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      氯碘羥喹對(duì)癲癇小鼠海馬神經(jīng)元凋亡和學(xué)習(xí)記憶功能的保護(hù)作用

      2022-02-14 08:16:54竇曉娜李霞李心雨張莉
      關(guān)鍵詞:光密度海馬癲癇

      竇曉娜,李霞,李心雨,張莉,3*

      錦州醫(yī)科大學(xué) 1.組織胚胎學(xué)教研室,2.附屬第一醫(yī)院口腔科,3.生物人類學(xué)研究所,遼寧 錦州 121001

      癲癇以反復(fù)、發(fā)作性的短暫腦功能異常為主要表現(xiàn),可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡,影響學(xué)習(xí)記憶功能[1]。研究發(fā)現(xiàn),反復(fù)發(fā)作的大腦異常放電可導(dǎo)致軸突終末大量釋放突觸小泡鋅,高濃度的鋅具有細(xì)胞毒性,是誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的主要原因。近年來(lái),人們發(fā)現(xiàn)鋅螯合劑-氯碘羥喹通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)鋅代謝對(duì)阿爾茲海默病和腦缺血再灌注等疾病有神經(jīng)保護(hù)作用,提示氯碘羥喹是治療神經(jīng)退行性疾病的一種潛在藥物。目前,關(guān)于氯碘羥喹對(duì)癲癇海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制研究較少,而大劑量的氯碘羥喹其毒性可導(dǎo)致亞急性脊髓視神經(jīng)病和暫時(shí)性全身性遺忘等病癥,因此,在給藥劑量、給藥方式和抗癲癇機(jī)制等方面需更深入的研究。本研究建立匹羅卡品癲癇小鼠模型,觀察氯碘羥喹對(duì)癲癇海馬神經(jīng)元凋亡及學(xué)習(xí)記憶功能的保護(hù)作用,期為氯碘羥喹在癲癇治療中的應(yīng)用及機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 動(dòng)物分組及給藥 54只CD1小鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)分3組。對(duì)照組:正常動(dòng)物腹腔注射生理鹽水;癲癇組:癲癇模型30 min后,腹腔注射生理鹽水;氯碘羥喹組:癲癇模型30 min后,一次性腹腔注射氯碘羥喹(15 mg/kg)。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)原則。

      1.1.2 主要藥品及試劑 氯碘羥喹和匹羅卡品(Sigma公司);兔抗小鼠多克隆Bcl-2和Bax抗體(Cell signaling Technology公司);山羊抗兔IgG、兔抗小鼠GAPDH單克隆抗體、ECL檢測(cè)試劑盒、蛋白Marker等(福州邁新公司);Caspase-9和Caspase-3的ELISA檢測(cè)試劑盒(上海谷研生物科技有限公司);尼氏染液、對(duì)苯二酚、乳化銀和硒酸鈉等(博士德公司)。

      1.2 研究方法

      1.2.1 匹羅卡品癲癇模型建立與鑒定 小鼠腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg,30 min后,腹腔注射匹羅卡品300 mg/kg,制備癲癇小鼠模型[2]。根據(jù)Racine等[3]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)癲癇級(jí)別:0級(jí),行為正常;Ⅰ級(jí),面部肌肉痙攣,咀嚼運(yùn)動(dòng)、眨眼、動(dòng)須和濕狗樣顫動(dòng);Ⅱ級(jí),頸部肌肉痙攣,點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng);Ⅲ級(jí),一側(cè)前肢陣攣;Ⅳ級(jí),站立伴雙前肢陣發(fā)性痙攣;Ⅴ級(jí),在Ⅳ級(jí)基礎(chǔ)上,身體向后倒下失去平衡,四肢抽動(dòng)。達(dá)到Ⅲ級(jí)以上者為癲癇發(fā)作,發(fā)作持續(xù)30 min以上者為癲癇持續(xù)狀態(tài)。癲癇發(fā)作1 h后,腹腔注射地西泮10 mg/kg終止癲癇發(fā)作。

      1.2.2 取材與標(biāo)本制備 7 d取材。小鼠用4%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉,取海馬。一部分制作冰凍切片,用于金屬自顯影和尼氏染色;另一部分用于免疫印跡和ELISA檢測(cè)。

