不同來源竹茹藥材HPLC指紋圖譜和化學(xué)計量學(xué)分析

周冰倩，高喜梅，楊 穎，王令充，張 雯，趙曉莉，狄留慶*

不同來源竹茹藥材HPLC指紋圖譜和化學(xué)計量學(xué)分析

周冰倩1, 2，高喜梅1, 2，楊 穎1, 2，王令充1, 2，張 雯1, 2，趙曉莉1, 2，狄留慶1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210023

建立不同來源竹茹藥材HPLC指紋圖譜，結(jié)合相似度、聚類、主成分分析等化學(xué)計量手段評價不同產(chǎn)地竹茹藥材品質(zhì)，為其質(zhì)量控制研究提供技術(shù)方法借鑒和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通過HPLC梯度洗脫建立23個批次竹茹藥材的指紋圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版）對竹茹藥材HPLC指紋圖譜進行相似度評價，并采用SPSS24.0軟件進行聚類、主成分分析。選取了13個色譜共有峰，23批樣品共有峰相似度在0.713～0.991；聚類分析將23批樣品分為2類；主成分和因子分析篩選出累積方差達77.83%貢獻率的3個主成分，能夠反映23個批次竹茹藥材特征性質(zhì)量差異。建立分析的HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)評價方法，簡便可行，可為綜合評價不同產(chǎn)地竹茹藥材的質(zhì)量提供參考。

竹茹藥材；指紋圖譜；聚類分析；化學(xué)計量學(xué)；質(zhì)量評價；尿苷；腺苷；鳥苷；對羥基苯甲酸；對香豆酸

竹茹為禾本科植物青稈竹Munro大頭典竹(Munro)McClurevar.P. F. Li或淡竹(Lodd.)(Mitf.)Stapf ex Rendle的莖稈的干燥中間層，味甘，性微寒，有清熱滌痰、和胃降逆止嘔的功效[1]，資源分布廣泛，主產(chǎn)于四川、江西、湖北、安徽等地，臨床多用于治療痰熱咳嗽、胃熱嘔吐、妊娠惡阻。竹茹入藥始見于《金匱要略》，稱“竹皮”。《藥品化義》記載：“竹茹輕可去實，涼能去熱，專清痰，為寧神開郁佳品”。竹茹是臨床常用中藥之一[2]，也是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的“可用于保健食品的物品”。目前為止，《中國藥典》2020年版[3]關(guān)于竹茹藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)僅有水分和浸出物項目，其化學(xué)成分及質(zhì)量控制也未見深度研究報道。

指紋圖譜作為一種能被國內(nèi)外廣為接受的中藥質(zhì)量評價模式，具有整體性和模糊性的特點[4-5]。HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析，為整體、綜合、全面中藥材質(zhì)量控制提供了新的思路。為合理地評價藥材質(zhì)量，本實驗收集全國12個省、自治區(qū)23批不同產(chǎn)地的竹茹藥材，收集范圍基本涵蓋竹茹的主要產(chǎn)區(qū)，建立竹茹藥材的HPLC指紋圖譜，并采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版）進行相似度評價，運用SPSS軟件進行聚類分析和主成分分析，以期為竹茹藥材指標(biāo)成分的篩選及竹茹藥材的鑒定和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀，PDA檢測器和Empower工作站（美國Waters公司）；SB25-12DTD型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率220 W，頻率45 kHz）；CPA225D型1/10萬分之一電子天平（南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司）；XP6型百萬分之一天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HH-S8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）。甲醇為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），實驗用水為實驗室自制超純水。HPLC用甲醇為色譜純。

1.2 材料

對照品鳥苷（批號111977-201501）、腺苷（批號110879-201703）購自中國食品藥品檢定研究院，尿苷（批號B20907）、對香豆酸（批號B20335）、對羥基苯甲酸（批號B20328），購自源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。實驗用竹茹藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為禾本科植物青稈竹Munro大頭典竹(Munro)var.P. F. Li或淡竹(Lodd.)(Mitf.)Stapf ex Rendle的莖稈的干燥中間層，共23批，產(chǎn)地、批號及采購?fù)緩揭姳?。

表1 竹茹藥材來源

Table 1 Source of C. Bambusae In Taeniam

編號批號產(chǎn)地采購?fù)緩?S120190208江西南通精華制藥 S220190301江西南通精華制藥 S320190126四川長春市方一堂經(jīng)貿(mào)有限公司 S420180901廣西南京大華藥房 S520190403廣西毫州永剛飲片廠有限公司 S620190522廣西淘寶藥王谷中草藥銷售 S720180911浙江南通精華制藥 S820180505浙江南通精華制藥 S920190509浙江南通精華制藥 S1020190510浙江南通精華制藥 S1120190520浙江南通精華制藥 S1220190525浙江毫州永剛飲片廠有限公司 S1320190410福建南通精華制藥 S1420180402福建南通精華制藥 S1520180610安徽淘寶桃源人家 S1620190515安徽河北金葉子藥業(yè)有限公司 S1720180513安徽毫州永剛飲片廠有限公司 S1820190326湖南淘寶炳然旗艦店 S1920181201湖北南京大華藥房 S20190301c63河南淘寶佐今明大藥房 S21181200271廣東卡萊諾中港大藥房 S2220180804山東安國市芳草佳商貿(mào)有限公司 S2320190402河北淘寶聚旭堂旗艦店

