肝肺綜合征大鼠模型肺組織巨噬細(xì)胞表型變化

李旭炯，張慧英 *，陳云霞，田小霞，來麗娜

長治醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室，2.病理生理學(xué)教研室，3.微生物學(xué)教研室，4.藥理學(xué)教研室，山西 長治 046000

巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞成分，具有較強(qiáng)的異質(zhì)性，在體內(nèi)外不同的微環(huán)境影響下，可呈現(xiàn)出不同的功能表型，分泌不同的活性分子[1]。目前研究表明，在肝疾病特別是肝硬化發(fā)生時(shí)，腸道菌群紊亂，腸粘膜屏障及Kupffer細(xì)胞功能障礙，門體分流等因素致使大量細(xì)菌和內(nèi)毒素從腸道吸收入血，這種情況下，由于肺對(duì)內(nèi)毒素的敏感性及解剖特點(diǎn)，巨噬細(xì)胞聚集于肺組織并被激活，分泌大量的iNOS、NO、CO及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等細(xì)胞因子，對(duì)肺組織造成損傷的同時(shí)，促進(jìn)肺血管擴(kuò)張及新生血管，進(jìn)而導(dǎo)致肝肺綜合征（hepatopulmonary syndrome，HPS）。因此研究HPS發(fā)病過程中肺組織巨噬細(xì)胞表型特點(diǎn)及變化，對(duì)HPS的防治具有重要的意義。采用復(fù)合因素法復(fù)制HPS大鼠模型其病理階段性變化分明，是理想的動(dòng)物模型[2]。本研究采用該方法對(duì)SD大鼠進(jìn)行處理，通過測定其肺組織中巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志分子及分泌產(chǎn)物，歸納其巨噬細(xì)胞表型變化特點(diǎn)，為臨床該疾病的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠36只，體重（225±25）g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 四氯化碳（CCl4）分析純購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；膽固醇購于天津市化學(xué)試劑公司；TNF-α、IL-10、iNOS和Arg-1 ELISA試劑盒購于上?？畦b生物科技有限公司；CD68小鼠單克隆抗體（ab955）購 自Abcam 公 司；總RNA提 取 試 劑RNAiso Plus，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Master Mix，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）試劑、SYBR?Premix Ex Taq?II等購自TaKaRa公司；CD86及CD206和18SRNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組 隨機(jī)均分18只SD大鼠進(jìn)入HPS模型4周組、6周組及8周組，采用復(fù)合致病因素法[2]進(jìn)行造模，另18只動(dòng)物分別被設(shè)立為同期正常對(duì)照組（Control組，n=6），給予標(biāo)準(zhǔn)飼料。上述各組動(dòng)物分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)禁食過夜后，經(jīng)腹腔麻醉，于無菌、無內(nèi)毒素的條件下經(jīng)腹主動(dòng)脈采血用于相關(guān)生化指標(biāo)檢測，同時(shí)摘取肺組織液氮凍存。

1.2.2 HE染色 石蠟包埋肝組織及肺組織，分別制備4μm切片，行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肝及肺組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3 免疫熒光法檢測肺組織巨噬細(xì)胞 肺組織切片常規(guī)脫蠟至水，并行抗原修復(fù)。PBS沖洗，BSA封閉30 min，分別滴加一抗CD68（1：400），4℃過夜后加入相應(yīng)的熒光二抗、室溫下孵育1 h、含DAPI封片劑封片、鏡檢。

1.2.4 RT-qPCR檢測巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86及CD206 mRNA表達(dá) 提取肝組織總RNA，合成cDNA（反轉(zhuǎn)錄條件為37℃15 min，85℃5 s）。以cDNA為模板，Primer Express 2.0和Beacon Designer軟件設(shè)計(jì)引物（序列見表1）。SYBR?Green I熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)目的基因進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件：CD86 58℃20 s、CD206 59℃20 s，18SRNA 61℃20 s，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)。以18SRNA為參照物計(jì)算，結(jié)果采用2-△△Ct表示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences for quantitative RT-PCR

1.2.5 肺組織勻漿中指標(biāo)檢測 按照說明制備肺組織勻漿，采用Elisa法對(duì)肺組織中TNF-α、IL-10、iNOS及Arg-1進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

各數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多樣本均數(shù)之間進(jìn)行F檢驗(yàn)比較，各變量間相互關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝和肺組織病理變化