      1.2.3 金屬自顯影技術(shù) 小鼠腹腔注射0.1%硒酸鈉(20 mg/kg),1.5 h后麻醉,2.5%戊二醛灌流固定,取腦組織。腦組織固定3 h,30%蔗糖4℃浸泡12 h,制冰凍切片。切片在染液(5.7%對(duì)二苯酚15 ml、0.1 mol/L檸檬酸10 ml、50%阿拉伯膠60 ml及0.8%乳化銀15 ml混勻)中26℃水浴染色1 h。常規(guī)脫水、透明、封片。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng),每個(gè)樣本選取5張切片,400倍光學(xué)顯微鏡下,每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)視野,測(cè)灰度值,計(jì)算光密度,取5張切片的平均值作為該樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

      1.2.4 尼氏染色 動(dòng)物麻醉后用4%多聚甲醛灌流固定,取海馬組織制作冰凍切片。室溫下切片用0.1%焦油紫染液染色10 min,PBS沖洗,常規(guī)脫水、透明、封片。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng),觀察海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量,方法同上。

      1.2.5 免疫印跡技術(shù) 組織沖洗、稱重后剪碎,超聲粉碎,裂解12 h。離心取上清,測(cè)蛋白濃度,沸水里煮5 min,冷卻后離心。制膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、染膜、裁膜。室溫封閉2 h。加兔抗小鼠Bcl-2和Bax多克隆抗體(1:500),內(nèi)參用GAPDH。4℃反應(yīng)12 h,TBST洗膜。室溫下山羊抗兔IgG(1:5000)反應(yīng)2 h,TBST洗膜。ECL顯色,測(cè)光密度。用目的條帶與內(nèi)參條帶光密度的比值表示待測(cè)蛋白含量。

      1.2.6 ELISA檢測(cè) 海馬組織清洗、剪碎、超聲粉碎,離心取上清。酶標(biāo)包被板37℃封閉2 h。去除封閉液,加入標(biāo)準(zhǔn)液、樣品、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照,37℃孵育1 h,PBS清洗。酶標(biāo)二抗37℃孵育1 h,PBS清洗。TMB底物室溫避光顯色10~30 min,加終止液。檢測(cè)OD450值。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算直線回歸方程式,根據(jù)樣品OD值計(jì)算樣品濃度。

      1.2.7 動(dòng)物行為學(xué)觀察 ①癲癇造模后7 d,觀察小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)、發(fā)作級(jí)別和總的發(fā)作持續(xù)時(shí)間,觀察時(shí)間為2 h。②T迷宮實(shí)驗(yàn)。先進(jìn)行2 d的適應(yīng)實(shí)驗(yàn)。小鼠放入T迷宮5 min,在迷宮的兩側(cè)臂放置食物,等小鼠取食后將其取出。第3 d開(kāi)始訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)。Forced run中,隨機(jī)關(guān)閉左或右臂,小鼠只能進(jìn)入開(kāi)放臂取食。15 s后進(jìn)行Test run測(cè)試。開(kāi)放兩臂,將小鼠放入開(kāi)始臂,小鼠進(jìn)入未曾進(jìn)入的臂為正確選擇,給食物獎(jiǎng)勵(lì);重復(fù)進(jìn)入相同的臂為錯(cuò)誤選擇,不給食物。每只動(dòng)物每天訓(xùn)練10次,每次間隔15 min。癲癇造模后7 d測(cè)試,將Forced run和Test run之間的間隔設(shè)置為15 s、60 s和180 s,計(jì)算正確率。③Y迷宮實(shí)驗(yàn)。癲癇造模后6 d測(cè)試。當(dāng)Y迷宮的一個(gè)臂亮燈時(shí),底部的銅網(wǎng)無(wú)電流,為安全區(qū);另兩個(gè)臂燈滅,底部銅網(wǎng)有電流,為非安全區(qū)。第1 d,把小鼠放入迷宮適應(yīng)環(huán)境5 min。把小鼠所在臂作為起步區(qū)電擊,小鼠直接逃入安全區(qū)為正確反應(yīng),否則為錯(cuò)誤反應(yīng)。小鼠到達(dá)安全區(qū)30 s后,以小鼠所處的臂為起步區(qū),隨機(jī)變換安全區(qū)位置,再進(jìn)行下一次電擊。連續(xù)10次測(cè)試有9次正確反應(yīng)作為達(dá)到學(xué)會(huì)逃避的標(biāo)準(zhǔn),記錄小鼠達(dá)標(biāo)需要訓(xùn)練的次數(shù)。24 h后重新測(cè)試,每只小鼠測(cè)試10次,計(jì)算正確率,作為24 h記憶保持率。

