基于JAK2/STAT3信號通路觀察右美托咪定減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷和抑制凋亡作用機制

吳亞輝，王韜甫，林洪啟*

1.河南省人民醫(yī)院麻醉科室，鄭州 450003；2.華中阜外醫(yī)院麻醉科室,鄭州 450003

當冠心病等心血管疾病發(fā)展到一定階段，藥物緩解患者癥狀后，需要進行外科手術(shù)或者介入治療，心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）不可避免。MIRI能夠?qū)е滦牡纳⑿螒B(tài)、結(jié)構(gòu)等發(fā)生改變，使患者出現(xiàn)心律失常、代謝障礙、血管內(nèi)皮功能損傷等心功能障礙[1]。研究表明心肌細胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)以致活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）富集導致的心肌細胞大量凋亡是MIRI最基本的病理改變[2]。最大限度地減輕由MIRI造成的心功能障礙，降低患者死亡率是臨床亟需解決的問題。右美托咪定是在ICU和臨床麻醉中廣泛應(yīng)用的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛藥物。現(xiàn)代藥理學研究表明，作為一種高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，右美托咪定還具有抗焦慮、抗炎、抗氧化以及良好的器官保護作用[3]。羅建民等[4]報道在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療中，右美托咪定的應(yīng)用有助于患者術(shù)后心功能的恢復(fù)，減輕患者術(shù)中的MIRI損傷，體現(xiàn)了右美托咪定對心的保護作用。但關(guān)于右美托咪定對心保護作用的機制報道較少。蛋白酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（janus kinase 2/signaltransducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路在細胞生長、增殖、凋亡、分化、應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)等生理過程中發(fā)揮重要作用，冷雪等[5]研究表明激活JAK2/STAT3通路能明顯改善急性心肌缺血大鼠的癥狀。本研究通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，從心肌損傷以及心肌細胞凋亡的角度入手，探討JAK2/STAT3通路在右美托咪定對心保護作用的可能的機制，為右美托咪定的臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～10周清潔級SD雄性大鼠40只，體重220～250 g，由我院實驗動物中心從鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司采購，動物使用許可證號：SYXK（豫）2017-0005。

1.1.2 主要試劑 鹽酸右美托咪定注射液（dexmedetomidine hydrochloride inject，2 ml：200μg，國藥準字：H20090248，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；JAK2/STAT3信號通路特異性激動劑SC-39100購自Sigma公司，HE試劑盒、DCFH-DA染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；p-JAK2，p-STAT3抗體、兔抗GAPDH購自美國abcam公司，TUNEL試劑盒、Western blot試劑盒購自德國Rebstock公司。

1.1.3 主要儀器 熒光顯微鏡（日本尼康公司），Biorad凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-rad公司），-80℃深冷冰箱（德國維根斯公司），電鏡（日本三菱公司），Leica RM2135組織切片機（德國Leica公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 心缺血再灌注損傷大鼠模型構(gòu)建 術(shù)前12 h禁食，腹腔注射3 mg/L的10%水合氯醛將大鼠麻醉，以仰臥位固定在手術(shù)臺上，備皮，消毒，連接電極（用以實時監(jiān)測大鼠的心電圖），參照文獻[6]切開頸部氣管，連接微小動物呼吸機，開胸暴露心，以5/0線將左冠狀動脈前降支結(jié)扎，收緊線結(jié)后，肉眼可見其左心室壁呈現(xiàn)青紫色或蒼白色，血壓下降，波動減緩，心電圖顯示ST段明顯抬高即為大鼠心肌缺血成功標準，結(jié)扎30 min后剪開線結(jié)以再灌注120 min，心電圖顯示ST段呈現(xiàn)回落1/2以上即為再灌注成功。造模術(shù)后關(guān)胸、縫合傷口，腹腔注射少量青霉素預(yù)防感染。

1.2.2 實驗分組 將大鼠隨機分為4組，每組10只：假手術(shù)組、模型組、實驗組和對照組。假手術(shù)組大鼠僅進行穿線不結(jié)扎。實驗組、對照組大鼠術(shù)前1 h分別腹腔注射5.0μg/kg的右美托咪定、JAK2/STAT3信號通路激動劑SC-39100[7]，假手術(shù)組、模型組大鼠注射等劑量的生理鹽水。

