微生物代謝調(diào)控策略研究進(jìn)展①

吳 賀 賀春萍

（1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院 云南昆明 650201；2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所 海南?？?571101）

微生物細(xì)胞工廠已被廣泛應(yīng)用于包括氨基酸［1-2］以及像維生素、生物堿［3-5］等多種代謝產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)。與化學(xué)合成和直接提取法相比，微生物發(fā)酵具有產(chǎn)率較高、環(huán)境污染小或無污染、操作簡單、不需要大量活體材料等獨(dú)特優(yōu)勢，代謝工程是指利用多基因重組技術(shù)有目的的對細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個(gè)新的學(xué)科領(lǐng)域。

自20世紀(jì)90年代提出代謝工程概念［6-7］，歷經(jīng)多年發(fā)展，代謝工程技術(shù)已被成功應(yīng)用于多種生物化工產(chǎn)品和醫(yī)藥制品生產(chǎn)，如谷氨酸棒桿菌生產(chǎn) ω-羥基脂肪酸［8］，重組大腸桿菌合成生松素［9］。早期的代謝工程主要基于菌株自身代謝條件，通過對能產(chǎn)生含有目標(biāo)產(chǎn)物的原始菌株進(jìn)行篩選，挑出天然條件下合成效率最高的菌株進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化，包括提升關(guān)鍵反應(yīng)效率，限制或消除不利于產(chǎn)物合成的副反應(yīng)進(jìn)行，以便人工改造出最適于合成目標(biāo)產(chǎn)物的工程菌［10-11］。實(shí)際操作過程中有些菌株經(jīng)過改造后，不僅不能提高目的產(chǎn)物合成效率，連自身正常的生長發(fā)育都很難保證［12］，而發(fā)酵過程中內(nèi)部環(huán)境的不斷變化，同樣也會(huì)影響到菌株的生長和產(chǎn)物表達(dá)，特別是次級代謝產(chǎn)物［13］。根據(jù)查閱前期相關(guān)文獻(xiàn)，微生物發(fā)酵過程效率低下大致有以下原因：①中間代謝物的積累形成反饋抑制降低目的產(chǎn)物產(chǎn)率；②細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成中能量和前體物質(zhì)的競爭會(huì)紊亂微生物整體代謝過程；③產(chǎn)物生成過程中有毒、有害物質(zhì)的大量積累毒害細(xì)胞；④產(chǎn)物生成受到有關(guān)限速酶的抑制。

實(shí)際生產(chǎn)過程中不僅要考慮菌株的正常生長，還要考慮產(chǎn)物的合成效率，因此，生物學(xué)家提出基于傳統(tǒng)代謝工程與現(xiàn)代計(jì)算機(jī)模型預(yù)測相結(jié)合的新方案，如針對單一菌株的通路分析與基因改造，在此基礎(chǔ)上發(fā)展共培養(yǎng)菌落策略以及基于計(jì)算機(jī)預(yù)測的新型蛋白質(zhì)工程與生物元件（核糖體開關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子，RNA調(diào)控）介導(dǎo)的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略。隨著微生物代謝理論與代謝特性認(rèn)識的不斷深入，通過基因改造提升現(xiàn)有菌種的發(fā)酵性能，發(fā)掘新的調(diào)控元件，人工改造設(shè)計(jì)新酶，都可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)途徑的修飾和構(gòu)筑。

1 通路分析與遺傳改造

生物體內(nèi)生化反應(yīng)大多依賴于酶的催化，由于代謝網(wǎng)絡(luò)中限速反應(yīng)的效率主要與酶活性有關(guān)，因此，篩選編碼限速酶的關(guān)鍵基因位點(diǎn)并進(jìn)行合適的修飾改造，以提高反應(yīng)速率積累目的產(chǎn)物，這是傳統(tǒng)代謝工程的基本思路，也是增加產(chǎn)物產(chǎn)量最常用的方法之一。具體方法是對菌株代謝通路進(jìn)行分析，確定限速位點(diǎn)和限速酶，利用基因編輯修飾限速酶基因，或轉(zhuǎn)入外源基因產(chǎn)出高活性目標(biāo)酶類，提高限速反應(yīng)速率，提升目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率。另一種方法是通過CRISPR-Cas9基因敲除技術(shù)去除某些副反應(yīng)相關(guān)基因，阻斷與目標(biāo)途徑相競爭的代謝途徑，使底物和能量向目標(biāo)反應(yīng)傾斜，提升目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。在實(shí)際生產(chǎn)中兩種策略往往聯(lián)用以期達(dá)到更好的效果。如張齊全等［14］以畢赤酵母GS115為出發(fā)菌株，對肌醇合成通路的關(guān)鍵基因IPS進(jìn)行過表達(dá)并敲除兩個(gè)合成轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，解除畢赤酵母對肌醇合成途徑的代謝調(diào)控；同時(shí)選擇兩個(gè)外源肌醇合成基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母過表達(dá)，結(jié)果顯示重組菌株的肌醇產(chǎn)量為5.04g/L，與原始菌株相比，產(chǎn)量有明顯提升。

