉保保，蘇雪蓉，喬 萍，狄留慶，趙曉莉

·藥劑與工藝·

轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾雷公藤甲素脂質(zhì)體的制備與體外評價

楊一帆，梁藝瑤，劉保保，蘇雪蓉，喬 萍，狄留慶，趙曉莉*

南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210023

制備轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）修飾的雷公藤甲素（triptolide，TP）脂質(zhì)體（Tf-TP@Lip），并對其進(jìn)行質(zhì)量評價和體外靶向性研究。采用薄膜分散法制備Tf-TP@Lip，以包封率和載藥量為考察指標(biāo)，通過單因素考察和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法篩選處方和最佳制備工藝；采用超濾離心法測定藥物包封率；透射電子顯微鏡（TEM）觀察脂質(zhì)體微觀形態(tài)；激光粒度儀測定脂質(zhì)體的粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）和Zeta電位；并對其體外釋放情況進(jìn)行考察；采用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡探究細(xì)胞攝取情況。優(yōu)化后Tf-TP@Lip的處方和工藝：脂藥比為5.72∶1，脂膽比為8.11∶1，磷脂與DSPE-PEG2000的質(zhì)量比為6∶1，成膜溶劑為無水乙醇，成膜溫度60 ℃。制得的Tf-TP@Lip平均粒徑為（130.33±1.89）nm，PDI為0.19±0.03，Zeta電位為（?23.20±0.64）mV，包封率和載藥量分別為（85.33±0.41）%和（9.96±0.21）%，TEM下呈球形，大小均勻、圓整。體外釋放研究表明，Tf-TP@Lip相比游離TP具有一定緩釋效果。與非靶向雷公藤甲素脂質(zhì)體（TP@Lip）相比，轉(zhuǎn)鐵蛋白的修飾明顯增加了SMMC-7721對脂質(zhì)體的攝取效率。制備Tf-TP@Lip穩(wěn)定、可行，粒徑小、外觀圓整且具備較高的包封率和載藥量，可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

雷公藤甲素；轉(zhuǎn)鐵蛋白；修飾；脂質(zhì)體；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；質(zhì)量評價；細(xì)胞攝取；體外靶向性；薄膜分散法；超濾離心法

雷公藤甲素（triptolide，TP），又稱雷公藤內(nèi)酯醇，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤中分離純化得到的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物?，F(xiàn)代研究表明，雷公藤甲素具有廣泛高效的抗腫瘤活性[1]，但存在水溶性差、生物利用度低以及治療窗窄等問題[2]，導(dǎo)致其對體內(nèi)靶器官產(chǎn)生不同程度的毒性作用[3]。為克服以上問題，研究者通過增強(qiáng)TP水溶性的結(jié)構(gòu)修飾[4]，也嘗試改進(jìn)劑型或改變給藥方式[5]以提高TP的水溶性，減緩TP體內(nèi)釋放，增加TP的靶向性。脂質(zhì)體具備磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，能夠增加難溶性藥物的溶解度，降低血液清除率，延長藥物在體內(nèi)的半衰期，從而提高生物利用度[6]。

通過在脂質(zhì)體表面引入與腫瘤細(xì)胞有特異性結(jié)合的靶向分子（如多肽、單糖、多糖、葉酸、抗體、抗體片段等），可促進(jìn)納米藥物在腫瘤組織處的滯留，從而增強(qiáng)納米藥物的內(nèi)吞效率和腫瘤細(xì)胞內(nèi)的富集[7]。由于鐵代謝異常，多種腫瘤細(xì)胞包括人肝癌SMMC-7721細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB 231細(xì)胞、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MB細(xì)胞和人肺癌A549細(xì)胞均過表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）[8]。目前，已經(jīng)報道轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）修飾的納米制劑包括脂質(zhì)體[9]、聚合物囊泡[8]、聚合物納米粒[10]等。本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散法制備轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾雷公藤甲素脂質(zhì)體（transferrin modified triptolide liposome，Tf-TP@Lip），通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化處方制劑工藝，對其形態(tài)、粒徑、包封率以及體外釋放進(jìn)行評價，并進(jìn)一步通過細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)考察Tf-TP@ Lip的體外靶向性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

