稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體微生物多樣性分析

張圓圓，趙良杰，李 泓，朱文錦

（1. 上海海洋大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；2. 河南省水產(chǎn)科學研究院，河南 鄭州 450044；3. 信陽農(nóng)林學院 水產(chǎn)學院，河南 信陽 464000）

黃鱔（Monopterus albus）又名鱔魚，隸屬輻鰭亞綱（Actinopterygii）、合鰓魚目（Syn-branchiformes）、合鰓魚科（Synbranchidae）、黃鱔屬（Monopterus），是我國淡水名優(yōu)養(yǎng)殖品種。黃鱔因肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)豐富及獨特的藥用價值越來越受消費者青睞，但受人工捕撈和水域污染等影響，野生黃鱔資源日益減少，近年來，人工網(wǎng)箱養(yǎng)殖黃鱔因占用水面少、養(yǎng)殖效益高等特點已成為黃鱔養(yǎng)殖的主要模式[1]。但常規(guī)網(wǎng)箱養(yǎng)殖黃鱔存在網(wǎng)箱底部容易積累大量殘餌糞便、水體流動性差、水質(zhì)易缺氧老化、氨氮和亞硝酸鹽含量過高的情況，成為制約黃鱔網(wǎng)箱養(yǎng)殖的關鍵技術問題[2]。

養(yǎng)殖水體中微生物主要來自空氣、土壤、動植物殘體及分泌排泄物等，廣泛參與水體中氨化、固氮、硝化及反硝化等物質(zhì)循環(huán)[3]，并能夠反映特定系統(tǒng)的水質(zhì)狀況，是水體的重要組成部分，在養(yǎng)殖水環(huán)境中具有重要的意義[4]。稻漁綜合種養(yǎng)作為我國當前生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的主要模式之一，在保障糧食安全、拓展?jié)O業(yè)發(fā)展空間、促進農(nóng)業(yè)增效農(nóng)民增收中發(fā)揮了重要作用[5-6]。其中稻蝦（克氏原螯蝦，Procambarus clarkii）綜合種養(yǎng)因其操作簡單、收益較高，已成為我國最受歡迎、應用面積最大、總產(chǎn)量最高的稻漁綜合種養(yǎng)模式[7-8]。但克氏原螯蝦作為底棲生物，主要占據(jù)水體底層空間，稻蝦綜合種養(yǎng)模式下養(yǎng)殖環(huán)溝中上層環(huán)境并未得到有效利用。鑒于此，將黃鱔網(wǎng)箱養(yǎng)殖與稻蝦綜合種養(yǎng)立體結合，即在稻蝦綜合種養(yǎng)環(huán)溝內(nèi)設置黃鱔養(yǎng)殖網(wǎng)箱，黃鱔產(chǎn)生的殘餌糞便被克氏原螯蝦利用，同時克氏原螯蝦的活動可增加水體溶氧，促進系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)轉化，改善養(yǎng)殖環(huán)境。為明確稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)模式水體微生物特征，通過Illumina MiSeq 分析方法，對河南信陽羅山縣稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)模式下稻田水體環(huán)境中微生物群落結構和多樣性進行分析及菌群功能預測，旨在為科學評價稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)模式提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

試驗于2020 年8—10 月在河南省信陽市羅山縣商湖農(nóng)業(yè)公司進行，選取2 hm2稻蝦綜合種養(yǎng)實驗基地，在2 個相鄰的環(huán)溝內(nèi)共設置浮式聯(lián)排網(wǎng)箱30 個，每溝15 個。每個網(wǎng)箱面積約1 m2，箱內(nèi)水深約30 cm，網(wǎng)箱中栽種水花生，面積約為網(wǎng)箱面積的90%～95%。試驗在網(wǎng)箱內(nèi)（T1）、網(wǎng)箱外（T2）、鄰側環(huán)溝（T3）、對側環(huán)溝（T4）設置4 個采樣點（圖1），于8月22日、9月6日、9月24日、10月11日、10月25日在4個采樣點分別采集水樣1 L。其中水體溶解氧（DO）、酸堿度（pH 值）用便攜式水質(zhì)分析儀現(xiàn)場檢測，總磷（TP）、總氮（TN）、硝酸鹽氮（NO3--N）、氨態(tài)氮（NH4+-N）、亞硝酸鹽氮（NO2--N）、高錳酸鹽指數(shù)（CODMn）指標通過將水樣低溫帶回檢測。其中TP、TN 含量測定參照GB/T 11894—1989、GB/T 11893—1989 中的方法，NO3--N、NO2--N 含量測定參照HJ/T 346—2007、GB/T 7493—1987 中的方法，NH4+-N 含量測定參照GB/T 7479—1987中的方法，CODMn測定參照GB 11892—1989 中的方法。水化學指標檢測后，從剩余水樣取500 mL 用0.22 μm 硝酸纖維素濾膜進行過濾，濾液保存于-20 ℃冰箱，待所有樣本采集完成后統(tǒng)一進行微生物多樣性分析。第1次采樣編號為T1_1、T2_1、T3_1、T4_1，共采樣5 次，編號以此類推。