HE及VG染色顯示模型組大鼠肝脂肪變性，隨病程進(jìn)展纖維增生逐漸加重，至第8周可見明顯的假小葉形成（圖1A、B）。肺組織HE染色顯示，模型組從第4周起即可見肺泡間隔增厚、炎性細(xì)胞浸潤，第6周可見明顯的肺泡間隔增厚，腔內(nèi)和間隔內(nèi)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞積聚，第8周肺泡間隔進(jìn)一步增厚，部分肺泡腔變小，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞大量聚集（圖2A）。巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86免疫熒光結(jié)果顯示：在模型組動(dòng)物肺組織中，隨著病程進(jìn)展，可見其大量浸潤（圖2B）。

圖1 肝組織病理變化 A：肝組織切片HE染色B：肝組織切片VG染色Fig.1 Pathological changes of liver tissues A:Liver tissuesof HEstaining;B:Liver tissuesof VGstaining

圖2 肺組織病理變化 A：肺組織切片HE染色B：免疫熒光檢測肺組織中CD68變化（紅色）Fig.2 Pathological changes of lung tissues A:Lung tissues of HE staining;B:Pulmonary tissues of immunofluorescence staining for CD68(red)

2.2 肺組織中CD86及CD206 mRNA表達(dá)

模型組動(dòng)物肺組織中CD86 mRNA表達(dá)隨病程進(jìn)展逐漸升高（P＜0.05），至第6周達(dá)高鋒，第8周出現(xiàn)明顯回落，但仍明顯高于同期正常對(duì)照組；CD206 mRNA第4周其表達(dá)未見明顯變化，在第6周和8周其表達(dá)明顯高于同期正常對(duì)照組（P＜0.05），見圖3。

圖3 肺組織中CD86和CD206 mRNA表達(dá)水平*P＜0.05，與正常對(duì)照組比較△P＜0.05，與HPS模型4周組比較#P＜0.05，與HPS模型6周組比較Fig.3 ThemRNA expression levelsof CD86 and CD206 in thelung tissues*P＜0.05 vs normal control group;△P＜0.05 vs 4th week HPSgroup;#P＜0.05 vs 6th week HPSgroup

2.3 肺組織中TNF-α、IL-10、iNOS及Arg-1含量

HPS大鼠肺組織中iNOS和TNF-α水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于同期正常對(duì)照組（P＜0.05），其中以第6周最高，4周組次之；Arg-1和IL-10的水平在第4周未見明顯變化，在第6和第8周可見明顯升高（P＜0.05），見表2。

表2 肺組織中iNOS、Arg-1、IL-10及TNF-α水平（,n=6）Tab.2 Contents of iNOS，Arg-1，IL-10 and TNF-αin the lung tissues（Mean±SD,n=6）

表2 肺組織中iNOS、Arg-1、IL-10及TNF-α水平（,n=6）Tab.2 Contents of iNOS，Arg-1，IL-10 and TNF-αin the lung tissues（Mean±SD,n=6）

注：*P＜0.05，與正常對(duì)照組比較△P＜0.05，與HPS模型4周組比較#P＜0.05，與HPS模型6周組比較Note:*P＜0.05 vsnormal control;△P＜0.05 vs4th week HPSgroup;#P＜0.05 vs6th week HPSgroup

2.4 相關(guān)性分析

模型組動(dòng)物肺組織iNOS與CD86表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.903，P＜0.01）；Arg-1與CD206表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.871，P＜0.01）；IL-10與CD206基因表達(dá)（r=0.769，P＜0.05）呈顯著正相關(guān)。

3 討論

巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境可呈現(xiàn)出不同的表型。按照功能，一般把以分泌促炎因子為主，發(fā)揮促炎功能的巨噬細(xì)胞稱為M1型巨噬細(xì)胞，其常見的表面標(biāo)志分子是CD86；而以降低炎癥反應(yīng)，修復(fù)組織為

主的巨噬細(xì)胞稱為M2型巨噬細(xì)胞，其常見的表面標(biāo)志分子是CD206[3]。在M1/M2極化中出現(xiàn)的失衡可能具有有害影響，可導(dǎo)致疾病或炎癥狀態(tài)[4]。