梅特勒MS105十萬分之一電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，南京文爾儀器設(shè)備有限公司；SM-1000D超聲波細(xì)胞破碎儀，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司；ZS90型納米粒徑測定儀，英國馬爾文儀器有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；HT7800透射電子顯微鏡（TEM），日本日立公司；Nikon Ti倒置顯微鏡，日本Nikon有限公司；Gallios流式細(xì)胞儀，美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 材料

雷公藤甲素對照品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，批號FY105B201，南通飛宇生物科技有限公司；氫化大豆磷脂酰膽堿（HSPC，批號B60455）、膽固醇（CHO-HP，批號B80859）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000，批號B90396），上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司；Traut試劑，批號4781-83-3，南京金益柏生物科技有限公司；磷脂聚乙二醇馬來酰亞胺（Mal-PEG2000-DSPE，批號RD0200708），西安瑞禧生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，批號P1010），索萊寶生物科技有限公司；聚山梨酯80（批號9005-65-6）、MTT（批號I1810035），南京晚晴化玻儀器有限公司；香豆素-6，碧云天有限公司；DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液，美國Hyclone公司；胎牛血清，美國Gibco公司。無水乙醇、甲醇、氯仿為分析純；乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 DSPE-PEG2000-Tf的合成與鑒定[11]

稱取約20 mg轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于2 mL pH 8的PBS中，在PBS中加入EDTA，螯合溶液中的二價金屬，防止巰基氧化。另稱取4 mg Traut試劑溶于1 mL的pH 8.0的PBS中，向轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液中加入20倍物質(zhì)的量過量的Traut試劑，避光搖床內(nèi)反應(yīng)1 h。取9.0 mg Mal-PEG2000-DSPE溶于2.5 mL pH 6.5的PBS中，按一定的物質(zhì)的量比例將硫醇化的轉(zhuǎn)鐵蛋白與Mal-PEG2000-DSPE在避光條件下反應(yīng)過夜，即獲得DSPE-PEG2000-Tf（合成流程見圖1）。通過SDS-PAGE電泳法和紫外-可見光譜法對合成物進(jìn)行表征，結(jié)果見圖2，DSPE-PEG2000-Tf電泳條帶在100 000左右，而轉(zhuǎn)鐵蛋白條帶在77 000左右，證明合成物中包含轉(zhuǎn)鐵蛋白，圖3表明合成物具有與轉(zhuǎn)鐵蛋白相似的紫外吸收曲線，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白最大吸收波長為280 nm，DSPE-PEG2000-Tf最大波長在278 nm發(fā)生了藍(lán)移，以此證明轉(zhuǎn)鐵蛋白偶聯(lián)成功。

圖1 DSPE-PEG2000-Tf的合成流程

1-Marker 2-DSPE-PEG2000-Tf（Mal-Tf物質(zhì)的量比為10∶1） 3-轉(zhuǎn)鐵蛋白

圖3 合成物的紫外吸收曲線

2.2 雷公藤甲素脂質(zhì)體（triptolide liposomes，TP@Lip）和Tf-TP@Lip的制備

采用薄膜分散法制備載藥脂質(zhì)體，精密稱取適量氫化大豆卵磷脂、膽固醇、DSPE-mPEG2000和雷公藤甲素于茄形瓶中，加入適量有機(jī)溶劑超聲使其全部溶解，在一定溫度下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，形成均勻類脂薄膜后繼續(xù)抽真空30 min，并放置過夜，以除盡殘留的痕量有機(jī)溶劑；再加入適量去離子水，常壓旋轉(zhuǎn)水化30 min后，置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲依次經(jīng)過0.2、0.1 μm聚碳酸纖維脂膜擠壓6次，即得TP@Lip脂質(zhì)體溶液，于4 ℃冰箱中保存，備用[12]。將制得的TP@Lip脂質(zhì)體與Tf-PEG2000-DSPE在60 ℃溫育2 h，制備Tf-TP@Lip。

