花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭的SSR標(biāo)記技術(shù)鑒別

王海閣，許 文，張 勛，許少華，徐 偉，林 羽，陳抒云，黃澤豪

花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭的SSR標(biāo)記技術(shù)鑒別

王海閣，許 文，張 勛，許少華，徐 偉，林 羽，陳抒云，黃澤豪*

福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)建立金線蓮基原植物花葉開(kāi)唇蘭及其常見(jiàn)混淆品臺(tái)灣銀線蘭的鑒別依據(jù)。根據(jù)花葉開(kāi)唇蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析篩選SSR引物，通過(guò)DNA提取、PCR擴(kuò)增以及引物多態(tài)性篩選等方法鑒別花葉開(kāi)唇蘭及臺(tái)灣銀線蘭，從而鑒定藥用金線蓮真?zhèn)?。基于花葉開(kāi)唇蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出SSR多態(tài)性引物13對(duì)，UPGMA聚類(lèi)法顯示兩者遺傳相似系數(shù)變幅為0.38～1.00，在遺傳相似系數(shù)0.38處，可將其完全分開(kāi)。該研究構(gòu)建了花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭的分子標(biāo)記鑒定體系和指紋圖譜，為金線蓮的商品鑒別及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

花葉開(kāi)唇蘭；臺(tái)灣銀線蘭；SSR分子標(biāo)記；真?zhèn)舞b別；指紋圖譜

金線蓮是來(lái)源于蘭科（Orchidaceae）金線蘭屬Blume多年生草本植物花葉開(kāi)唇蘭(Wall.) Lindl.的新鮮或干燥藥材[1]，別名有金線蘭、金絲草、金絲線、虎頭蕉、金蠶等[2-3]。金線蓮性平、味甘，具有清熱涼血、解毒消腫、祛風(fēng)利濕等多種功效，藥用歷史悠久，有“藥王”“金草”“藥虎”之稱(chēng)[4]，在民間有很高的認(rèn)知度，多用于治療腎炎、膀胱炎、肺炎、高血壓、小兒急驚風(fēng)、風(fēng)濕病、糖尿病、高脂血癥、乙型肝炎等疾病[5-7]。由于它自身繁殖能力很低，生長(zhǎng)緩慢，且隨著部分地區(qū)生態(tài)環(huán)境的破壞以及過(guò)度采挖，導(dǎo)致金線蓮野生資源日漸枯竭，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》第二批討論稿將其列入國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物名列。根據(jù)本課題組前期考證結(jié)果，臺(tái)灣地區(qū)習(xí)以金線蘭屬植物臺(tái)灣銀線蘭Hayata作為金線蓮的原植物[8]，由于二近緣種外觀相似[9]，干品藥材顏色特征弱化，加之常有不法商販將其與花葉開(kāi)唇蘭混用，導(dǎo)致人們往往難以區(qū)分兩者真?zhèn)?。另外，目前關(guān)于花葉開(kāi)唇蘭和臺(tái)灣銀線蘭的鑒別主要是性狀、顯微方面的鑒別[10-12]，隨著分子標(biāo)記技術(shù)在植物鑒別方面的日益盛行以及簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、遺傳上呈現(xiàn)共顯性、穩(wěn)定性高等[13]的優(yōu)點(diǎn)，該研究將首次應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)來(lái)研究該兩種植物基因水平的差異，以便為快速準(zhǔn)確鑒別花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭提供鑒別依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

供試樣品為2019年5月29日從福建省永泰縣綠茵農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司采集的林下栽培花葉開(kāi)唇蘭和臺(tái)灣銀線蘭，并由福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室黃澤豪教授鑒定為花葉開(kāi)唇蘭(Wall.) Lindl.和臺(tái)灣銀線蘭Hayata。選取種植至5月份的長(zhǎng)勢(shì)良好、新鮮、無(wú)病蟲(chóng)害的金線蓮，取3個(gè)不同種植間隔距離的藥材進(jìn)行取樣，并及時(shí)選取新鮮幼嫩葉片分別進(jìn)行相應(yīng)平行3組的DNA提取，經(jīng)PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，平行3組實(shí)驗(yàn)條帶一致，說(shuō)明DNA提取的重復(fù)性良好，且由于不同生長(zhǎng)期的植株其基因組成是不變的，因此2種藥材各自選取其中1份樣品進(jìn)行后續(xù)的分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 儀器