1.2.3 心彩超儀檢査大鼠心功能 再灌注120 min后，各組大鼠麻醉，微小動物心彩超儀檢查各組大鼠的心功能。記錄左室收縮壓（1eft ventricular systohc pressure，LVSP）、左室舒張末壓（1eft ventricular enddiastolic pressure，LVEDP）、左室壓力上升最大速率（1eft ventricular pressure rise，+dp/dtmax）及左室壓力下降最大速率（1eft ventricular pressure drop，-dp/dtmax）。

1.2.4 大鼠心肌組織病理檢查 檢查心彩超之后，將大鼠誘導麻醉，留取腹主動脈血清5 ml，處死動物。無菌剝離心，吸干水分，封存在液氮中，置于-80℃深冷冰箱中備用。取100 mg各組大鼠心肌組織，HE染色，切片，光鏡下觀察心肌組織病理改變。

1.2.5 大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察 取100 mg各組大鼠心肌組織，經(jīng)固定，脫水，包埋，以及醋酸雙氧鈾（Uranyl Acetate）及枸櫞酸鉛（lead citrate）染色后，制成50 nm切片，干燥，電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)病理改變。

1.2.6 大鼠血清生化指標檢測 將血液樣本離心，留取血清，采用酶聯(lián)免疫測定試劑盒（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸磷酸激酶（creafine phosphokinase，CK）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。

1.2.7 TUNEL染色檢測大鼠心肌細胞凋亡 取100 mg各組大鼠心肌組織，經(jīng)固定，冰凍切片，脫水，包埋后，按TUNEL試劑盒要求進行反應(yīng)，漂洗，脫水，封片，熒光顯微鏡觀察。正常心肌細胞呈現(xiàn)藍色，凋亡細胞呈現(xiàn)棕色[8]。使用Image 8.0圖像分析軟件統(tǒng)計分析獲取各組大鼠的心肌細胞凋亡率。

1.2.8 DCFH-DA檢測大鼠心肌組織ROS水平 取100 mg各組大鼠心肌組織，10%聚甲醛固定2 h，石蠟包埋并切片，10μmol/L LDCFH-DA染色2 h，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.9 Western blot檢測大鼠心肌組織p-JAK2，p-STAT3表達水平 取100 mg各組大鼠心肌組織，常規(guī)裂解、勻漿、離心后，測定蛋白濃度，電泳分離，轉(zhuǎn)模、封閉，滴加一抗（均為1：500），4℃孵育過夜，次日清洗后加入二抗（均為1：1000），顯色，凝膠成像儀下讀取各條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 16.0軟件，作圖工具采用Graphpad 5.01，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定預(yù)處理對心肌缺血再灌注大鼠心功能的影響

各組大鼠心彩超檢查如圖1示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低（P＜0.05），LVEDP明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，實驗組、對照組大鼠的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯升高（P＜0.05），LVEDP明顯降低（P＜0.05）；對照組與實驗組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 彩超儀檢查各組大鼠心功能A：假手術(shù)組B：模型組C：實驗組D：對照組 *P＜0.05，與假手術(shù)組相比#P＜0.05，與模型組相比Fig.1 Thecomparison of heart function of ratsin each groupA:Sham operation group;B:Model group;C:Experimental group;D:Control group Compared with the sham operation group,*:P＜0.05.Compared with themodel group,#:P＜0.05

2.2 右美托咪定預(yù)處理對心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷的影響

HE染色結(jié)果如圖2所示，假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列整齊，胞核結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)內(nèi)容物豐富，細胞間質(zhì)無水腫、壞死現(xiàn)象，心肌纖維排列規(guī)則；模型組大鼠的心肌細胞結(jié)構(gòu)以及形態(tài)出現(xiàn)明顯損傷，細胞腫脹，排列紊亂，核膜破損嚴重，胞核固縮明顯，胞膜或缺損或溶解，細胞間質(zhì)增大，炎性細胞大量浸潤，壞死的細胞增多，心肌纖維排列失去規(guī)則，呈現(xiàn)明顯的帶狀梗死灶；實驗組大鼠的心肌細胞結(jié)構(gòu)較為正常，間質(zhì)稍見腫脹，炎性浸潤較模型組明顯減少，胞膜較為清晰，壞死的細胞數(shù)量較少；對照組大鼠的心肌細胞排列較為規(guī)則，心肌纖維形態(tài)較為規(guī)整，細胞間質(zhì)稍微腫脹，細胞界限較為清晰。

圖2 各組大鼠心肌損傷病理 A：假手術(shù)組B：模型組C：實驗組D：對照組Fig.2 Thepathology of myocardial injury in ratsin each group A:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group