      1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      2 結(jié)果

      2.1 金屬自顯影技術(shù)觀察鋅在海馬的分布

      陽(yáng)性反應(yīng)為棕褐色細(xì)顆粒狀。與對(duì)照組相比,癲癇組海馬CA1和CA3區(qū)陽(yáng)性顆粒更密集,棕褐色加深,光密度增大,提示海馬鋅增多;與癲癇組相比,氯碘羥喹組的陽(yáng)性顆粒密集程度降低,棕褐色變淺,光密度減小,提示海馬鋅減少(P<0.01),見(jiàn)圖1。

      圖1 鋅在海馬的分布A:海馬金屬自顯影染色B:CA3區(qū)的光密度 C:CA1區(qū)的光密度*P<0.01,與對(duì)照組相比#P<0.01,與癲癇組相比n=6Fig.1 Distribution of zinc in hippocampusA:Autometallography of hippocampus;B:Average optical density in CA3;C:Average optical density in CA1*P<0.01 vs Control group;#P<0.01 vs Epilepsy group;n=6

      2.2 尼氏染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量

      與對(duì)照組相比,癲癇組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元變小,細(xì)胞皺縮,尼氏體模糊,色深,細(xì)胞數(shù)量減少;與癲癇組相比,氯碘羥喹組神經(jīng)元的形態(tài)明顯改善,細(xì)胞皺縮減輕,尼氏體較清晰,色淺,細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.01),見(jiàn)圖2。

      圖2 海馬神經(jīng)元的形態(tài)和數(shù)量(箭頭所指為海馬神經(jīng)元)A:海馬尼氏染色B:CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量C:CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量*P<0.01,與 對(duì) 照 組相比#P<0.01,與癲癇組相比n=6Fig.2 Morphology and number of hippocampal neurons (Arrows referred to the hippocampal neurons)A:Nissl staining of hippocampus; B:The number of neurons in CA3;C:The number of neuronsin CA1*P<0.01 vs Control group;#P<0.01 vs Epilepsy group;n=6

      2.3 免疫印跡技術(shù)檢測(cè)海馬Bcl-2和Bax表達(dá)

      與對(duì)照組相比,癲癇組Bcl-2減少,光密度降低,Bax增多,光密度增高,Bcl-2/Bax值減??;與癲癇組比較,氯碘羥喹組Bcl-2增高,光密度增大,Bax減少,光密度降低,Bcl-2/Bax值增大(P<0.01),見(jiàn)圖3。

      圖3 海馬Bcl-2和Bax的表達(dá)A:免疫印跡條帶B:Bcl-2表達(dá)C:Bax表達(dá)D:Bcl-2與Bax比值*P<0.01,與對(duì)照組相比#P<0.01,與癲癇組相比n=6Fig.3 Expressionsof Bcl-2 and Bax in hippocampusA:The image of immunoblotting;B:Expression of Bcl-2;C:Expression of Bax;D:The ratio of Bcl-2 and Bax expression;*P<0.01 vs Control group;#P<0.01 vs Epilepsy group,n=6

      2.4 ELISA檢測(cè)海馬Caspase-9和Caspase-3表達(dá)

      與對(duì)照組相比,癲癇組和氯碘羥喹組Caspase-9和Caspase-3表達(dá)均明顯增多;與癲癇組相比,氯碘羥喹組Caspase-9和Caspase-3表達(dá)減少(P<0.01),見(jiàn)圖4。

      圖4 海馬Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)*P<0.01,與對(duì)照組相比#P<0.01,與癲癇組相比n=6Fig.4 The expression of caspase-9 and caspase-3 in hippocampus*P<0.01 vs Control group;#P<0.01 vs Epilepsy group,n=6