圖1 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)試驗田采樣點Fig.1 Sampling points in test field of rice-crayfish-eel coculture system

1.2 測序方法

對16S rRNA 基因的V4—V5 區(qū)進行擴增，上下游引物分別為515F（5＇-GTGCCAGCMGCCGCGG-3＇）、907R（5＇-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3＇），擴增 體 系 共20 μL：4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，5 μmol/L 上下游引物各0.8 μL，0.4 μL FastPfu 聚合酶，0.2 μL BSA，10 ng DNA 模板（10 ng/μL），ddH2O 補至20 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行27 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。利用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進行檢測和回收，采用Illumina MiSeq測序平臺進行雙端測序[9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

對原始測序序列使用Trimmomatic 軟件進行質(zhì)量控制，通過FLASH 軟件進行拼接，使用UPARSE軟件根據(jù)97%的相似度對序列進行操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）聚 類，使 用UCHIME軟件剔除嵌合體，獲得樣本有效序列，利用RDPclassifier 對每條序列進行物種分類注釋，在門、綱、屬等不同分類水平上對各樣本的群落組成進行統(tǒng)計分析，與Silva 數(shù)據(jù)庫（SSU128）進行比對，設置比對閾值為70%。群落結構采用柱狀圖描述，表示各樣品中不同菌群操作分類單元所占百分比。

采用香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、Ace 指數(shù)、辛普森（Simpson）指數(shù)、Chao 指數(shù)及覆蓋度（Coverage）評價不同采樣點水體微生物群落的Alpha 多樣性；使用菌群代謝功能預測工具PICRUST 對OTU 豐度進行標準化，在直系同源基因簇（COG）中對比每個OTU對應的基因名稱，獲得OTU 對應的COG 家族信息，計算各COG 的豐度，從直系同源蛋白分組比對（eggNOG）數(shù)據(jù)庫解析各COG 的描述信息和功能信息，得到功能豐度譜。利用SPSS 19.0軟件對多樣性指數(shù)進行非參數(shù)檢驗和T檢驗，分析不同采樣點的微生物多樣性指數(shù)差異。利用SPSS 19.0 軟件對水體化學指標和門水平群落結構進行冗余分析（RDA），得到影響群落結構的主要環(huán)境因子。

2 結果與分析

2.1 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體測序結果分析

通過Illumina MiSeq 測序平臺對T1、T2、T3、T4共4 個采樣點20 個樣本的16S rRNA 基因V4—V5區(qū)進行測序，原始序列數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控和過濾后共得到有效序列1 130 370 條，按97%相似度水平聚類，得到3 737 個OTU，共鑒定出47 門、137 綱、309 目、509 科、929 屬、1 697 種。各樣品的OTU 數(shù)、序列數(shù)及Alpha多樣性指數(shù)見表1。

表1 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體測序情況和Alpha多樣性統(tǒng)計Tab.1 Sequencing and alpha-diversity of samples in rice-crayfish-eel coculture system

Alpha 多樣性主要對單樣品的微生物組成進行分析，可以反映樣本的群落結構和豐富度，常用的度量指標包括Shannon 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Simpson 指 數(shù) 和Coverage 值。其 中，Shannon 指 數(shù)、Chao 指數(shù)、Ace 指數(shù)越高表明菌群的多樣性和豐度越高，Simpson 指數(shù)值越低表明菌群的多樣性越高，Coverage 值越接近于1 表明測序深度越合理[9]。從表1 可以看出，各樣本Coverage 值均高于0.989，表明測序樣本覆蓋率較好，序列未被測出的概率較低。T3、T4 采樣點的Shannon 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Ace指數(shù)高于T1、T2 采樣點，Simpson 指數(shù)和Coverage 值低于T1、T2 采樣點，配對樣本的非參數(shù)檢驗和T檢驗均表明，各個采樣點間的多樣性指數(shù)均未見顯著性差異。