DP22X奧林巴斯顯微鏡（上海富萊光學(xué)科技有限公司），佳能相機(jī)（佳能有限公司），F(xiàn)astPrep-24 5G型勻漿儀（上海博誼生物科技有限公司），自動(dòng)高壓滅菌器（廣州市華粵行儀器有限公司），Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司），ABI Veriti梯度PCR儀（哈爾濱德遠(yuǎn)科技開(kāi)發(fā)有限公司），AR224CN型分析天平（奧豪斯儀器有限公司），PowerPac Basic伯樂(lè)電泳儀、垂直電泳槽、化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）等。

1.3 試劑

新型植物基因組DNA提取試劑盒、Gold View I型核酸染色劑（康為世紀(jì)生物科技），SSR引物（由上海生工生物工程股份有限公司合成），瓊脂糖（賽默飛世爾科技有限公司），6×Loading buffer、DNA marker（寶生物工程有限公司）等，試劑均為分析純。

2 方法

2.1 DNA提取

取花葉開(kāi)唇蘭和臺(tái)灣銀線蘭完整植株的無(wú)病蟲(chóng)害的完整葉片，按照DNA提取試劑盒法提取樣品DNA，用紫外檢測(cè)儀檢測(cè)DNA濃度，260/280應(yīng)介于1.8～2.0，用2.0%濃度瓊脂糖檢測(cè)目的基因的純度，條帶應(yīng)單一明亮說(shuō)明產(chǎn)物較純。

2.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)本課題組花葉開(kāi)唇蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[14]，按照引物設(shè)計(jì)原則篩選SSR引物，即（1）引物序列的GC含量在40%～60%；（2）3’端無(wú)相似性較高的序列，且無(wú)連續(xù)3個(gè)GGG或CCC的出現(xiàn)，防止引起錯(cuò)配；（3）引物長(zhǎng)度一般為18～22 bp；（4）避免在3’端使用堿基A，防止形成二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)；（5）引物本身的互補(bǔ)性不超過(guò)8，且引物3’端的互補(bǔ)性不宜超過(guò)6，防止在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。SSR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2.5 μL 10×Taq reaction buffer，2 μL dNTP Mixture，滅菌水16.3 μL，酶0.2 μL，正、反向引物各1 μL，DNA模板 2 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，各引物退火溫度退火45 s，72 ℃延伸90 s，4 ℃保存，用1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增出目的基因以及目的基因的純度。

2.3 聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)引物多態(tài)性

2.3.1 制膠 用75%乙醇清洗玻璃板，晾干或用醫(yī)用紗布?jí)K擦干，將前后玻璃板對(duì)齊合板，置于裝有膠條的制膠架上，將滅菌水灌滿玻璃槽，檢漏20 min。然后按照灌膠配方制備配膠溶液，即依次加入超純滅菌水15 mL，30% Acr-Bis（29∶1）11.25 mL，5×TBE 7.5 mL，10% AP（催化劑）375 μL以及TEMED（加速劑）30 μL，用渦旋振蕩器迅速混勻，立即灌膠，及時(shí)插入梳子的平端，避免產(chǎn)生氣泡，室溫放置2 h使膠凝固。

2.3.2 電泳 將2板固定在垂直電泳槽中，短板朝內(nèi)，預(yù)電泳30 min，緩慢拔出梳子，將25 μL PCR體系和4 μL 6×Loading buffer混合液加入凝膠的梳子孔中，上樣量4 μL，點(diǎn)樣結(jié)束后，以135 V、400 mA的程序電泳100 min。

2.3.3 銀染 將膠板從垂直電泳槽中取出，用起膠器將短玻璃板分離，膠留在長(zhǎng)玻璃板上，用固定液沖洗凝膠使其與長(zhǎng)玻璃板分離，置入固定液固定10 min，倒出固定液，用超純水快速漂洗1遍，加入染色液，振搖10 min，快速漂洗2遍，再加入顯色液，振搖至條帶凝膠上的條帶全部顯現(xiàn)出來(lái)，快速用超純水漂洗2遍，防止顯色過(guò)度，隨后對(duì)顯色后的凝膠掃描拍照，保存。

2.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)銀染后的凝膠圖進(jìn)行條帶統(tǒng)計(jì)，同一位點(diǎn)清晰明亮的條帶記為“1”，無(wú)條帶的記為“0”，建立原始矩陣[15-16]，用NTsys 2.10軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，以及非加權(quán)平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）生成品種間親緣關(guān)系的聚類(lèi)圖，并結(jié)合Popgene 1.32軟件對(duì)引物的多態(tài)性以及個(gè)體間的遺傳分化進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 SSR標(biāo)記引物多態(tài)性