2 菌株共培養(yǎng)調(diào)控策略

微生物代謝工程可以根據(jù)需求在單個(gè)菌株中通過構(gòu)建和優(yōu)化代謝途徑來生產(chǎn)代謝產(chǎn)物，但單個(gè)菌株無法應(yīng)對時(shí)，效率會(huì)下降。因此，提出了將負(fù)責(zé)不同代謝物合成途徑的微生物聚類在一起形成菌群，以減少單個(gè)菌株代謝負(fù)擔(dān)，提高效率的新策略——菌株共培養(yǎng)調(diào)控策略［15-17］（以下簡稱共培養(yǎng)調(diào)控策略）。共培養(yǎng)調(diào)控策略將完整的生物合成途徑模塊化，通過多種微生物各自負(fù)責(zé)某一特定模塊井然有序地完成每一步反應(yīng)（圖1）。與傳統(tǒng)的單菌株培養(yǎng)方法相比，共培養(yǎng)調(diào)控策略可以減少各菌株的代謝負(fù)擔(dān)，能承受更劇烈的環(huán)境變化［18］。目前，該技術(shù)已應(yīng)用于包括氨基酸、蛋白質(zhì)、類黃酮、生物堿、萜類化合物等代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)［19-20］，如 Jones J A 等［21］通過 4 種不同大腸桿菌菌株的混合培養(yǎng)來合成天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，將天竺葵素-3-O-葡萄糖苷合成途徑拆分為4個(gè)模塊。第一種菌株負(fù)責(zé)將葡萄糖、木糖和甘油轉(zhuǎn)化為苯丙酸；第二菌株利用苯丙酸和外源添加的丙二酸生成黃烷酮；通過第三菌株負(fù)責(zé)將黃烷酮轉(zhuǎn)化為黃烷醇；第四菌株過表達(dá)花青素合酶（ANS）和3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）基因分別將黃烷醇轉(zhuǎn)化為花青素，并分別對花青素進(jìn)行糖基化修飾。利用共培養(yǎng)調(diào)控策略合成天竺葵素-3-O-葡萄糖苷，最高產(chǎn)量為9.5 mg/L，是單培養(yǎng)物的11.2倍。

圖1 共培養(yǎng)菌群生產(chǎn)代謝產(chǎn)物示意圖［22］

共培養(yǎng)調(diào)控策略雖已取得較大進(jìn)展，但仍處于起步階段，還需要進(jìn)一步的優(yōu)化。如共培養(yǎng)菌落策略如何確保共培養(yǎng)菌株中所有或絕大部分菌株都能在同一種生長條件下高效生長，并且菌株之間不會(huì)產(chǎn)生相互抑制的有毒化合物，這需要盡量選擇同一種屬菌株［23］。如應(yīng)用共培養(yǎng)菌落策略當(dāng)資源有限時(shí)，菌株之間就可能會(huì)產(chǎn)生競爭，最終破壞整個(gè)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，可往培養(yǎng)體系不斷添加新鮮培養(yǎng)液以維持大多數(shù)菌株最適生長條件。

3 新型蛋白質(zhì)工程策略

酶的催化是大多代謝反應(yīng)高效完成的一種不可或缺的要素，酶在代謝工程中通常是作為生物催化劑調(diào)節(jié)代謝途徑的反應(yīng)效率，前期代謝工程大多集中在通過增加基因表達(dá)水平和酶濃度來改變代謝通量，然而大多天然酶在工業(yè)條件下穩(wěn)定性較差，催化活性低，存在反饋抑制等問題，極大阻礙了天然酶在工業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用。作為系統(tǒng)代謝工程和合成生物學(xué)的有力工具，新型蛋白質(zhì)工程通過基于計(jì)算機(jī)協(xié)助的“定向進(jìn)化”“理性設(shè)計(jì)”兩種策略構(gòu)建具有所需特性的新型酶或蛋白質(zhì)［24］，提高關(guān)鍵酶在天然代謝途徑中的活性和效率，現(xiàn)已成為微生物代謝改造中不可或缺的方法之一。

