中老年小鼠通過長期運動改善Aβ1-42誘導(dǎo)的認知功能障礙

張衛(wèi)國，楊娜，楊靜，劉雪芹，趙云鶴*

山西醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，太原 030001

當今世界阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）患者人數(shù)呈上升趨勢，其表現(xiàn)為進行性記憶功能障礙和認知能力下降，嚴重危害老年人的身體健康，成為困擾家庭和社會的重大問題[1]。預(yù)防和治療AD的藥物和方法亟待研發(fā)[2]。AD患者腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白（amyloidβpeptide，Aβ）沉積，是其眾多病理性指標中最具特征性的標志之一[3]。有效清除Aβ成為研究AD的方向之一。Lopez等[4]使用皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)研究泛素-蛋白酶體通路對Aβ降解的影響，發(fā)現(xiàn)當乳酸菌素抑制26S蛋白酶體的蛋白水解活性時，Aβ1-42的降解顯著降低，Aβ異常累積增多，提示Aβ在星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元中都可能是泛素蛋白酶體復(fù)合物的底物。Keck等[5]分析發(fā)現(xiàn)，AD患者端腦直回中的蛋白酶體活性水平較健康對照組降低56%。動物實驗發(fā)現(xiàn)，成年小鼠短期運動可上調(diào)海馬蛋白酶體活性而提高其學(xué)習(xí)能力[6]。Choi等[7]及Lopez等[8]發(fā)現(xiàn)淀粉樣前體蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠通過運動可以減少小鼠腦內(nèi)的淀粉樣斑塊沉積，從而提高小鼠的空間記憶能力。那么，中老年小鼠可否通過堅持長期運動而清除Aβ沉積，減輕Aβ的毒性作用，進而抑制AD的發(fā)生與發(fā)展呢？為此，課題組隨機選取12月齡小鼠建立長期自主跑輪運動模型及AD模型，觀察長期運動對Aβ1-42所致認知功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供12月齡SPF級BALB/c雄性小鼠，（SCXK（晉）2015-0001。隨機分為4組，①溶劑對照靜坐組（Veh+sedentary，VS），②Aβ1-42靜坐組（Aβ1-42+sedentary，AS），③溶劑對照長期自主跑輪運動組（Veh+runner，VR），④Aβ1-42長期自主跑輪運動組（Aβ1-42+runner，AR）。自主跑輪或靜坐6個月，AS及AR組小鼠海馬立體定位注射Aβ1-42，VS及VR組小鼠注射等量溶劑對照。

1.2.1 試劑 人源Aβ1-42寡聚體（英國Abcam公司），小鼠抗β-amyloid單克隆抗體（美國Biolegend公司），DAB染色試劑盒（美國life technologies公司），實驗組制備1μg/μl的寡聚體Aβ1-42。對照溶劑為等量DMSO溶于1×PBS溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 海馬立體定位注射Aβ1-42小鼠以2.5%異氟烷氣體持續(xù)麻醉，前囟為零點，向后2 mm，旁開1.5 mm，深2 mm[9]，海馬立體定位注射1μl Aβ1-42或?qū)φ杖軇?/p>

1.2.2 蛋白免疫印跡法 提取小鼠腦蛋白樣品，兔抗鼠泛素單克隆抗體（1：3000），兔抗鼠β-actin單克隆抗體（1：1000），辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗兔二抗（1：4000），參照文獻[6]孵育，曝光顯影，Image J軟件分析。

1.2.3 新物體識別實驗和Y迷宮自發(fā)交替實驗 小鼠記憶能力的行為學(xué)檢測方法參照課題組前期研究[6]。

1.2.4 蛋白酶體活性檢測 參照課題組前期研究[6,10]，提取小鼠新鮮海馬組織，BCA法測定蛋白濃度。檢測熒光酶標儀380 nm（激發(fā)波長）/460 nm（發(fā)射波長）處蛋白酶體活性水平。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 收集前囟-1.34 mm，至-2.30 mm的腦冠狀切片，厚16μm。參照文獻[6,10]，兔抗鼠Aβ一抗（1：200），4℃孵育過夜；DAB顯色，用Olympus顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照。

1.2.6 免疫組化結(jié)果分析 每組觀察4只小鼠，雙側(cè)海馬DG區(qū)，在400倍光鏡視野下選取8個不重復(fù)視野，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量平均光密度值（integrated option density，IOD）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 長期運動降低海馬泛素化蛋白堆積

12月齡小鼠自主跑輪6個月后取海馬組織，提蛋白，Western blot檢測，泛素化蛋白堆積水平較靜坐組下降0.2倍（P＜0.05，圖1），提示長期運動可促進海馬泛素化蛋白質(zhì)降解，有效降低泛素化蛋白堆積。