本研究中，根據(jù)肝及肺組織形態(tài)學(xué)的改變，表明HPS大鼠模型復(fù)制成功；并且在HPS發(fā)病過程中，聚集于肺組織的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)出一定規(guī)律表型變化特點(diǎn)：在HPS發(fā)病初期（第4周），M1明顯增加，表明炎癥反應(yīng)是這一時(shí)期的主要特點(diǎn)。既往研究表明：為抵消過度的炎癥，巨噬細(xì)胞可將其表型轉(zhuǎn)化成M2型，以保護(hù)宿主免受極端傷害并觸發(fā)傷口愈合。隨著病程進(jìn)展，炎性反應(yīng)逐漸加強(qiáng)，至第6周達(dá)到高峰，M2開始明顯增加，表明在這一時(shí)期開始出現(xiàn)明顯的抗炎及組織修復(fù)反應(yīng)。之后炎癥反應(yīng)開始降低，到第8周則主要表現(xiàn)為抗炎及組織修復(fù)反應(yīng)，從第4周到第8周，M2/M1比值逐漸增加。但這一變化特點(diǎn)并不意味著病變減輕，相反不恰當(dāng)?shù)目寡准靶迯?fù)反應(yīng)常導(dǎo)致疾病加重，例如在纖維化和癌癥等慢性疾病中常?？梢杂^察到M2巨噬細(xì)胞的主導(dǎo)作用及高反應(yīng)性[1]。

氨基酸代謝與巨噬細(xì)胞功能表型密切相關(guān)。iNOS及Arg1是精氨酸代謝中兩個(gè)重要的酶。iNOS主要由M1巨噬細(xì)胞分泌。本研究發(fā)現(xiàn)iNOS與M1標(biāo)志分子CD86具有一致的表達(dá)趨勢，并在第6周達(dá)到高峰。iNOS可以通過分解L-精氨酸產(chǎn)生NO及ROS促使組織發(fā)生炎性損傷，而過量的NO是導(dǎo)致HPS患者肺血管異常擴(kuò)張的主要原因。與之相對(duì)，M2巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平的Arg1。Arg1可與iNOS競爭結(jié)合L-精氨酸，拮抗M1的炎性反應(yīng)。Arg1通過精氨酸代謝途徑產(chǎn)生大量的L-鳥氨酸和多胺，在組織修復(fù)中發(fā)揮重要的作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)肺組織Arg1從第6周開始明顯增加，這一結(jié)果與上述模型肺組織中巨噬細(xì)胞表型變化特點(diǎn)是吻合的。

巨噬細(xì)胞表型的極化依賴于其微環(huán)境中的刺激物。在LPS、TNF-α等炎性介質(zhì)的作用下巨噬細(xì)胞可極化為M1型。本研究結(jié)果顯示HPS大鼠的肺組織中TNF-α含量隨著病程進(jìn)展逐漸增加，于第6周開始明顯高于正常對(duì)照組。這與第6周M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子CD86高度表達(dá)是一致的。但第8周，TNF-α與CD86呈現(xiàn)不一致的表達(dá)，CD86較第6周明顯降低，而TNF-α變化并不明顯。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因很可能與M2巨噬細(xì)胞具有抑制M1巨噬細(xì)胞的作用及M2b亞型巨噬細(xì)胞對(duì)TNF-α的分泌有關(guān)[6,7]。對(duì)于M2巨噬細(xì)胞極化，主要由IL-4、IL-10等細(xì)胞因子所介導(dǎo)，本研究發(fā)現(xiàn)肺組織IL-10含量從第6周開始明顯增加，這與從第6周開始M2型巨噬細(xì)胞明顯增多是相一致。IL-10在推動(dòng)和增強(qiáng)M2極化的同時(shí)，M2型巨噬細(xì)胞也分泌IL-10，在幾種內(nèi)源性因子如TNF-α和它自身的刺激下，IL-10的表達(dá)明顯增加[8,9]。本研究中，第8周IL-10含量繼續(xù)增加可能與此有關(guān)，進(jìn)一步表明該時(shí)期肺組織反應(yīng)以修復(fù)為主。

綜上所述，在HPS的發(fā)病過程中，巨噬細(xì)胞經(jīng)歷了一系列的表型變化，并發(fā)揮不同作用。未來對(duì)HPS肺組織巨噬細(xì)胞極化及其在發(fā)病中所起作用及機(jī)制的深入研究，將會(huì)對(duì)臨床防治HPS產(chǎn)生積極影響。