2.3 脂質(zhì)體包封率的測定

通過超濾離心法將未包封的藥物與脂質(zhì)體溶液分離，并采用“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件檢測并計(jì)算Tf-TP@Lip的包封率[13]：精密量取40 μL脂質(zhì)體溶液，加入20倍量的甲醇，超聲20 min破乳，測定TP的總量（drug）。另精密量取0.2 mL脂質(zhì)體溶液于超濾離心管（截留相對分子質(zhì)量30 000），4500 r/min離心（離心半徑9 cm）5 min，得到游離的TP，測定游離的藥物含量（drug），計(jì)算包封率和載藥量。

包封率＝(drug－drug)/drug

載藥量＝(drug－drug)/脂質(zhì)總量

2.4 TP含量測定方法建立

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters X-Bridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（35∶65）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長218 nm；柱溫28 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取TP對照品2.45 mg，置于2 mL量瓶中，加入適量無水乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1.225 mg/mL的對照品儲備液，備用。

2.4.3 供試品溶液制備 精密量取40 μL TP@Lip溶液，加入20倍量的甲醇，超聲破乳20 min，12 000 r/min離心（離心半徑11 cm）15 min，取上清液，即得TP@Lip破乳液。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下TP對照品儲備液，用無水乙醇稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為12.25、6.12、3.06、1.53、0.77、0.38 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以TP對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積的積分值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得TP線性回歸方程＝84 273＋8 031.6，2＝0.999 9。結(jié)果表明TP在0.38～12.25 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密量取適量的TP對照品儲備液，加適量甲醇配制低、中、高（5、50、250 μg/mL）3個質(zhì)量濃度的對照品溶液。按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，考察其精密度。結(jié)果低、中、高3個質(zhì)量濃度TP峰面積的RSD分別為0.61%、0.36%、0.28%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批TP@Lip樣品6份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果TP峰面積的RSD為2.90%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 取空白脂質(zhì)體6份，每份0.2 mL，分別加入TP對照品溶液（1.02 mg/mL）0.2 mL，渦旋混勻，取40 μL，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果平均回收率為93.3%，RSD為1.84%。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取TP@Lip破乳液，分別于放置0、2、4、8、16、24 h時進(jìn)樣測定，結(jié)果TP@Lip破乳液峰面積RSD為2.6%，表明TP@Lip破乳液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 Tf-TP@Lip制備工藝及處方的單因素考察

2.5.1 成膜條件考察 薄膜分散法制備脂質(zhì)體的關(guān)鍵是成膜性的好壞[14]。固定其他因素不變，選取不同的成膜溶劑對應(yīng)適宜的成膜溫度，按“2.2”項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，按“2.3”項(xiàng)下方法計(jì)算包封率，結(jié)果如表1所示，在3種條件下脂質(zhì)體成膜性均良好且包封率無明顯差異，出于安全性考慮，選擇成膜溶劑為無水乙醇，溫度為60 ℃。另由于藥物及膜材在無水乙醇中溶解度小，需進(jìn)行恒溫（45 ℃）超聲處理，可較快溶解。

表1 薄膜分散法成膜條件及結(jié)果(, n = 3)

Table 1 Film forming conditions and results of film dispersion method (, n = 3)

成膜溶劑成膜溫度/℃包封率/% 無水乙醇6078.2±1.6 氯仿4079.2±2.4 甲醇5576.5±1.9

2.5.2 磷脂質(zhì)量濃度的考察 設(shè)置水化溶劑的體積為2.5 mL，固定處方組成比例及其他制備工藝條件，磷脂質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0.5、1.0、2.0 mg/mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，各平行試驗(yàn)3份，包封率分別為（83.9±2.2）%、（74.8±1.4）%、 （67.5±1.6）%。以上結(jié)果表明，當(dāng)磷脂濃度過高，包封的藥物達(dá)到飽和，包封率反而下降，因此，選擇磷脂質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