      2.5 自發(fā)性癲癇的發(fā)作級(jí)別、發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時(shí)間

      對(duì)照組小鼠無(wú)自發(fā)性癲癇發(fā)作。癲癇組和氯碘羥喹組都有自發(fā)性癲癇發(fā)作;與癲癇組相比,氯碘羥喹組的發(fā)作級(jí)別降低,發(fā)作次數(shù)減少,發(fā)作持續(xù)時(shí)間縮短(P<0.01),見(jiàn)圖5。

      圖5 癲癇發(fā)作級(jí)別、發(fā)作次數(shù)和發(fā)作持續(xù)時(shí)間比較A:癲癇發(fā)作級(jí)別B:發(fā)作次數(shù)C:發(fā)作持續(xù)時(shí)間 *P<0.01,與對(duì)照組相比#P<0.01,與癲癇組相比n=12Fig.5 Comparison of theseizurelevel,seizuretimesand durationA:Seizurelevel;B:Seizuretimes;C:Duration *P<0.01 vs Control group;#P<0.01 vs Epilepsy group,n=12

      2.6 T迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶功能

      當(dāng)Force run與Test run間隔15 s和60 s時(shí),3組的正確率無(wú)明顯差異(P>0.05)。當(dāng)間隔180 s時(shí),與對(duì)照組相比,癲癇組和氯碘羥喹組的正確率降低,氯碘羥喹組的正確率高于癲癇組(P<0.01),見(jiàn)圖6。

      圖6 T迷宮檢測(cè)正確率*P<0.01,與對(duì)照組相比#P<0.01,與癲癇組相比n=6Fig.6 Accuracy by Tmaze detection*P<0.01 vs Control group;#P<0.01 vs Epilepsy group,n=6

      2.7 Y迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶功能

      與對(duì)照組相比,癲癇組和氯碘羥喹組達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需的次數(shù)增多,24 h記憶保持率降低;與癲癇組相比,氯碘羥喹組達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需的次數(shù)減少,24 h記憶保持率增高(P<0.01),見(jiàn)圖7。

      圖7 Y迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶功能A:達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需次數(shù)B:24 h記憶保持率 *P<0.01,與對(duì)照組相比#P<0.01,與癲癇組相比n=6Fig.7 Learning and memory ability by Y mazedetectionA:Times to meet institute standards;B:Memory retention rate of 24 h*P<0.01 vs Control group;#P<0.01 vs Epilepsy group,n=6

      3 討論

      癲癇與神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致的海馬結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān),而鋅在神經(jīng)元內(nèi)的大量聚集是凋亡的主要原因[4]。高濃度鋅具有明顯的細(xì)胞毒作用,能破壞線粒體膜的穩(wěn)定性,引起氧化應(yīng)激反應(yīng),細(xì)胞外鈣內(nèi)流,細(xì)胞發(fā)生凋亡[5]。研究發(fā)現(xiàn),利用瘦素降低細(xì)胞內(nèi)的鋅離子水平,維持鋅穩(wěn)態(tài),能對(duì)抗谷氨酸對(duì)HT22細(xì)胞的細(xì)胞毒性[6]。香芹芬和2-氨基乙氧基苯硼酸能減少癲癇誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鋅積累和活性氧的產(chǎn)生,顯著降低癲癇發(fā)作后的神經(jīng)元凋亡[7]。氯碘羥喹能減少海馬鋅水平,抑制腦缺血再灌注小鼠神經(jīng)元凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),癲癇小鼠海馬鋅增多,神經(jīng)元受損,數(shù)量減少,Bcl-2減少,Caspase-9、Caspase-3和Bax增多,Bcl-2/Bax減小,證實(shí)了鋅的神經(jīng)毒性。給予氯碘羥喹后,小鼠海馬鋅明顯減少,神經(jīng)元損傷減輕,數(shù)量增加,Bcl-2增多,Caspase-9、Caspase-3和Bax減少,Bcl-2/Bax增大,提示氯碘羥喹可通過(guò)減少海馬鋅降低鋅毒性,抑制癲癇小鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