從圖2 可以看出，各樣本共有OTU 為157 個，T3_3 獨有的OTU 最少，為0 個，T1_5 獨有的OTU 最多，為211 個。從采樣時間來看，第5 次采樣的樣本較前期樣本具有較高的獨有OTU 數(shù)量，表明隨著養(yǎng)殖過程的進行，采樣點間逐漸表現(xiàn)出較大的微生物群落組成差異。

圖2 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體OTU的Venn分析Fig.2 Venn analysis of OTU in samples of rice-crayfish-eel coculture system

2.2 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體微生物組成分析

2.2.1 基于門水平的水體微生物組成分析 測序結果顯示，采樣點微生物在門水平上主要包括變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、浮霉菌門（Planctomycetota）、綠彎菌門（Chloroflexi）和Armatimonadota 共8 個菌門。除Armatimonadota之外，其余7種在T1、T2、T3采樣點豐度均超過1%；T4 采樣點所有菌門豐度均超過1%。T1、T4 采樣點優(yōu)勢菌門（豐度＞10%）包括變形菌門、藍細菌門、放線菌門、厚壁菌門，T2、T3 采樣點優(yōu)勢菌門（豐度＞10%）包括變形菌門、藍細菌門、放線菌門。其中，T1采樣點變形菌門豐度（50.25%）高于T2（41.55%）（P＜0.05）、T3（37.38%）（P＜0.05）、T4 采樣點（38.24%）（P＜0.05），T3 采 樣 點 藍 細 菌 門 豐 度（31.29%）高 于T1（14.23%）（P＜0.05）、T2（30.83%）（P＞0.05）、T4采樣點（24.11%）（P＜0.05），T4采樣點放線菌門豐度（15.82%）高于T1（11.60%）（P＜0.05）、T2（10.53%）（P＜0.05）、T3 采 樣 點（12.30%）（P＜0.05）（圖3）。

圖3 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體微生物在門水平分布情況Fig.3 Distribution of microflora at the phylum level in rice-crayfish-eel coculture system

2.2.2 基于綱水平的水體微生物組成分析 如圖4所示，在綱水平上，采樣點微生物組成主要包括γ-變 形 菌 綱（Gammaproteobacteria）、藍 細 菌 綱（Cyanobacteriia）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、梭狀芽孢桿菌綱（Clostridia）、普朗克菌綱（Bacilli）、嗜 酸 菌 綱（Acidimicrobiia） 、浮 霉 菌 綱（Planctomycetes）、綠彎菌綱（Chloroflexia）、嗜熱菌綱（Thermoleophilia）共11 個菌綱，T1 和T4 采樣點豐度超過1%的菌綱有10種，T2和T3采樣點豐度超過1%的菌綱有9 種。4 個采樣點相對豐度最高的3 個菌綱均為γ-變形菌綱、藍細菌綱、α-變形菌綱，T1、T2 和T4 采樣點的第一優(yōu)勢菌綱為γ-變形菌綱，T3的第一優(yōu)勢菌綱為藍細菌綱。γ-變形菌綱在各采樣點的相對豐度分別為T1（36.50%）＞T2（31.20%）＞T3（27.03%）＞T4（24.07%），藍細菌綱在各采樣點的相對豐度分別為T3（31.20%）＞T2（30.80%）＞T4（24.05%）＞T1（14.20%），a-變形菌綱在各采樣點的相對豐度分別為T4（14.10%）＞T1（13.60%）＞T2（10.33%）＞T3（10.30%）（圖4）。

圖4 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體微生物在綱水平分布情況Fig.4 Distribution of microflora at the class level in rice-crayfish-eel coculture system

2.3 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體微生物群落結構分析

NMDS非度量多維尺度分析對不同物種微生物群落間物種多樣性進行組間比較分析，樣本以點顯示，點之間的距離表明相互關系的遠近，由此判斷各樣本群落組成的相似性[10]。如圖5 所示，從空間的角度看，各采樣點菌群均能較好地自成區(qū)域，但也有部分重疊。從時間的角度看，隨著養(yǎng)殖進行，同次采樣各個點的離散程度越來越大，表明養(yǎng)殖后期，4個采樣點的微生物群落結構發(fā)生了較大改變?？梢?，黃鱔養(yǎng)殖網(wǎng)箱的設置顯著改變了其周圍區(qū)域的小環(huán)境和微生物群落結構。

