UPLC法測(cè)定辣條中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的含量

◎ 吳 迪，李姝睿，孔凡麗，李 剛

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033）

辣條是以小麥粉或其他谷物、豆類為主要原料，添加食用油、食用鹽、香辛料、味精及食品添加劑制成的一種調(diào)味面制食品，是休閑零食中的頭號(hào)“網(wǎng)紅”。為了防止被微生物污染和追求口感色澤，市售的辣條多會(huì)使用大量的添加劑。苯甲酸、山梨酸是常用的防腐劑，對(duì)霉菌、酵母和細(xì)菌均有抑制作用，苯甲酸鈉的急性毒性較小，但過(guò)量使用也會(huì)引起腹瀉、腹痛和心跳加速等癥狀；山梨酸（鉀）的防腐效果比苯甲酸（鈉）好，但長(zhǎng)期食用也會(huì)刺激腸胃系統(tǒng)[1]。糖精鈉作為食品加工中常用的甜味劑，其毒性不強(qiáng)，但有一定的致癌性。對(duì)于這3 種添加劑的限量問(wèn)題，在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[2]中有明確的規(guī)定，因此，準(zhǔn)確地測(cè)定其含量對(duì)企業(yè)添加劑的使用有指導(dǎo)作用。氣相色譜法[3-5]和液相色譜法[6-9]是測(cè)定苯甲酸、山梨酸、糖精鈉常用的檢測(cè)方法，前處理過(guò)程中常用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅來(lái)沉淀蛋白[10-11]，用正己烷除脂[12]，但對(duì)辣條（基質(zhì)較復(fù)雜的樣品）中這3 種添加劑的研究不多。本文以辣條為研究對(duì)象，使用乙腈水溶液提取，正己烷除脂，結(jié)合通過(guò)式固相技術(shù)，建立了簡(jiǎn)單快速測(cè)定苯甲酸、山梨酸及糖精鈉的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

辣條樣品，購(gòu)自長(zhǎng)春本地超市，于粉碎機(jī)充分?jǐn)囁椋洳貍溆?；苯甲酸鈉（純度99.0%）、山梨酸鉀（純度99.2%）、糖精鈉（純度99.1%），中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；乙腈、正己烷，色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Oasis PRiME HLB 固相萃取柱，美國(guó)Wters 公司。

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜，美國(guó)Wters 公司；JP-020PLUS 超聲波清洗器，昆山舒美；VORTEX3 渦旋混勻儀，德國(guó)IKA 公司；MS204/A電子天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；RV10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1 000 mg·L-1）：取一定量的糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品于120 ℃的烘箱中烘至恒重，置于干燥器中冷卻。分別準(zhǔn)確稱取干燥后的糖精鈉0.117 0 g、苯甲酸鈉0.118 0 g、山梨酸鉀0.134 0 g 于同一100 mL容量瓶，用水溶解定容至刻度。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（200 mg·L-1）：準(zhǔn)確量取上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液10 mL 于50 mL 的容量瓶中，用水定容至刻度。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精確吸取0.05 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL和10.00 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液置于10 mL 容量瓶，用流動(dòng)相定容至刻度，稀釋成質(zhì)量濃度分別為1 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1和200 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

取市售辣條約200 g，用粉碎機(jī)充分搗碎后，準(zhǔn)確稱取2.00 g試樣于50 mL離心管中，加10 mL提取液（乙腈∶水=8 ∶2）于離心管中，渦旋振蕩1 min，超聲波提取15 min，10 000 r·min-1離心5 min，過(guò)濾上層清液。固體殘?jiān)屑尤?0 mL 提取液再提取一次，合并上層清液于分液漏斗，加入20 mL 正己烷，振蕩?kù)o止分層，收集中間乙腈層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用5%的乙腈定容至5.0 mL，先取約2 mL 潤(rùn)洗Oasis PRiME HLB 固相萃取柱，流干后棄去流出液，再移取2.0 mL 加入固相萃取柱，保持每秒1 滴的速度通過(guò)，收集流出液，供UPLC 檢測(cè)。

1.2.3 超高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：10 mmol·L-1乙酸銨+乙腈=95+5；流速：0.3 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：3 μL；柱溫：40 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在紫外均有吸收，所以，選擇紫外檢測(cè)器檢測(cè)，掃描最大吸收波長(zhǎng)，綜合考慮確定測(cè)定波長(zhǎng)為230 nm。比較了乙酸銨和乙腈不同比例下色譜分離情況，發(fā)現(xiàn)乙酸銨∶乙腈=95 ∶5 時(shí)，3 個(gè)待測(cè)物有較好的分離度，確定流動(dòng)相乙酸銨∶乙腈=95 ∶5（V∶V）。比較了不同乙酸銨濃度對(duì)分析效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，待測(cè)物的保留性均隨乙酸銨濃度的增加而增強(qiáng)，但乙酸銨濃度超過(guò)10 mmol·L-1時(shí)，待測(cè)物的峰形也變得扭曲，峰展寬，拖尾明顯，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)最終選擇乙酸銨濃度為10 mmol·L-1。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和1.2.2 試樣提取溶液分別經(jīng)超高效液相色譜儀按照1.2.3 的條件進(jìn)樣，測(cè)定3 個(gè)待測(cè)物質(zhì)的峰面積，以混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中待測(cè)物的質(zhì)量濃度（mg·L-1）為橫坐標(biāo)（x），相應(yīng)待測(cè)物的峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2 方法檢出限與定量限

制備不同濃度的陽(yáng)性加標(biāo)樣品，待測(cè)物的信噪比為3 ∶1 時(shí)，對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度為方法檢出限，當(dāng)信噪比為10 ∶1 時(shí)，對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度為方法定量限。3 個(gè)待測(cè)物的檢出限、定量限見(jiàn)表1。

表1 3 種待測(cè)物線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限表

2.2.3 準(zhǔn)確度與精密度

制備3 個(gè)濃度的加標(biāo)樣品，分別為10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、100 mg·kg-1，同時(shí)做樣品空白。經(jīng)1.2.2處理，按1.2.3 測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在3 種不同添加濃度下的回收率范圍為91.1%～97.3%，RSD 為1.67%～4.32%，完全滿足檢測(cè)方法對(duì)加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求。

表2 回收率與精密度結(jié)果表（n=6）

3 結(jié)論

用乙腈水溶液提取辣條中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉，Oasis PRiME HLB 固相萃取柱凈化，線性關(guān)系、回收率和精密度理想，適用于辣條中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定。