2.5.3 藥脂比的考察 固定處方的其他條件不變，改變投藥量，設(shè)定藥脂比為1∶30、1∶20、1∶10、1∶5、1∶2。按“2.1”項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，各平行試驗(yàn)3份，結(jié)果包封率分別為（59.2±1.9）%、（75.2±1.6）%、（82.9±0.4）%、（80.0±1.2）%、（62.9±2.5）%。由以上結(jié)果可知，當(dāng)藥脂比小于1∶5時，其包封率隨著投藥量的增加而增大，但由于氫化大豆卵磷脂對TP的負(fù)載能力有限，當(dāng)藥脂比大于1∶5時，負(fù)載達(dá)到飽和，繼續(xù)增加投藥量，其包封率開始下降，因此選擇藥脂比1∶5左右范圍繼續(xù)考察。

2.5.4 脂膽比的考察 膽固醇是脂質(zhì)體中重要組成部分，具有維持脂質(zhì)體穩(wěn)定等作用，但過量存在影響人體健康的隱患[15]。固定處方其他條件不變，改變脂膽比，設(shè)置磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為10∶1、5∶1、2∶1，按“2.2”項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，各平行試驗(yàn)3份，結(jié)果包封率分別為（75.2±1.6）%、（71.2±2.7）%、（66.5±1.8）%。

2.5.5 磷脂與DSPE-PEG2000質(zhì)量比的考察 處方中加入DSPE-PEG2000能夠避免靜脈給藥后血液中巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)體的吞噬作用，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。但DSPE-PEG2000加入量過多則易與磷脂形成混合膠束，造成脂質(zhì)體中藥物的滲漏[16]。固定其他條件不變，改變DSPE-PEG2000加入量，設(shè)置磷脂與其比例分別為8∶1、4∶1、1∶1，按“2.2”項(xiàng)下方法制備脂質(zhì)體，各平行試驗(yàn)3份，結(jié)果包封率分別為（73.2±0.7）%、（75.9±0.4）%、（69.9±1.1）%。

2.6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化處方

2.6.1 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果 應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以雷公藤甲素脂質(zhì)體包封率（1）和載藥量（2）為響應(yīng)值，影響較為顯著的藥脂比（1）、脂膽比（2）和磷脂與DSPE-PEG2000質(zhì)量比（3）3個因素為考察對象，采取3因素5水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法，確定最佳制備工藝?？疾煲蛩厮健⒃囼?yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.6.2 模型擬合 以包封率、載藥量為響應(yīng)面，對星點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到方程為1＝29.919 9＋12.122 561＋2.761 692－3.414 073－0.126 6012＋0.293 5013＋0.166 7523－0.809 8612－0.161 7422＋0.171 3432；2＝2.148 55－0.056 3981＋0.671 422＋1.834 333－0.054 10012＋0.021 25013－0.048 12523－0.018 58812－8.677 58×10?322－0.082 51932。方差分析見表3。模型＜0.05，具有顯著性影響，而失擬項(xiàng)＞0.05，表明失擬不顯著。模型的相關(guān)系數(shù)（2）為0.962 2、0.891 6，表明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度良好，用該模型分析和預(yù)測脂質(zhì)體的制備工藝是合適的。

表2 星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 2 Design and results of CCD method

試驗(yàn)號X1X2X3包封率/%載藥量/%試驗(yàn)號X1X2X3包封率/%載藥量/% 15.0 (0)10 (0)7.36 (+1.682)84.9911.09115.0 (0)10 (0)4 (0)76.969.08 25.0 (0)10 (0)4 (0)78.738.91125.0 (0)10 (0)4 (0)80.3810.52 37.5 (+1)15 (+1)6 (+1)78.976.60135.0 (0)10 (0)0.64 (?1.682)76.314.36 45.0 (0)10 (0)4 (0)74.998.88142.5 (?1)5 (?1)2 (?1)58.968.66 59.2 (+1.682)10 (0)4 (0)81.425.99155.0 (0)1.59 (?1.682)4 (0)69.326.90 62.5 (?1)15 (+1)2 (?1)55.7510.28167.5 (+1)5 (?1)2 (?1)81.175.48 75.0 (0)10 (0)4 (0)76.409.06177.5 (+1)15 (+1)2 (?1)66.165.05 85.0 (0)18.41 (+1.682)4 (0)65.239.19180.8 (?1.682)10 (0)4 (0)47.3710.67 95.0 (0)10 (0)4 (0)74.118.05192.5 (?1)5 (?1)6 (+1)59.2311.71 107.5 (+1)5 (?1)6 (+1)81.849.61202.5 (?1)15 (+1)6 (+1)57.2212.06