      研究發(fā)現(xiàn),鋅能抑制GABA合成酶和谷氨酸脫羧酶,阻斷GABAA受體,增加中樞興奮性,誘導(dǎo)癲癇[8]。給予小劑量的鋅能使動(dòng)物出現(xiàn)強(qiáng)直陣攣性抽搐和跳躍等神經(jīng)興奮性表現(xiàn),誘發(fā)Cav 2.3轉(zhuǎn)基因小鼠癲癇發(fā)作[9];PRG5基因沉默可通過(guò)增加海馬鋅提高小鼠癲癇易感性[10]。本研究也發(fā)現(xiàn),癲癇組小鼠海馬鋅增多,自發(fā)性癲癇增多、級(jí)別增加,持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng);給予氯碘羥喹后,海馬鋅減少,自發(fā)性癲癇減少、級(jí)別降低、持續(xù)時(shí)間縮短,提示,氯碘羥喹可通過(guò)減少小鼠海馬鋅抑制自發(fā)性癲癇。分析其原因可能是:一方面,氯碘羥喹通過(guò)減少海馬鋅降低中樞興奮性;另一方面,氯碘羥喹通過(guò)減輕鋅的細(xì)胞毒性,保護(hù)海馬神經(jīng)元,減少因神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致的異常神經(jīng)環(huán)路的形成。

      在臨床上,約60%以上的顳葉癲癇患者出現(xiàn)由神經(jīng)元死亡導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,新生大鼠癲癇能導(dǎo)致海馬鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體-1減少、鋅增多,認(rèn)知功能降低[11]。低壓缺氧模型中,鋅在海馬的大量聚集與神經(jīng)元丟失和記憶功能障礙有關(guān);利用鋅螯合劑Ca2+EDTA能抑制神經(jīng)元損傷,改善空間記憶和聯(lián)想記憶[12]。氯碘羥喹能改善阿爾茲海默病小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[13];能降低血漿鋅,改善手術(shù)后學(xué)習(xí)記憶障礙[14]。本研究結(jié)果與以上研究相似,癲癇組T迷宮的正確率、Y迷宮達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練次數(shù)和24 h記憶保持率均降低,提示癲癇破壞了小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能;給予氯碘羥喹能顯著改善學(xué)習(xí)記憶功能,分析其可能是通過(guò)螯合鋅離子抑制了神經(jīng)元凋亡和細(xì)胞缺失而發(fā)揮此作用。

      氯碘羥喹是治療神經(jīng)退行性疾病的潛在藥物。但是,氯碘羥喹與亞急性脊髓視神經(jīng)病和暫時(shí)性全身性遺忘有關(guān)。小鼠連續(xù)2周腹腔注射30 mg/kg氯碘羥喹即可損傷突觸可塑性和認(rèn)知能力,因此,用藥的安全性及其機(jī)制尚需深入研究。本組前期研究發(fā)現(xiàn)[15],在制備匹羅卡品小鼠癲癇模型前,連續(xù)腹腔注射小劑量氯碘羥喹1周能顯著減少癲癇海馬鋅,增加神經(jīng)元數(shù)量,降低血清和腦脊液S-100β和NSE蛋白表達(dá),減輕損傷,縮短逃避潛伏期,延長(zhǎng)目標(biāo)象限滯留時(shí)間,提示氯碘羥喹對(duì)神經(jīng)元和學(xué)習(xí)記憶有保護(hù)作用。但是,動(dòng)物的癲癇發(fā)作率和發(fā)作級(jí)別增高,潛伏期縮短,癲癇易感性增強(qiáng),分析可能是由氯碘羥喹預(yù)處理造成的海馬低鋅對(duì)匹羅卡品易感而致。因此,本次實(shí)驗(yàn)改進(jìn)給藥劑量和給藥時(shí)機(jī),采用在癲癇造模后一次性給予中等劑量的氯碘羥喹,結(jié)果證明該給藥劑量和方法安全有效,有效降低了海馬鋅,抑制了小鼠自發(fā)性癲癇發(fā)作,降低發(fā)作級(jí)別、發(fā)作次數(shù)和發(fā)作持續(xù)時(shí)間,保護(hù)了小鼠海馬神經(jīng)元,抑制其細(xì)胞損傷與凋亡,提高了學(xué)習(xí)記憶功能。

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