圖1 長期運動降低海馬泛素化蛋白堆積***P＜0.001，靜息組，n＝6Fig.1 Long-term exercise reduced the accumulation of ubiquitinated protein in hippocampus***P＜0.001,vs sedentary group,n=6

2.2 長期運動對Aβ1-42所致認知功能障礙的影響

2.2.1 新物體識別實驗 小鼠的活動距離無顯著差異，提示各組小鼠的活動能力相似。VR組小鼠新物體識別指數(shù)（66.4±1.5）%與VS組小鼠（59.1±1.4）%相比，提高0.12倍（P＜0.05），AS組小鼠新物體識別指數(shù)（44.8±3.7）%較對照組（59.1±3.7）%下降0.24倍（P＜0.01），表明Aβ1-42損傷小鼠的認知學(xué)習(xí)能力，但AR組小鼠新物體識別指數(shù)（63.6±3.6）%較AS組小鼠（44.8±3.7）%升高0.42倍（P＜0.05），提示長期運動可拮抗Aβ1-42導(dǎo)致中老年小鼠出現(xiàn)的認知功能障礙，見圖2。

圖2 新物體識別檢測長期運動改善Aβ1-42誘導(dǎo)的小鼠記憶障礙A:實驗流程圖 B:組間小鼠運動距離比較 C:訓(xùn)練期小鼠物體識別指數(shù) D:測驗期小鼠新物體識別指數(shù)*P＜0.01 vs VS組，P=0.0032，#P＜0.01 vs VS組，P=0.0025，△△P＜0.01 vs AS組，n=8Fig.2 Novel object recognition detected thelong-term exercise antagonizes Aβ1-42-induced spatial memory dysfunction in miceA:Experimental flow chart;B:Comparison of the distance in NORtest between groups;C：Comparison of the preference index of mice in training among all groups;D:Comparison of the preference index of mice in testing among all groups**P＜0.01 vs VS group,P=0.0032,#P＜0.01 vs VS group,P=0.0025,△△P＜0.01 vs ASgroup,n=8

2.2.2 Y迷宮自發(fā)交替實驗 各組小鼠總進臂次數(shù)相近，提示各組小鼠活動能力無明顯差異（P＞0.05）。與VS組小鼠入臂正確率（66.7±0.9）%相比，VR組小鼠（73.8±2.2）%提高0.1倍（P＜0.05），AS組小鼠（56.1±1.7）%下降0.16倍（P＜0.05），表明Aβ1-42損傷小鼠的認知學(xué)習(xí)能力。但AR組小鼠入臂正確率（67.7±2.4）%較AS組小鼠升高0.21倍（P＜0.05），表明長期運動可拮抗Aβ1-42導(dǎo)致中老年小鼠出現(xiàn)的認知功能障礙，見圖3。

圖3 自發(fā)交替實驗檢測長期運動改善Aβ1-42導(dǎo)致的空間記憶能力障礙A：入臂總次數(shù)比較 B：入臂正確率比較 **P＜0.01 vs VS組，###P＜0.001 vs VS組，△△P＜0.01 vs AS組，n=8Fig.3 Spontaneous alternating detection long-term exercise antagonizes Aβ1-42-induced spatial memory dysfunction in miceA：Comparison of the total number of arm entry in mice among all the groups;B：Comparison of the accuracy of arm entry in micebetween groups;**P＜0.01 vs VSgroup,###P＜0.001 vs VSgroup,△△P＜0.01 vs ASgroup,n=8

2.3 長期運動對小鼠注射Aβ1-42后海馬蛋白酶體活性及泛素化蛋白沉積的影響

與VS組比較，VR組蛋白酶體活性升高0.33倍（P＜0.01），AS組蛋白酶體活性下降約0.21倍（P＜0.01）。同時，AR組蛋白酶體活性較AS組升高0.18倍（P＜0.01），提示Aβ1-42抑制海馬蛋白酶體活性，而長期運動可維持海馬蛋白酶體活性（圖4A）。

圖4 長期運動對海馬蛋白酶體和泛素化蛋白的影響A：海馬蛋白酶體活性 B：免疫印跡檢測海馬泛素化蛋白積累 **P＜0.01，與VS組比較#P＜0.05，與VS組比較△△P＜0.01，與AS組比較n=6Fig.4 Effect of long-term exercise on the activity of hippocampal proteasome activity and the ubiquitinated protein level in miceA：The proteasome activity in hippocampus;B：The accumulation of ubiquitinated protein in mice hippocampus detected by Western blotting;**P＜0.01 vs VSgroup,#P＜0.05 vs VSgroup,△△P＜0.01 vs ASgroup,n=6