表3 包封率和載藥量方差分析

Table 3 Analysis of variance of entrapment efficiency and drug loading

來源自由度包封率載藥量 離均差平方和均方F值P值離均差平方和均方F值P值 模型92 095.09232.7928.31＜0.000 184.659.419.140.000 9 A11 319.611 319.61160.50＜0.000 141.6241.6240.45＜0.000 1 B165.8165.818.000.017 90.420.420.400.539 5 C165.1065.17.920.018 334.8934.8933.910.000 2 AB120.0320.032.440.149 63.663.663.560.088 7 AC117.2317.232.100.178 30.090.090.0880.773 1 BC122.2422.242.710.131 01.851.851.800.209 3 A21369.22369.2244.91＜0.000 10.190.190.190.672 9 B21235.61235.6128.660.000 30.680.680.660.435 8 C216.776.770.820.385 51.571.571.530.245 0 殘差1082.228.22 10.291.03 失擬項(xiàng)555.0811.022.030.227 97.091.422.210.202 1 純誤差527.145.43 3.200.64 總差192 177.30 94.94

2.6.3 效應(yīng)面分析 通過Design Expert 8.0.6.1軟件對各因素之間的交互作用進(jìn)行效應(yīng)面分析，繪制效應(yīng)面曲線圖。結(jié)果見圖4～5。

2.6.4 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 為了得到最佳處方，以脂質(zhì)體包封率和載藥量處于最大值為優(yōu)化指標(biāo)，權(quán)重設(shè)置1∶1。通過Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行分析優(yōu)化，得到最佳處方為脂藥比為5.72∶1，脂膽比為8.11∶1，磷脂與DSPE-PEG2000的質(zhì)量比為6∶1。

2.7 最佳工藝驗(yàn)證

確定Tf-TP@Lip最優(yōu)處方為脂藥比為5.72∶1，脂膽比為8.11∶1，磷脂與DSPE-PEG2000的質(zhì)量比為6∶1。按照該處方工藝條件制備3批雷公藤甲素脂質(zhì)體樣品，各批樣品包封率分別為84.98%、86.14%、84.86%，載藥量為10.21%、9.55%、10.11%。將檢測結(jié)果與擬合方程的預(yù)測值進(jìn)行對比，按公式［相對偏差＝(預(yù)測值－實(shí)測值)/預(yù)測值］計(jì)算相對偏差，結(jié)果表明實(shí)測值與預(yù)測值之間的相對偏差＜5%，說明優(yōu)選的處方工藝穩(wěn)定可行。

2.8 Tf-TP@Lip的質(zhì)量評價

2.8.1 Tf-TP@Lip的外觀與形態(tài) 在日光下檢視，按最佳工藝制備得到的Tf-TP@Lip外觀澄清透明，呈淡藍(lán)色乳光，結(jié)果見圖6（左）。將Tf-TP@Lip混懸液滴入銅網(wǎng)，然后用2%磷鎢酸染色制備樣品，在臺燈下對樣品進(jìn)行干燥處理后，置于TEM下觀察。Tf-TP@Lip呈球形，圓整，分布均勻，如圖6（右）所示。

圖4 基于效應(yīng)曲面法不同因素對包封率的影響

圖5 基于效應(yīng)面法不同因素對載藥量的影響

2.8.2 粒徑與電位考察 將適量最優(yōu)工藝制備所得脂質(zhì)體稀釋一定倍數(shù)后，于激光粒度分析儀下測定粒徑、多分散系數(shù)（PDI）及Zeta電位，平行測定3次。Tf-TP@Lip的平均粒徑和PDI分別為（130.33±1.89）nm和0.19±0.03（圖7），Zeta電位為（?23.20±0.64）mV（圖7）。結(jié)果表明，該脂質(zhì)體粒徑分布均勻且具備良好的負(fù)電性。