圖5 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體微生物NMDS非度量多維尺度分析（脅強系數(shù)：0.093）Fig.5 NMDS multidimensional scaling analysis of microflora in rice-crayfish-eel coculture system（stress：0.093）

2.4 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體COG功能預測

通過PICRUST 工具對樣本微生物群落進行COG 功能預測和分類統(tǒng)計，結果表明，4個采樣點菌群均具有22個功能分類簇，且均在氨基酸轉運和代謝、能量產(chǎn)生和轉化及翻譯、核糖體結構和生物發(fā)生3個功能類群的相對豐度較高，在細胞運動、細胞周期控制和細胞分裂、染色體分配功能菌群相對豐度較低，不同采樣點之間功能分類均無顯著差異（圖6）。

圖6 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體微生物群落COG功能統(tǒng)計Fig.6 The COG function classification of microflora in rice-crayfish-eel coculture system

2.5 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體環(huán)境因子和微生物群落的RDA分析

對水體環(huán)境因子和門水平微生物群落進行RDA 分析，結果表明，前2 個排序軸的特征值分別為35.71%、8.33%，NO2--N 含量對水體微生物群落影響最大，其次是TN 和NH4+-N 含量，CODMn對水體微生物群落影響最小。其中，NO2--N 含量與TN、NH4+-N 含量呈負相關，與TP、NO3--N 含量和CODMn呈正相關；變形菌門豐度與TN、NH4+-N 含量呈正相關，與TP、NO3--N、NO2--N 含量和CODMn呈負相關；藍細菌門豐度與TP、NO3--N、NO2--N 含量和CODMn呈正相關，與TN、NH4+-N 含量呈負相關；放線菌門豐度與TN、TP 含量和CODMn呈正相關，與NO3--N、NH4+-N含量呈負相關（圖7）。

圖7 稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)水體環(huán)境因子與微生物菌群RDA分析Fig.7 RDA of environmental factors and microbial flora in rice-crayfish-eel coculture system

3 結論與討論

微生物在養(yǎng)殖環(huán)境的物質(zhì)循環(huán)和能量流動過程中發(fā)揮著重要作用，微生物群落組成和多樣性與環(huán)境異質(zhì)性密切相關，常可作為環(huán)境變化的指示因子[11]。微生物群落結構的多樣性會影響水體理化環(huán)境因子和養(yǎng)殖效果[12]。對養(yǎng)殖環(huán)境中微生物多樣性進行研究，不僅可以為養(yǎng)殖過程中病害防控提供參考，還能對養(yǎng)殖環(huán)境微生態(tài)調(diào)控提供理論依據(jù)[13-14]。本研究將網(wǎng)箱養(yǎng)殖黃鱔和稻蝦綜合種養(yǎng)立體結合，通過Illumination MiSeq測序技術對不同采樣點水體的微生物群落多樣性指數(shù)進行配對樣本的非參數(shù)檢驗和T檢驗，結果表明，各個采樣點間并未表現(xiàn)出微生物多樣性指數(shù)的顯著差異，表明網(wǎng)箱設置并未顯著改變各個區(qū)域的微生物多樣性指數(shù)。Venn 分析結果顯示，隨著養(yǎng)殖進行，不同采樣點擁有更多的獨有OTU 數(shù)，即微生物菌群組成在各采樣點表現(xiàn)出較為明顯的差異。