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，VR組小鼠海馬泛素化蛋白（0.83±0.06）較VS組小鼠（1.00±0.05）減少0.17倍（P＜0.01），提示長期自主跑輪運動可促進泛素化蛋白沉積減少。AS組小鼠海馬泛素化蛋白（1.15±0.10）較VS組小鼠（1.00±0.05）升高0.15倍（P＜0.01），而AR組小鼠海馬泛素化蛋白沉積（0.94±0.08）較AS組小鼠（1.15±0.10）下降0.21倍（P＜0.01），提示長期運動可拮抗Aβ1-42導(dǎo)致的泛素化蛋白堆積，促進泛素化蛋白質(zhì)清除（圖4B～C）。

2.4 免疫組化染色觀察海馬Aβ1-42沉積情況

鏡下可見Aβ1-42為棕黃色顆粒物（圖5A）。溶劑對照組（VS組和VR組）未見Aβ1-42陽性染色團塊，Aβ 1-42注射組（AS組和AR組）可見Aβ1-42染色陽性棕色團塊。AR組Aβ1-42免疫組化著色較淺，陽性表達（0.76±0.07）較AS組顯著減少（1.00±0.09）（P＜0.01），提示長期運動組Aβ1-42沉積率下降（圖5B）。

3 討論

長期的適宜運動能提高腦認知和學(xué)習(xí)記憶能力，降低AD發(fā)病率，預(yù)防或緩解AD病人以記憶功能障礙和認知能力下降為主的臨床表現(xiàn)，其機制可能與運動調(diào)控腦的Aβ堆積、神經(jīng)元的退行性變相關(guān)[11,12]。課題組的研究結(jié)果證明成年鼠短期自主跑輪運動可上調(diào)海馬蛋白酶體活性從而促進神經(jīng)發(fā)生[6]。本研究通過建立中老年小鼠長期運動及其對照模型，給予海馬立體定位Aβ1-42注射，2周后分別檢測小鼠海馬蛋白酶體活性、Aβ沉積水平，認知學(xué)習(xí)能力等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中老年小鼠長期自主跑輪運動可維持其海馬蛋白酶體活性，減少海馬泛素化蛋白堆積，降低Aβ沉積[11]，改善Aβ1-42所致的認知功能障礙，預(yù)防或緩解AD病理。

淀粉樣蛋白級聯(lián)假說認為AD其根本原因是Aβ在神經(jīng)元胞體外的異常沉積[13]，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞功能受損，神經(jīng)細胞數(shù)量進行性減少，患者端腦皮質(zhì)萎縮[14]。全基因組關(guān)聯(lián)研究、通路分析和蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)泛素化是AD的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。線蟲過表達19S蛋白酶體亞單位可降低Aβ的毒性反應(yīng)，延緩AD進程[15]。阿波嗎啡（APO）可激活蛋白酶體活性。Hemino等[16]在6月齡的三轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠（3xTg-AD小鼠）皮下注射APO，發(fā)現(xiàn)通過APO治療，3xTg-AD小鼠的記憶功能得到改善，神經(jīng)元內(nèi)Aβ和p-tau水平下降，這強烈表明，神經(jīng)元內(nèi)Aβ是AD一個重要的治療靶點。此外，APO可提高SHSY-5Y（人神經(jīng)母細胞瘤細胞）蛋白酶體活性，促進Aβ降解，降低p53蛋白水平[17]。同樣，亞甲藍可以激活3xTg-AD小鼠腦內(nèi)蛋白酶體活性，降低Aβ沉積水平，改善AD小鼠的認知功能[18]。白藜蘆醇，一種主要存在于葡萄中的天然多酚，可誘導(dǎo)Aβ水平下降，且該現(xiàn)象可被選擇性蛋白酶體抑制劑和RNAi定向沉默蛋白酶體亞基β5來阻止，提示白藜蘆醇可通過蛋白酶體途徑顯著降低細胞內(nèi)的Aβ水平[19]，可見，維持蛋白酶體活性有利于改善認知障礙。

綜上推測，中老年小鼠長期自主跑輪運動可上調(diào)海馬蛋白酶體活性從而改善Aβ沉積導(dǎo)致的認知障礙，該研究結(jié)果為“倡導(dǎo)體育運動，提高人民體質(zhì)”提供了理論和實驗基礎(chǔ)，但是其涉及的分子機制復(fù)雜，具體作用靶點有待進一步闡明。