圖6 Tf-TP@Lip的表觀形態(tài) (左)和TEM圖 (右)

圖7 Tf-TP@Lip的粒徑分布(a)和Zeta電位(b)

2.8.3 體外釋放 采用透析袋法考察游離TP、TP@ Lip和Tf-TP@Lip的體外釋放情況[17]。取5 mL脂質(zhì)體溶液置于透析袋中，加入釋放介質(zhì)（含1%吐溫80的PBS溶液，pH 7.4）200 mL，于37 ℃、100 r/min恒溫震蕩。分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h取樣2 mL（同時補(bǔ)充等溫等量釋放介質(zhì)），用HPLC法測定雷公藤甲素含量，計(jì)算各時間點(diǎn)的累積釋放率并作圖（＝3）。結(jié)果如圖8所示，由于脂質(zhì)體表面攜帶的雷公藤甲素迅速釋放，使藥物存在突釋階段，1 h之后進(jìn)入緩釋期，4 h后藥物釋放基本平穩(wěn)，12 h測得的累積釋放率為70.8%，表明藥物在體外釋放呈先快后慢的規(guī)律，能夠維持較長的釋放周期，呈現(xiàn)緩釋現(xiàn)象。

圖8 Tf-TP@Lip的釋放曲線

2.9 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

2.9.1 香豆素-6儲備液制備 精密稱取香豆素-6適量于2 mL量瓶中，三氯甲烷溶解定容至刻度，制成2 mg/mL的香豆素-6溶液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.9.2 熒光脂質(zhì)體的制備 取脂質(zhì)體膜材HSPC、CHO和DSPE-PEG2000，加入用無水乙醇稀釋至一定濃度的香豆素-6溶液溶解完全，按照“2.2”項(xiàng)下制備方法分別制備得到靶向熒光脂質(zhì)體（Tf-C6@ Lip）、非靶向熒光脂質(zhì)體（C6@Lip）。

2.9.3 細(xì)胞攝取 將靶向熒光脂質(zhì)體（Tf-C6@ Lip）、非靶向熒光脂質(zhì)體（C6@Lip）與肝癌SMMC- 7721細(xì)胞在5% CO2、37 ℃環(huán)境中孵育4 h。之后，用PBS洗滌細(xì)胞，DAPI染色10 min。使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行分析，同時使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，以驗(yàn)證流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果。流式細(xì)胞術(shù)測試結(jié)果顯示（圖9-A），靶向脂質(zhì)體在SMMC-7721細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度明顯高于非靶向脂質(zhì)體，熒光顯微鏡的測試結(jié)果與流式細(xì)胞儀一致（圖9-B），說明轉(zhuǎn)鐵蛋白的修飾增強(qiáng)了SMMC-7721細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取。

圖9 Tf-TP@Lip的流式細(xì)胞儀分析 (A) 和熒光顯微鏡圖像 (B)

3 討論

轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向脂質(zhì)體遞送化合物載藥系統(tǒng)是一種有潛力的腫瘤治療藥物。篩選得到有良好抗腫瘤活性的化合物，通過轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)的包載能克服原化合物難于吸收，直接給藥效果差等缺點(diǎn)，達(dá)到延長循環(huán)時間，腫瘤靶向的作用效果。本研究將轉(zhuǎn)鐵蛋白與雷公藤甲素脂質(zhì)體相結(jié)合，構(gòu)建主動靶向納米傳遞系統(tǒng)，結(jié)合了天然藥物與分子靶向藥物的優(yōu)點(diǎn)，并且處方中選用常用、安全的氫化大豆卵磷脂和膽固醇作為脂質(zhì)體材料，價廉易得，便于后續(xù)產(chǎn)品放大和臨床應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散法制備Tf-TP@Lip，制備脂質(zhì)體的過程中成膜性的好壞是關(guān)鍵，應(yīng)注意成膜性的考察。選取無水乙醇、氯仿、甲醇3種成膜溶劑研究其對脂質(zhì)體包封率的影響。不同溶劑在相同的成膜溫度下成膜效果差異大，為防止旋蒸過程中溶劑暴沸影響成膜效果，某些溶劑如氯仿，在成膜時，溫度需控制在磷脂相變溫度（55 ℃）之下后采用脂質(zhì)體擠出器控制粒徑[18]，與超聲破碎法相比粒徑更小分散更均勻，穩(wěn)定性好。在轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾脂質(zhì)體方法上，文獻(xiàn)報道[19]有3種與脂質(zhì)體偶聯(lián)的方法，本實(shí)驗(yàn)中利用活化DSPE-PEG2000-MAL中的馬來酰胺基團(tuán)為巰基與轉(zhuǎn)鐵蛋白中的氨基反應(yīng)從而將轉(zhuǎn)鐵蛋白連接到磷脂分子上，并通過SDS-PAGE以及紫外分光度法等評價手段證明合成物偶聯(lián)成功。