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取尿苷、鳥苷、腺苷、對香豆酸、對羥基苯甲酸對照品適量，加甲醇制成含尿苷1.01 mg/mL、鳥苷1.03 mg/mL、腺苷1.02 mg/mL、對香豆酸1.02 mg/mL、對羥基苯甲酸1.01 mg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱定2.0 g竹茹藥材粉末（過2號篩），置于150 mL具塞瓶中，加水100 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取45 min，取出放冷后補足失重，10 000 r/min離心20 min。取上清液，水浴蒸干，50%甲醇復(fù)溶至2 mL，搖勻，高速離心取上清液，即得。

2.3 色譜條件

Megres C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫，0～5 min，2% A；5～15 min，2%～12% A；15～35 min，12%～18% A；35～45 min，18%～22% A；45～60 min，22%～35% A；60～75 min，35% A；75～85 min，35%～2% A；85～90 min，2% A；體積流量1 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長260 nm，柱溫30 ℃。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取S21號樣品粉末，按“2.2”項下方法制備供試品溶液適量，按“2.3”項下色譜條件進行檢測，連續(xù)進樣6次。記錄色譜圖，并計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。以7號峰對羥基苯甲酸為參照峰（S），計算得到各共有峰相對保留時間RSD為0.01%～0.12%，相對峰面積RSD為1.11%～2.24%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取S21號樣品粉末，按“2.2”項下制備方法平行制備6份，按“2.3”項下色譜條件分別進樣檢測。記錄色譜圖，并計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。以7號峰對羥基苯甲酸為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間RSD為0.03%～0.11%，相對峰面積RSD為1.42%～5.54%，樣品重復(fù)性尚可。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取S21號樣品粉末，按“2.2”項下方法制備供試品溶液適量，室溫保存，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣。記錄色譜圖，并計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。以7號峰對羥基苯甲酸為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間RSD為0.05%～0.39%，相對峰面積RSD為0.30%～2.90%，表明該供試液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 不同產(chǎn)地竹茹藥材指紋圖譜分析

2.5.1 HPLC指紋圖譜的生成 取23批竹茹藥材樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，得HPLC指紋圖譜，見圖1。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）對23批藥材樣品的HPLC圖譜進行分析，共標(biāo)定了13個共有峰，通過與對照品比對，指認出5個峰，分別為尿苷（2號峰）、腺苷（3號峰）、鳥苷（4號峰）、對羥基苯甲酸（7號峰）、對香豆酸（12號峰）。選取對羥基苯甲酸（7號峰）為參照峰，建立竹茹藥材的對照指紋圖譜、混合對照品、指紋圖譜共有模式及疊加圖見圖1。

2.5.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版），以對照指紋圖譜的HPLC圖譜為對照，進行整體相似度評價，見表2。以S1為參照圖譜，設(shè)置時間窗寬度為0.5，譜多點校正并自動匹配，按中位數(shù)法生成對照圖。結(jié)果表明，23批樣品的相似度在0.713～0.990，說明收集的不同產(chǎn)地竹茹藥材整體概貌有一定差異。

2.6 竹茹藥材指紋圖譜聚類分析

聚類分析是一種在沒有先驗知識的前提下，將每個樣本的特征數(shù)據(jù)按照性質(zhì)上的親疏程度進行分組，使其組內(nèi)個體具有高度相似性，而組間個體具有較小相似性的一種分析手段[6]。將23批不同產(chǎn)地的竹茹藥材標(biāo)定的13個共有峰面積導(dǎo)入SPSS 24.0軟件，以歐式平方距離為測度，Z標(biāo)準(zhǔn)化，采用組間連接法進行Q型聚類分析。在類間距為15時，23份樣品被分為2類。S1、S2號樣品首先聚為一類，S3～S23號樣品聚為另一類，具體見圖2。

2-尿苷 3-腺苷 4-鳥苷 7-對羥基苯甲酸 12-對香豆酸

2-uridine 3-adenosine 4-guanosine 7--hydroxybenzoic acid 12--coumaric acid

圖1 指紋圖譜共有模式(A)、混合對照品(B)及23批竹茹藥材HPLC疊加圖譜(C)

Fig. 1 Common patterns in fingerprints (A),mixed reference control (B) and HPLC superimposed spectrum of 23 batches of(C)