基于課題組前期花葉開(kāi)唇蘭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)30對(duì)SSR引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選多態(tài)性引物（圖1），其中條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物13對(duì)，占所用引物的43.3%。Popgene 1.32軟件分析表明（表1），平均觀察等位基因數(shù)為1.796 2，平均有效等位基因數(shù)為1.492 3，Shannon’s 多態(tài)性信息指數(shù)為0.442 6，表明花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭之間存在豐富的遺傳多樣性。引物信息如表2所示。

1～2-花葉開(kāi)唇蘭 3～4-臺(tái)灣銀線蘭 kb-空白對(duì)照 M-Marker

1—2-3—4-kb-blank control M-Marker

圖1 引物RN42對(duì)花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭的SSR-PCR凝膠電泳圖

Fig. 1 Results of SSR-PCR polyacrylamide gel electrophoresis by RN42 primers

表1 13對(duì)SSR引物的多態(tài)性

Table 1 Polymorphism of 13 pairs of SSR primers

編號(hào)等位基因有效等位基因Shannon信息指數(shù)基因流 RN322.000 01.600 00.562 30.500 0 RN332.000 01.600 00.562 30.500 0 RN352.000 01.600 00.562 30.500 0 RN362.000 01.600 00.562 30.500 0 RN372.000 01.600 00.562 30.500 0 RN382.000 01.600 00.562 30.500 0 RN411.000 01.000 00.000 0— RN422.000 01.600 00.562 30.500 0 RN431.000 01.000 00.000 00.000 0 RN442.000 02.000 00.693 10.100 0 RN462.000 01.600 00.562 30.500 0 RN502.000 01.600 00.562 30.500 0 AR79621.000 01.000 00.000 00.000 0 平均值1.769 21.492 30.442 60.403 6 標(biāo)準(zhǔn)方差0.438 50.301 30.254 9—

3.2 聚類(lèi)分析

運(yùn)用數(shù)據(jù)分析軟件NTsys軟件的UPGMA法對(duì)13對(duì)引物擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭的聚類(lèi)分析（圖2），由圖2可知遺傳相似系數(shù)變幅為0.38～1.00，在遺傳相似系數(shù)0.38處，可將花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭分開(kāi)。Popgene 1.32軟件分析結(jié)果表明，花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭之間存在著一定的遺傳距離，距離值為0.450 2，且遺傳相似系數(shù)不高，為0.637 5，結(jié)合表1中的基因流＜1，可以看出表明兩者之間存在較高的遺傳分化。

3.3 SSR指紋圖譜構(gòu)建

通過(guò)對(duì)13對(duì)SSR引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，最終篩選出6對(duì)具有顯著多態(tài)性的SSR引物（RN33、RN35、RN37、RN42、RN44、RN46），在相同的遷移位置上，以“１/0”標(biāo)記擴(kuò)增條帶的有無(wú)，構(gòu)建花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭的DNA分子指紋圖譜（表3）。在實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行區(qū)分時(shí)，可與構(gòu)建的指紋編碼進(jìn)行對(duì)比進(jìn)行品種間的區(qū)分。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)篩選出13對(duì)SSR多態(tài)性引物可用于對(duì)花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭的鑒別，NTsys軟件分析結(jié)果表明花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭之間存在一定的遺傳距離，且在遺傳相似系數(shù)0.38處可將兩者區(qū)分開(kāi)；Popgene軟件分析結(jié)果表明所用SSR引物多態(tài)性高，花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭之間存在較高的遺傳分化，因此，根據(jù)SSR分子標(biāo)記的結(jié)果建立花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭的遺傳聚類(lèi)圖譜和指紋圖譜，可為市場(chǎng)上藥用金線蓮商品的鑒別以及質(zhì)量控制能起到有益的幫助。