在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)考察SMMC-7721細(xì)胞對不同脂質(zhì)體的攝取情況。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的脂質(zhì)體的攝取顯著高于未修飾的脂質(zhì)體，這是由于轉(zhuǎn)鐵蛋白與SMMC-7721細(xì)胞中豐富的TfR能夠特異性結(jié)合，轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾在脂質(zhì)體表面通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用透過細(xì)胞，但是具體的內(nèi)吞機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。綜上所述，本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化制備了粒徑小、分布均勻、負(fù)電性好的Tf-C6@Lip，具備一定的緩釋特性和良好的體外靶向性，為該制劑體內(nèi)外的進(jìn)一步研究等工作打下了堅(jiān)實(shí)地基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 黃宇, 馬全鑫, 凌云. 雷公藤甲素抗腫瘤藥理作用的研究進(jìn)展 [J]. 藥物評價研究, 2018, 41(2): 328-333.

[2] 宋基正, 劉宇靈, 林龍飛, 等. 雷公藤甲素抗腫瘤新型給藥系統(tǒng)研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2019, 50(5): 1269-1275.

[3] 宋祎, 劉琰, 方冰倩, 等. 雷公藤甲素抗腫瘤作用及其配伍減毒機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2021, 37(3): 457-464.

[4] Noel P, von Hoff D D, Saluja A K,. Triptolide and its derivatives as cancer therapies [J]., 2019, 40(5): 327-341.

[5] 余雅婷, 朱衛(wèi)豐, 金晨, 等. 雷公藤甲素的劑型改進(jìn)及給藥方式研究進(jìn)展 [J]. 中國新藥雜志, 2016, 25(12): 1359-1362.

[6] 郝寧, 于佳. 基于葉酸表面修飾的藍(lán)萼甲素長循環(huán)脂質(zhì)體的制備與藥效學(xué)評價 [J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2021, 38(6): 553-558.

[7] 羅堯堯, 石金鳳, 陳梁, 等. 雷公藤甲素功能化納米遞藥系統(tǒng)用于抗腫瘤的研究進(jìn)展 [J]. 中國中藥雜志, 2019, 44(21): 4566-4572.

[8] Wei Y H, Gu X L, Cheng L,. Low-toxicity transferrin-guided polymersomal doxorubicin for potent chemotherapy of orthotopic hepatocellular carcinoma[J]., 2019, 92: 196-204.

[9] Wang K, Shang F, Chen D,. Protein liposomes- mediated targeted acetylcholinesterase gene delivery for effective liver cancer therapy [J]., 2021, 19(1): 31-46.

[10] Sakpakdeejaroen I, Somani S, Laskar P,. Regression of melanoma following intravenous injection of plumbagin entrapped in transferrin-conjugated, lipid- polymer hybrid nanoparticles [J]., 2021, 16: 2615-2631.

[11] 周毓麟. 蟲草素及其轉(zhuǎn)鐵蛋白靶向脂質(zhì)體的抗腫瘤活性研究 [D]. 長春: 吉林大學(xué), 2017.

[12] 關(guān)延彬, 韓冰, 田雨冬, 等. 姜黃素脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量評價 [J]. 中藥材, 2019, 42(2): 385-389.