2.3 右美托咪定預(yù)處理對心肌缺血再灌注大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡下觀察各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變?nèi)鐖D3所示：假手術(shù)組大鼠心肌橫紋清晰，心肌纖維排列規(guī)則，胞核性狀正常，線粒體嵴結(jié)構(gòu)、形態(tài)和數(shù)量正常；模型組大鼠心肌纖維出現(xiàn)大面積溶解現(xiàn)象，胞核明顯擴大，核膜破裂，染色質(zhì)固縮明顯，線粒體數(shù)量減少，腫脹明顯，呈現(xiàn)空泡樣變性，嵴結(jié)構(gòu)變短、變疏、斷裂或缺失，膠原纖維松散排列；實驗組大鼠心肌細胞損傷明顯緩解，細胞排列趨于規(guī)則，線粒體損傷明顯減輕，部分嵴結(jié)構(gòu)清晰可辨；對照組大鼠心肌纖維排列趨于規(guī)整，細胞稍見腫脹，少部分線粒體存在空泡樣變性，壞死病灶明顯減小。

圖3 各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變 A：假手術(shù)組B：模型組C：實驗組D：對照組Fig.3 The ultrastructural changes of myocardial tissue in each group of rats A:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group

2.4 右美托咪定預(yù)處理對心肌缺血再灌注大鼠血清生化指標的影響

ELISA結(jié)果如圖4所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中LDH、CK活性明顯增強（P＜0.05），MDA含量明顯升高（P＜0.05），SOD活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，實驗組、對照組大鼠大鼠血清中LDH、CK活性明顯降低（P＜0.05），MDA含量明顯下降（P＜0.05），SOD活性明顯增強（P＜0.05）；對照組與實驗組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠血清指標比較A：假手術(shù)組B：模型組C：實驗組D：對照組 *P＜0.05，與假手術(shù)組相比#P＜0.05，與模型組相比Fig.4 Thecomparison of serum indexesof ratsin each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

2.5 右美托咪定預(yù)處理對心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果如圖5所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，實驗組、對照組大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；對照組與實驗組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖5 各組大鼠心肌細胞凋亡比較A：假手術(shù)組B：模型組C：實驗組D：對照組 *P＜0.05，與假手術(shù)組相比#P＜0.05，與模型組相比Fig.5 Thecomparison of rat cardiomyocyteapoptosisin each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

2.6 右美托咪定預(yù)處理對心肌缺血再灌注大鼠心肌組織氧化應(yīng)激的影響

大鼠心肌細胞的氧化應(yīng)激以DCFH-DA染色法檢測ROS含量來評價。結(jié)果如圖6所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細胞的熒光強度明顯增強，ROS含量明顯增多（P＜0.05）；與模型組相比，實驗組、對照組大鼠心肌細胞的熒光強度明顯減弱，ROS含量明顯降低（P＜0.05）；對照組與實驗組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖6 各組大鼠心肌組織中的氧化應(yīng)激的比較A：假手術(shù)組B：模型組C：實驗組D：對照組 *P＜0.05，與假手術(shù)組相比#P＜0.05，與模型組相比Fig.6 The comparison of oxidative stress in myocardial tissue of rats in each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

2.7 右美托咪定預(yù)處理對心肌缺血再灌注大鼠JAK2/STAT3信號通路的影響

Western blot結(jié)果如圖7所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細胞的p-JAK2，p-STAT3蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，實驗組、對照組大鼠心肌細胞的p-JAK2，p-STAT3表達明顯升高（P＜0.05）；對照組與實驗組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖7 各組大鼠心組織p-JAK2，p-STAT3蛋白的表達A：假手術(shù)組B：模型組C：實驗組D：對照組 *P＜0.05，與假手術(shù)組相比#P＜0.05，與模型組相比Fig.7 Theexpression of p-JAK2 and p-STAT3 protein in heart tissueof ratsin each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

3 討論

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是患者在血運重建中，心短期會出現(xiàn)缺血、缺氧，而恢復(fù)灌注后，心肌損傷并未緩解，反而加重的一種病理狀態(tài)。心肌缺血再灌注損傷導致心超微結(jié)構(gòu)改變、心功能障礙，再灌注時集聚的ROS會誘發(fā)心肌細胞無端壞死，心肌收縮功能減退，尤其圍手術(shù)期的心肌缺血再灌注損傷可導致患者出現(xiàn)嚴重的心律失常甚至猝死[9]。因此尋找有效的手段或藥物抑制心肌細胞凋亡，降低心肌缺血再灌注損傷，是心肌缺血治療中亟需解決的重大課題。