對優(yōu)勢物種的分析顯示，門水平上，變形菌門、藍細菌門、放線菌門均為各采樣點的優(yōu)勢菌門。變形菌門是細菌中最大的門，包含多種代謝種類細菌，廣泛參與環(huán)境中的物質(zhì)代謝[15]。前人研究表明，水環(huán)境中多數(shù)參與有機物降解和生物脫氮除磷過程的細菌屬于變形菌門，如硝化細菌、反硝化細菌等[16]。本研究中，T1 采樣點變形菌門的相對豐度高達50.25%，顯著高于其他3 個采樣點，推測網(wǎng)箱內(nèi)因代謝物質(zhì)積累較多造成變形菌門積累。藍細菌門和放線菌門的豐度，均與水體中N、P 含量密切相關，水體中TP含量的增加會促進藍細菌和放線菌的生長繁殖[4，17]。聶志娟等[18]的研究結果表明，稻鯉共生系統(tǒng)和單稻模式水體中優(yōu)勢菌門均為變形菌門、放線菌門等，與本研究結果一致。綱水平上，γ-變形菌綱、藍細菌綱和α-變形菌綱為不同采樣點的共同優(yōu)勢菌綱，與門水平分析結果相吻合。γ-變形菌是海洋中普遍存在的細菌，多樣性高，多數(shù)為兼性異養(yǎng)菌，以有機物作為碳源，是系統(tǒng)中降解高錳酸鹽的主要參與者[4，13]。α-變形菌綱是淡水細菌群落中典型的優(yōu)勢類群，包括能與植物共生的固氮細菌，可為水體提供更強的固氮能力[3]。推測在稻蝦鱔養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)，細菌能夠較好地進行水體自凈，并廣泛參與N 循環(huán)過程，對維持系統(tǒng)健康具有重要的作用。

微生物群落組成對環(huán)境差異有著較強的敏感性，菌群結構與環(huán)境因素密切相關且相互影響[19-20]。本研究中，T1、T2、T4采樣點具有較明顯的群落組成差異，尤其T1 和T2 采樣點的群落組成幾乎未有重疊，表明網(wǎng)箱養(yǎng)殖黃鱔對水環(huán)境中微生物的群落組成影響明顯，與本研究中Alpha 多樣性分析結果一致。對水體環(huán)境因子和微生物群落進行RDA 分析結果表明，NO2--N、TN、NH4+-N 含量等指標與微生物群落呈現(xiàn)出較強的相關性，CODMn相關性最小，這與陳玲等[20]的研究結果一致，表明氮元素對水體微生物群代謝功能具有重要意義。同時，α-變形菌綱在4個采樣點中均為優(yōu)勢菌綱，推測與系統(tǒng)氮循環(huán)相關的菌群如硝化菌群、反硝化菌群多樣性和豐度均較豐富，下一步需對N 循環(huán)相關菌群進行深入研究。

閆法軍等[21]的研究結果表明，微生物群落的代謝功能特征能夠反映環(huán)境的健康狀況?；?6S rDNA 進行COG 功能預測的比較分析可以觀測不同組別樣品之間微生物群落的功能差異，是研究群落樣本與環(huán)境適應性變化的有效手段[10]。對稻蝦鱔立體綜合種養(yǎng)系統(tǒng)中COG 功能預測分析表明，系統(tǒng)水體共有22個功能簇，其中與氨基酸轉運和代謝有關的菌群豐度最高，其次為與能量產(chǎn)生和轉化有關的菌群，與細胞周期控制、細胞分裂、染色體分配有關的菌群豐度最低。表明水體細菌代謝活動十分活躍，但細菌的更新迭代較慢，水體易老化，實際生產(chǎn)中應注意加強水體的更換，促進系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)。

本研究通過在稻蝦共生系統(tǒng)中加入黃鱔網(wǎng)箱養(yǎng)殖，進一步利用水體空間，豐富了系統(tǒng)的生物多樣性，但因網(wǎng)箱內(nèi)代謝廢物積累較多，物質(zhì)循環(huán)減弱，造成特定菌群富集，降低了網(wǎng)箱內(nèi)微生物多樣性，形成了不同區(qū)域內(nèi)的微生物組成空間異質(zhì)性。同時，由于網(wǎng)箱內(nèi)外水體交換能力較差，網(wǎng)箱內(nèi)較高的營養(yǎng)鹽積累不能得到網(wǎng)箱外水體的有效緩沖，造成網(wǎng)箱內(nèi)變形菌門豐度較高，進一步需采取間隔設置網(wǎng)箱或加大網(wǎng)布孔徑等措施加強網(wǎng)箱內(nèi)外水體交換，同時，需對N 循環(huán)相關的菌群如硝化菌群、反硝化菌群的豐度和優(yōu)勢種進行測定分析，完善稻蝦鱔綜合種養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)部微生物評價體系，為傳統(tǒng)稻漁綜合種養(yǎng)模式創(chuàng)新、提質(zhì)增效提供參考。