圖2 定向進(jìn)化（Directed evolution）和理性設(shè)計(jì)（Rational design） 流程示意圖［24］

3.1 定向進(jìn)化（Directed evolution）策略

定向進(jìn)化已成為改善酶特性最有效的方法之一［25］，即通過構(gòu)建突變文庫，篩選改良變異庫。此方法不需要了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息［26］，近年來，對定向進(jìn)化結(jié)果的篩選方法也有一定的研究，如Gul I等［27］用一種改造后的96孔板紙面高通量篩選法，在紙面上讓酶和含目標(biāo)底物的指示劑結(jié)合并反應(yīng)，以指示劑單位時(shí)間內(nèi)顏色強(qiáng)度變化度量酶活性大小。此方法快捷方便，也不需要昂貴的儀器和大量試劑，顯示了紙基全細(xì)胞篩選與數(shù)字圖像比色法相結(jié)合的潛力，是發(fā)現(xiàn)工業(yè)上重要酶極具前景的方法。

3.2 理性設(shè)計(jì)（Rational design）策略

與定向進(jìn)化不同，理性設(shè)計(jì)是通過改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)，該方法要求使用者對蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)信息有一定了解。隨著結(jié)晶學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)算法的發(fā)展，人們可以準(zhǔn)確設(shè)計(jì)出具有所需特性的蛋白質(zhì)［28-29］。Wang H等［30］利用了一種基于抑制結(jié)合態(tài)和二次設(shè)計(jì)的合理分子設(shè)計(jì)，該策略包括：①預(yù)測胃蛋白酶-BGL1復(fù)合物結(jié)構(gòu)的相互作用點(diǎn)和關(guān)鍵氨基酸；②通過結(jié)構(gòu)評估優(yōu)化胃蛋白酶抗性突變體；③設(shè)計(jì)突變體的分子結(jié)構(gòu)并構(gòu)筑。

3.3 半理性設(shè)計(jì)（Semi-rational design）策略

半理性設(shè)計(jì)策略是定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)策略的有機(jī)結(jié)合，即先根據(jù)蛋白質(zhì)知識合理選擇用于突變的候選殘基，構(gòu)建小型隨機(jī)突變文庫，識別出具有所需特性的突變酶。該策略結(jié)合了兩個(gè)策略的優(yōu)點(diǎn)，能準(zhǔn)確快速篩選所需要的突變酶，但要求研究者需要掌握一些與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子互作相關(guān)的知識，目前開始在酶改造中廣泛采用。如Li P等［31］利用半理性設(shè)計(jì)策略聯(lián)合計(jì)算機(jī)輔助分析提高6-磷酸葡萄糖胺合成酶（GlmS）活性，首先通過同源建模和分子對接鎖定GlmS和底物6-磷酸果糖（F6P）的結(jié)合位點(diǎn)；其次，利用Py‐MOL軟件分析GlmS三級結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；最后，選擇5種氨基酸位點(diǎn)Leu593、Ala594、Lys595、Ser596和Val597為突變點(diǎn)構(gòu)建突變文庫，篩選結(jié)果表明當(dāng)5種氨基酸位點(diǎn)之一的Leu593突變?yōu)镾er593時(shí)，酶活性從5 U/mL增加到48 U/mL，分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明Ser增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的柔韌性，最終導(dǎo)致酶活性增加?？梢姡肜硇栽O(shè)計(jì)策略在代謝工程的未來發(fā)展中具備相當(dāng)大的潛力。