表2 13對(duì)多態(tài)性SSR引物序列

Table 2 Thirteen pairs of SSR primer sequences

引物名稱(chēng)正向序列（5’-3’）反向序列（5’-3’） RN32TGAACCCGATTTGCCTTTACTGTGACTATTGCGTTTTGTGC RN33CCGCTACGTCGGAACTTTACACCCAGCCATTGTCATCTTC RN35AGGAGGCCACACAATTCAACATTGGACCACCTGACACCAT RN36CCAAGAACTCCCTGTGCAATACGCCCTTCTTCTTCCTAGC RN37CCTCTGGCTCCATCTTCAACAGCTCATCCTTGTTCCCCTT RN38GGAGAGTCCAACACCGACATGCATGGAAAAGCTAGCACCT RN41GAGGTTCTGGAGCAGTGGAGTCGAGTGATTGGTGTGTGGT RN42ACAAGAAGGTGGAGGTGGTGCACCCTACTGCGTCCATTCT RN43CCCAACCTGTTTGACTCGTTGGGCAGGGATTTCTAGGTTC RN44GCTCACTGCGAAAAGGAACTGCGCCCCATCTCATAACTT RN46GCTTGAGGATGACGAAGAGGAGTCGGAGAAGGGGAGAGAG RN50GCTTTACCACCAGCTCAAGGTCGCCATGAATTCCTAGTCC AR7962TGGGCCGGTTAAGTTGTTAGGACCTGTGGTTCATGGGACT

圖2 花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭的UPGMA聚類(lèi)圖

SSR是基于生物基因組普遍存在且隨機(jī)分布的一種特殊序列，由于具有重復(fù)性及可靠性高等優(yōu)勢(shì)[17]，已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析[18]、指紋圖譜的構(gòu)建[19]、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[20]、分子標(biāo)記輔助育種[21]等。近年來(lái)，DNA分子標(biāo)記也開(kāi)始在金線蓮的鑒別中得到應(yīng)用，如Cheng等[22]首次用RAPD標(biāo)記對(duì)臺(tái)灣金線蓮和恒春銀線蘭進(jìn)行鑒別，黃穎楨等[23]首次應(yīng)用ISSR標(biāo)記對(duì)金線蓮的遺傳多樣性進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)基于花葉開(kāi)唇蘭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，選用合適的引物，首次應(yīng)用SSR技術(shù)對(duì)花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭進(jìn)行生藥鑒別研究，分子生藥學(xué)鑒定研究表明，花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭存在一定的遺傳分化。因此，該研究建立的分子標(biāo)記技術(shù)鑒定金線蓮真?zhèn)蔚姆椒梢暂^好地區(qū)分市售花葉開(kāi)唇蘭與臺(tái)灣銀線蘭，此方法的應(yīng)用也可以為藥用金線蓮真?zhèn)蔚蔫b別提供一個(gè)便捷的實(shí)驗(yàn)途徑。

表3 6對(duì)特異性SSR引物多態(tài)性情況及構(gòu)建的指紋圖譜

Table 3 Fringerprints constructed by six pairs of polymorphic SSR primers

樣本引物指紋編碼 RN33RN35RN37RN42RN44RN46 花葉開(kāi)唇蘭10111111111111011011111111111101 臺(tái)灣銀線蘭11011010010001111101101001000111

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification ofandby SSR molecular markers

WANG Hai-ge, XU Wen, ZHANG Xun, XU Shao-hua, XU Wei, LIN Yu, CHEN Shu-yun, HUANG Ze-hao

College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China

The purpose of this paper was to research the identification characteristics ofand its adulterants ofbased on SSR molecular markers.Firstly, SSR primers were selected according to the transcriptome data of, and then the original plant ofand its adulterants ofwas identified by DNA extraction, PCR amplification and primer polymorphism screening, so as to identify the authenticity ofherba.By SSR molecular markers, 13 pairs of SSR primers clustering analysis showed that the genetic similarity coefficient ranged from 0.38 to 1.00 so thatandcould be separated at 0.38.In this study, the molecular marker identification system and fingerprints ofandare established, which could provide scientific basis for commodity identification and quality control ofherba.

(Wall.) Lindl.;Hayata; SSR molecular markers; identification; fingerprints

R286.12

A

0253 - 2670(2022)03 - 0848 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.025

2021-09-06

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2017J01538）；福建省科技廳高校產(chǎn)學(xué)合作項(xiàng)目（2019Y41010064）；福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目（2017Y0049，2018Y0052）

王海閣（1994—），女，河南駐馬店人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及品質(zhì)評(píng)價(jià)。Tel: 18750718127 E-mail: 2672831172@qq.com

黃澤豪，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及品質(zhì)評(píng)價(jià)。Tel: 18046043849 E-mail: huangzehao@fudan.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]