[13] 莊英華, 張中文, 韓偉, 等. 超濾離心法測定連翹酯苷脂質(zhì)體包封率 [J]. 中國新藥雜志, 2012, 21(18): 2209-2211,2216.

[14] 黃念. 負(fù)載蜂毒素和蟾毒靈的復(fù)方免疫脂質(zhì)體的構(gòu)建及其抑制肝癌Sorafenib耐藥協(xié)同效應(yīng)機(jī)制研究 [D].上海:中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué), 2019.

[15] 陳李霞, 丁越, 沈征武, 等. 膽固醇在脂質(zhì)體中作用及甾醇、皂苷對其替換的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2020, 51(24): 6396-6404.

[16] 任婧. 轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾姜黃素脂質(zhì)體的制備及神經(jīng)保護(hù)作用的研究 [D].石家莊:河北科技大學(xué), 2019.

[17] 李思敏, 吳文瀚, 高麗娜, 等. 檸檬苦素脂質(zhì)體的制備和制劑學(xué)評價 [J]. 中草藥, 2019, 50(24): 5957-5962.

[18] 任婧. 轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾姜黃素脂質(zhì)體的制備及神經(jīng)保護(hù)作用的研究 [D]. 石家莊: 河北科技大學(xué), 2019.

[19] Kong L, Li X T, Ni Y N,. Transferrin-modified osthole PEGylated liposomes travel the blood-brain barrier and mitigate Alzheimer’s disease-related pathology in APP/PS-1 mice [J]., 2020, 15: 2841-2858.

Preparation of transferrin modified triptolide liposomeandevaluation

YANG Yi-fan, LIANG Yi-yao, LIU Bao-bao, SU Xue-rong, QIAO ping, DI Liu-qing, ZHAO Xiao-li

Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of TCM, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To prepare transferrin (Tf) modified triptolide (TP) liposome (Tf-TP@Lip) and evaluate the quality andtargeting.The Tf-TP@Lip were prepared by thin-film dispersion method. With encapsulation efficiency and drug loading as indicators, single factor experiments and CCD-RSM were used to optimized the formulation and optimum preparation of Tf-TP@Lip; The drug entrapment efficiency was determined by ultrafiltration centrifugation; And the microscopic morphology of liposomes were observed under the transmission electron microscope (TEM); The particle size, polydispersion index (PDI), and Zeta potential were determined by laser particle size analyzer, and investigating therelease of liposomes; flow cytometry and microscope were utilized for exploring the cellular uptake.The optimized preparation process and formulation were as follow: lipid /drug ratio was 5.72:1, lipid/cholesterol ratio was 8.11:1, the mass ratio of phospholipid to DSPE-PEG2000was 6:1, the film-forming solvent was absolute ethanol and the temperature was 60 ℃. The mean particle size, PDI and Zeta potential of optimized TP@Lip were (130.33 ± 1.89) nm, 0.19 ± 0.03, (?23.2 ± 0.64) mV, respectively. The encapsulation efficiency and drug loading were (85.33 ± 0.41)% and (9.96 ± 0.21)%, respectively. The resulting liposomes exhibited spherical shape and were narrow in size distribution. Therelease studies showed that Tf-TP@Lip has sustained-release effect compared with free TP. And in contrast of non targeted triptolide liposomes (TP@Lip), Tf modification significantly increased the uptake efficiency of liposomes by SMMC-7721.The preparation is stable and feasible, the obtained liposomes have a uniform particle size, round appearance and high encapsulation efficiency and drug loading, which can be used for further research.

triptolide; transferrin; modified; liposomes; central composite design-response surface method;quality evaluation; cellular uptake;targeting;thin-film dispersion method; ultrafiltration centrifugation

R283.6

A

0253 - 2670(2022)03 - 0687 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.006

2021-08-30

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81102815）

楊一帆（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锼巹W(xué)與藥代動力學(xué)。E-mail: 773429209@qq.com

趙曉莉，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幐咝Ыo藥系統(tǒng)劑型設(shè)計(jì)與評價研究。Tel: (025)85811517 E-mail: xlee_zhao@njucm.edu.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]