研究表明缺血預(yù)處理能明顯緩解心肌缺血再灌注損傷，但是不同患者對不同藥物的吸收、耐受等原因限制了該治療手段在臨床的推廣應(yīng)用。眾多臨床醫(yī)師一直在尋找、研究、篩選合適的藥物。右美托咪定在1999年已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于重癥監(jiān)護病房患者的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛。近年來，右美托咪定因在圍手術(shù)期對器官的保護顯示了獨特的優(yōu)勢，引起廣泛關(guān)注[10]。研究表明右美托咪定能明顯減輕重要臟器諸如腎、肝、腸道、肺、腦等的缺血再灌注損傷[11]。楊玲等[12]臨床研究表明右美托咪定預(yù)處理能明顯抑制心肌凋亡，在冠狀動脈旁路移植術(shù)中減輕患者的心肌損傷。劉艷秋等[13]臨床觀察報道右美托咪定預(yù)處理在全麻手術(shù)中更能改善患者術(shù)后心的結(jié)構(gòu)損傷，顯示了良好的心保護作用。但是關(guān)于右美托咪定在心肌缺血再灌注應(yīng)用的報道較少。本研究建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，心彩超顯示模型組大鼠的心功能明顯降低，HE以及電鏡結(jié)果顯示模型組大鼠心呈現(xiàn)明顯的心肌缺血再灌注損傷。而經(jīng)右美托咪定預(yù)處理的實驗組心功能明顯改善，病理損傷明顯緩解。LDH、CK的活性與心肌細胞膜的通透性關(guān)系密切，是衡量心結(jié)構(gòu)損傷的重要因素；患者血清中LDH、CK活性是臨床診斷心絞痛、心梗等心肌損傷的金標準，是評價心血管患者遠期預(yù)后的重要指標[14]。本研究中實驗組LDH、CK活性明顯降低，說明右美托咪定預(yù)處理能明顯改善心肌缺血再灌注大鼠的心肌損傷。

研究表明ROS異常集聚導致心肌細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷心結(jié)構(gòu)改變的關(guān)鍵因素[15]。Zhao等[16]研究證實下調(diào)氧化應(yīng)激的水平，減少ROS在細胞的積累，能明顯改善心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌凋亡。Guo等[17]報道缺血預(yù)處理能降低心肌細胞的異常凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷大鼠的臟器損傷。本研究結(jié)果顯示經(jīng)右美托咪定預(yù)處理，實驗組大鼠血清中氧化應(yīng)激底物MDA的含量明顯降低，參與抗氧化還原的SOD的酶活性明顯降低，ROS含量、心肌細胞凋亡率明顯降低，說明右美托咪定預(yù)處理可抑制心肌細胞的氧化應(yīng)激，阻滯心肌細胞的凋亡，這與既往的研究結(jié)果一致。

JAK2/STAT3信號是機體內(nèi)涉及炎性、免疫、細胞凋亡、氧化應(yīng)激等多種病理過程的重要轉(zhuǎn)導通路。研究表明細胞在激活JAK2／STAT3信號后，首先活化JAK2，進一步將STAT3磷酸化，將胞外信號轉(zhuǎn)至胞核，調(diào)控靶基因的表達，發(fā)揮生物學效應(yīng)[18]。Xie等[19]研究證實在心肌缺血再灌注大鼠中，激活JAK2/STAT3信號能明顯增強抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，降低細胞凋亡。Shang等[20]研究表明在缺氧-復(fù)氧損傷的心肌細胞中，JAK2/STAT3信號的激活能明顯抑制細胞的氧化應(yīng)激，降低ROS積累。本研究將JAK2/STAT3信號激活劑用于對照組動物中激活JAK2/STAT3信號，促進JAK2和STAT3的磷酸化，以發(fā)揮對心的保護作用，結(jié)果顯示對照組大鼠的病理指征、血清指標，以及其他指標與實驗組的差異不明顯。說明右美托咪定預(yù)處理對心的保護作用可能與JAK2/STAT3信號的激活有關(guān)。

綜上所述，右美托咪定預(yù)處理能明顯降低大鼠心肌缺血再灌注損傷，降低心肌細胞凋亡，可能與激活JAK2/STAT3信號，抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。但是對臨床上缺血再灌注損傷患者的應(yīng)用還需要更深入的研究。