表2 不同產(chǎn)地竹茹藥材指紋圖譜相似度

Table 2 Similarity of fingerprints of C. Bambusae In Taeniam of 23 batches in different regions

批次相似度批次相似度 S10.729 S130.826 S20.738 S140.784 S30.972 S150.902 S40.767 S160.895 S50.895 S170.713 S60.890S180.982 S70.990 S190.914 S80.987 S200.982 S90.984 S210.911 S100.962 S220.927 S110.941 S230.739 S120.855

圖2 竹茹指紋圖譜聚類樹狀關(guān)系

2.7 主成分分析及因子分析

主成分分析是將多個相互關(guān)聯(lián)的多變量通過線性變換，在保留原始數(shù)據(jù)大部分信息的前提下將眾多變量濃縮為少數(shù)幾個變量，從而發(fā)現(xiàn)變量間的聯(lián)系的分析手段，是最常用的多指標(biāo)線性降維壓縮和多變量分析方法之一，能夠盡可能的揭示數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征，提取化學(xué)信息[7]，目前已廣泛應(yīng)用于中藥的評價與鑒別。

采用SPSS24.0軟件對23批竹茹藥材的13個共有峰峰面積原始數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分貢獻率及特征值為依據(jù)，進行主成分因子分析。本研究通過考察提取特征值、碎石圖（主成分特征值的連續(xù)陡峭部分）、累積方差貢獻率來確定最佳主成分?jǐn)?shù)。由圖3和表3可知，前3個主成分提取特征值較大（λ＞1），連線較陡峭，對解釋變量的貢獻最大，提取前3個主成分較為合適。其累積方差貢獻率為77.83%，即選取3個主成分涵蓋了13個成分77.83%的信息量。

通過正交旋轉(zhuǎn)，得到13個指標(biāo)在3個主成分中的旋轉(zhuǎn)成分矩陣，見表4。根據(jù)旋轉(zhuǎn)成分矩陣推測，影響竹茹藥材質(zhì)量差異的成分不是單一成分，而是多成分協(xié)同作用的結(jié)果[8]。由表4可知，第1主成分的信息主要來自峰1、7、8、10、11、12；第2主成分的信息主要來自2、3、4、5、6、9；第3主成分的信息主要來自色譜峰13。由竹茹藥材主成分分析三維圖可以看出，23批竹茹藥材被分為2大類，結(jié)果與聚類分析一致（圖4）。

圖3 公共因子碎石圖

表3 主成分方差分析

Table 3 Variance analysis of principal component

峰號初始特征值方差貢獻率/%累積貢獻率/% 14.7736.6836.68 24.1031.5568.23 31.25 9.6077.83

表4 竹茹藥材成分矩陣

Table 4 Component matrix ofC. Bambusae In Taeniam

峰號成分 123 1 0.782?0.023 0.022 2 0.282 0.827 0.165 3?0.244 0.866 0.005 4 0.182 0.562?0.487 5?0.056 0.904?0.046 6 0.146 0.716?0.082 7 0.961 0.047 0.192 8 0.890 0.017?0.010 9?0.095 0.811 0.224 10 0.964?0.162 0.062 11 0.933?0.251 0.163 12 0.657 0.404?0.437 13?0.052 0.331 0.816

3 討論

本實驗考察了不同提取溶劑（水，甲醇）、提取方法（加熱回流提法，超聲提取法）、提取時間（30、45、60 min）對竹茹藥材提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)加熱回流提取法與超聲提取法無顯著差異，水提取效果最佳，最終確定了竹茹藥材提取方法為水超聲提取45 min。在指紋圖譜分析方法的建深入摸索中，先后考察了不同有機相（乙腈、甲醇），水相（水、0.1%甲酸水、0.1%磷酸水）對指紋圖譜的影響。結(jié)果顯示，采用甲醇-0.1%甲酸水進行梯度洗脫，獲得的指紋圖譜基線平穩(wěn)，各個主要峰基本得到分離，且分離度良好。在全波長掃描下，260 nm檢測條件下處色譜峰出峰較多，分離度良好，各峰吸收均勻，故最終選擇的檢測波長為260 nm。龔金炎等[2]應(yīng)用高效液相半制備色譜，從竹茹中分離出苜蓿素作為對照品，本研究曾在條件摸索過程中采用UFLC-Q-TOF-MS，負離子檢測模式下檢測出低含量的苜蓿素。