4 生物元件動(dòng)態(tài)調(diào)控

4.1 動(dòng)態(tài)調(diào)控策略概況

通路分析與遺傳改造策略、菌株共培養(yǎng)調(diào)控策略和新型蛋白質(zhì)工程策略等沒有考慮菌株生長內(nèi)部環(huán)境的變化，因此，把這些策略統(tǒng)稱為靜態(tài)調(diào)控策略。實(shí)際上微生物所處環(huán)境并不是靜止的，環(huán)境的細(xì)微變化會(huì)影響微生物的生長和表達(dá)，因?yàn)楣こ叹曜陨頍o法針對這種變化進(jìn)行及時(shí)的調(diào)控。為此，Anesiadis N等［32］首先提出了動(dòng)態(tài)代謝工程（Dynamic metabolic engineering）概念，其主要內(nèi)容是啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（Ribosome binding site， RBS）、非編碼RNA等監(jiān)測調(diào)控元件根據(jù)胞內(nèi)代謝物含量或外界環(huán)境動(dòng)態(tài)變化精確調(diào)控某些基因，尤其是異源基因的表達(dá)。然而，在當(dāng)時(shí)研究條件下，大部分調(diào)控組件因菌體自身或外部環(huán)境限制無法發(fā)揮作用，加之某些代謝途徑的調(diào)控機(jī)制還未完全了解清楚，因此限制了該策略的發(fā)展。 近年來，經(jīng)過生物學(xué)家的不斷努力，許多調(diào)控元件已被用于多種代謝體系的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略，尤其是當(dāng)常規(guī)策略不適用于目前狀況時(shí)。如Zhang Q Q等［33］以畢赤酵母作為工程菌株生產(chǎn)肌醇時(shí)，為了控制細(xì)胞生長和肌醇產(chǎn)生之間的代謝通量分布，用甘油誘導(dǎo)啟動(dòng)子替代了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Zwf），葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（Pgi）和6-磷酸果糖激酶（Pfk1）基因的啟動(dòng)子，因此，突變菌株可以通過依次補(bǔ)充甘油和葡萄糖從生長模式切換到生產(chǎn)模式，導(dǎo)致肌醇產(chǎn)量增加至原來4.9倍。Wu J J等［34］以丙二酰輔酶A為底物利用大腸桿菌生產(chǎn)柚皮素時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用常規(guī)代謝調(diào)控策略會(huì)產(chǎn)生明顯負(fù)面效應(yīng)，菌株生長遲緩并死亡，因此初步構(gòu)建了一種依賴于反義RNA（asRNA）的微調(diào)途徑平衡丙二酰輔酶A對細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的需求。通過asRNA系統(tǒng)可以逐步沉默2個(gè)脂肪酸合成反應(yīng)關(guān)鍵基因fabB和fabE抑制脂肪酸合成，同時(shí)丙二酰輔酶A也隨fabB和fabE沉默的增加而累積，使大腸桿菌從生長模式（脂肪酸合成）逐步過渡到生產(chǎn)模式（柚皮素合成），但進(jìn)一步的基因沉默作用導(dǎo)致中間代謝物積累，抑制終產(chǎn)物生產(chǎn)。這說明相對于一般的靜態(tài)調(diào)控，模擬自然調(diào)控的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略在平衡微生物生長與生產(chǎn)間具有較大優(yōu)勢，可能會(huì)成為微生物代謝工程的主要發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)之一。

4.2 動(dòng)態(tài)調(diào)控策略存在的問題和挑戰(zhàn)

動(dòng)態(tài)調(diào)控策略能提高微生物發(fā)酵能力，但目前由于大部分調(diào)控元件作用未知，可能同一調(diào)控元件在不同菌株中產(chǎn)生的調(diào)控效果也不同，因此，目前動(dòng)態(tài)調(diào)控策略只在少數(shù)已成功解析出代謝通路的工程菌株中得到有效應(yīng)用，大規(guī)模應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)還有許多亟待解決的問題：①部分策略往往需要添加誘導(dǎo)物或改變培養(yǎng)條件，這有可能會(huì)和菌株原始生長條件相抵觸，增大菌種突變率，導(dǎo)致調(diào)控系統(tǒng)不穩(wěn)定［11］。②構(gòu)建某些外來系統(tǒng)可能會(huì)破壞菌體穩(wěn)態(tài)，影響其正常生長周期。③代謝途徑的激活或抑制可能需要特定生物大分子的輔助作用，因此，動(dòng)態(tài)調(diào)控策略還有待繼續(xù)完善，相信日后動(dòng)態(tài)調(diào)控策略的發(fā)展將會(huì)吸引更多研究者們的關(guān)注和參與。

5 展望

自然界中微生物分布極為廣泛，前人研究已表明，微生物代謝調(diào)控機(jī)制與微生物自身特性息息相關(guān)。這對代謝工程的發(fā)展提出了更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。一方面許多工業(yè)微生物自身代謝途徑復(fù)雜多樣，需要將模塊分析預(yù)測和系統(tǒng)代謝工程有機(jī)結(jié)合，不斷調(diào)整優(yōu)化策略保持菌株最佳代謝效率；另一方面大多微生物的代謝效率依賴于限速酶活性和底物結(jié)合能力，因此，進(jìn)一步發(fā)展蛋白質(zhì)工程，通過提高酶活和底物結(jié)合能力，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)突破產(chǎn)物合成瓶頸的有效辦法。

隨著計(jì)算機(jī)領(lǐng)域中人工智能、云計(jì)算理念引入到包括代謝工程在內(nèi)的諸多領(lǐng)域中，有力支持了微生物代謝通路的解析和預(yù)測，同時(shí)也標(biāo)志著代謝工程開始向大型化、自動(dòng)化、智能化發(fā)展［35］。而生物學(xué)領(lǐng)域CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)［36-37］、RNA干擾［37-38］等新型基因編輯工具的出現(xiàn)，給研究者們提供了更多選擇來系統(tǒng)深入分析預(yù)測出的菌株代謝基因。而新調(diào)控機(jī)制和調(diào)控元件的不斷出現(xiàn)，使得微生物細(xì)胞工廠構(gòu)筑和代謝調(diào)控方法更加成熟穩(wěn)定，這必然會(huì)為未來轉(zhuǎn)入實(shí)際大規(guī)模生產(chǎn)提供更加豐富的理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。