圖4 竹茹藥材主成分得分圖

通過淘寶線上旗艦店、線下藥房和藥物飲片公司等途徑等收集到了23批源自12個省的藥材，其中，四川、湖南、湖北、河南、廣東、山東、河北各1批，江西、福建各2批，廣西、安徽各3批，浙江6批。在指紋圖譜HPLC分析方法建立的過程中發(fā)現(xiàn)，樣品的重復(fù)性在1.42%～5.54%。稍差的樣品測量重復(fù)性推測與樣品來源有關(guān)?！吨袊幍洹?020年版規(guī)定，竹茹的藥材基原為同種亞科不同族的植物：淡竹、青竿竹、大頭典竹，僅從竹茹藥材本身無法追溯到具體基原。另外，市售的藥材來源復(fù)雜，質(zhì)量良莠不齊，對重復(fù)性測定有一定影響。此外，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)手段，較為客觀地對樣品進行分析。23批竹茹藥材樣品的相似度為0.713～0.990，說明不同產(chǎn)地、不同來源的藥材在化學(xué)成分及含量存在一定差異。其中，同一廠家提供的同一產(chǎn)地不同批次之間的樣品相似度有所差異，這可能由于不同采收時間、地點導(dǎo)致的藥材質(zhì)量差異。為保證藥材質(zhì)量的批間一致性，可建議廠家或產(chǎn)地加工商嚴(yán)格控制藥材的初加工過程。聚類分析和主成分分析將23批竹茹藥材分為2類，其中，江西產(chǎn)地的竹茹藥材被分為一類，其他產(chǎn)地的竹茹藥材被分為另一類，推測江西省的竹茹藥材在主成分種類及含量上可能與其他產(chǎn)地的竹茹藥材具有一定差異，而其他省份竹茹藥材的化學(xué)成分較為相似，但目前尚無法明確識別各產(chǎn)地藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，后期將在此基礎(chǔ)上進一步完善竹茹藥材的質(zhì)量評價研究。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜多樣，有效成分難以一一明確，如何在化學(xué)成分不完全明確的前提下對藥材進行質(zhì)量控制十分有必要。指紋圖譜結(jié)合聚類、主成分分析等化學(xué)計量學(xué)手段可以用于綜合評價中藥飲片的質(zhì)量優(yōu)劣，避免了以單一成分含量來評價飲片質(zhì)量好壞的弊端[8]。本研究在HPLC條件下建立了竹茹藥材的指紋圖譜，在后續(xù)研究中，考慮可采用質(zhì)譜結(jié)合核磁共振技術(shù)，進行多手段、多儀器分析，以期明確竹茹中的指標(biāo)性成分并對竹茹藥材質(zhì)量控制進行全面評價研究。

基于《中國藥典》2020年版未涉及竹茹藥材的HPLC質(zhì)量控制相關(guān)內(nèi)容，本實驗建立了具有較好重復(fù)性和專屬性的HPLC指紋圖譜，并結(jié)合聚類、主成分因子分析等化學(xué)計量學(xué)方法，對不同產(chǎn)地竹茹藥材的質(zhì)量進行多方面的綜合評價，為從多角度多方位分析竹茹藥材的質(zhì)量控制提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality analysis offrom different origins by HPLC coupled with chemometrics

ZHOU Bing-qian1, 2, GAO Xi-mei1, 2, YANG Ying1, 2,WANG Ling-chong1, 2, ZHANG Wen1, 2, ZHAO Xiao-li1, 2,DI Liu-qing1, 2

1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2.Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of Traditional ChineseMedicine, Nanjing 210023, China

To establish the fingerprints offrom different habitats by HPLC, and comprehensively analyze the quality ofby the similarity evaluation in combination with principal component, clustering, principal component analysis (PCA) and other chemo-metrics, so as to provide theoretical basis for its quality evaluation.The fingerprints of 23 batches ofwere established by HPLC gradient elution, and the similarity evaluation of the HPLC fingerprints ofmedicinal materials was carried out using the traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation system (2012A version), and SPSS24.0 software was used for clustering and PCA analysis.Thirteen chromatographic peaks were selected as the common peaks, and the similarity of the 23 batches was 0.713—0.991. Principal components and PCA analysis screened out three principal components with cumulative variance contribution rate of 77.83%, reflecting the quality characteristic differences of 23 batches ofmedicinal materials.HPLC fingerprint established in this experiment combined with the chemometric evaluation method is simple, feasible and reproducible, and can be used to comprehensively evaluate the quality offrom different producing areas.

;fingerprint;cluster analysis; chemometrics; quality evaluation; uridine; adenosine; guanosine;-hydroxybenzoic acid;-coumaric acid

R286.2

A

0253 - 2670(2022)03 - 0853 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.026

2021-08-06

江蘇省研究生科研與實踐創(chuàng)新計劃項目（SJCX20_0560，SJCX20_0563）

周冰倩（1996—），女，江蘇淮安，碩士研究生，研究方向為中藥學(xué)。E-mail: 1776093511@qq.com

狄留慶（1964—），男，教授，研究方向為中藥制劑研究與新產(chǎn)品研發(fā)。E-mail: diliuqing928@163.com

[責(zé)任編輯 時圣明]