雙酶法制備玉米芯還原糖工藝條件優(yōu)化

王婧璇 陸步詩(shī),2 李新社,2 伍 強(qiáng),2

(1. 邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000；2. 生態(tài)釀酒技術(shù)與應(yīng)用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽(yáng) 422000)

玉米芯是玉米脫穗去粒后剩下的中心棒軸，具有吸水能力強(qiáng)、結(jié)構(gòu)一致、柔韌度良好、硬度高、耐磨等優(yōu)點(diǎn)[1]，經(jīng)處理后能得到葡萄糖、纖維素、木糖、糖糠以及活性炭等物質(zhì)[2]。作為一種可再生類資源[3]，玉米芯富含膳食纖維、粗脂肪、粗蛋白、粗纖維等營(yíng)養(yǎng)成分，其中纖維素在玉米芯中占比約35%，半纖維素為35%～40%[4]，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

研究者[5-8]常采用物理、化學(xué)和生物等處理技術(shù)降解玉米芯，獲得目的產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)玉米芯資源再利用。孟悅等[9]采用高溫?zé)峤夥ń到庥衩仔?，提取戊聚糖并進(jìn)行工藝優(yōu)化。戴莉等[10]使用高溫液態(tài)水預(yù)處理玉米芯，并利用表面活性劑吐溫80輔助纖維素酶進(jìn)行酶解，以提高生物質(zhì)催化轉(zhuǎn)化效率。應(yīng)文俊等[11]利用磷酸聯(lián)合過氧化氫(H3PO4-H2O2，PHP)預(yù)處理玉米芯，再通過纖維素酶水解，以酶解效率為指標(biāo)得到最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件。這些研究多是利用物理、化學(xué)方法，或與酶制劑結(jié)合的技術(shù)降解玉米芯。物理技術(shù)對(duì)設(shè)備要求高、成本大；化學(xué)方法易產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物，對(duì)環(huán)境有害；生物處理方法具有綠色環(huán)保、條件簡(jiǎn)易等特點(diǎn)。而目前生物處理方法研究多集中于利用水解酶制劑降解玉米芯，郝茜珣[12]采用內(nèi)切木聚糖酶和纖維素酶降解玉米芯獲取低聚木糖和單糖。劉麗娜等[13]通過優(yōu)化堿性蛋白酶、α-淀粉酶和糖化酶預(yù)處理玉米芯，提取不溶性膳食纖維(IDF)和可溶性膳食纖維(SDF)。玉米芯主要由半纖維素、纖維素和木質(zhì)素等物質(zhì)組成[4,14]，利用酶制劑作用于連接纖維素和半纖維素間的糖苷鍵，能破壞玉米芯細(xì)胞壁，同時(shí)破壞圍繞在纖維素和半纖維素外部的木質(zhì)素屏障，暴露出內(nèi)部深層的纖維素和半纖維素，進(jìn)一步使其降解為單糖類物質(zhì)[15-16]。與陸步詩(shī)等[17]僅用纖維素酶降解玉米芯相比，采用纖維素酶和半纖維素酶具有更高的降解效果。研究擬選用纖維素酶、半纖維素酶協(xié)同降解玉米芯高效定向制備還原糖，以期實(shí)現(xiàn)玉米芯的再利用與資源優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

玉米芯：含秋玉米，市售；

纖維素酶：酶活5萬(wàn)U/g，南寧龐博生物工程有限公司；

半纖維素酶：酶活3萬(wàn)U/g，南寧龐博生物工程有限公司；

氫氧化鈉：食品級(jí)，晟發(fā)生物科技有限公司；

3,5-二硝基水楊酸：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

丙三醇：分析純，西隴化工股份有限公司；

葡萄糖：分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

傾斜式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：ZN-1000A型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-1AB型，北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-4型，北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；

電子天平：LE204E/02型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

pH計(jì)：PE28型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

可見分光光度計(jì)：722型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

臺(tái)式冷凍離心機(jī)：VElOCITY 14R型，Dynamica Scientific Ltd。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

玉米芯→粉粹、過篩(40目[17])→干燥(75 ℃，24 h)→混料[m玉米芯∶V蒸餾水=1∶20 (g/mL)[18]]→調(diào)節(jié)pH(5.0±0.2[18])→酶解(根據(jù)所需雙酶添加量，按體積分?jǐn)?shù)添加至上述玉米芯液后用棉塞封口，放置水浴鍋中，設(shè)置需要的溫度和時(shí)間進(jìn)行酶解反應(yīng)，且每60 min攪拌2 min)→離心(10 000 r/min，15 min)→檢測(cè)還原糖含量

1.3.2 單因素試驗(yàn)

(1) 雙酶配比：試驗(yàn)設(shè)置酶添加量體積分?jǐn)?shù)為3.0%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間5 h，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，做3次平行試驗(yàn)，檢測(cè)酶解液的還原糖含量，探究雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶為10∶5，11∶4，12∶3，13∶2，14∶1)對(duì)玉米芯酶解的最佳條件。

(2) 酶添加量：試驗(yàn)設(shè)置雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)為13∶2，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間5 h，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，做3次平行試驗(yàn)，檢測(cè)酶解液的還原糖含量，探究酶添加量(體積分?jǐn)?shù)為1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%)對(duì)玉米芯酶解的最佳條件。

(3) 酶解溫度：試驗(yàn)設(shè)置雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)為13∶2，酶添加量體積分?jǐn)?shù)為3.0%，酶解時(shí)間5 h，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，做3次平行試驗(yàn)，檢測(cè)酶解液的還原糖含量，探究酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)對(duì)玉米芯酶解的最佳條件。

(4) 酶解時(shí)間：試驗(yàn)設(shè)置雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)為13∶2，酶添加量體積分?jǐn)?shù)為3.0%，酶解溫度50 ℃，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，做3次平行試驗(yàn)，檢測(cè)酶解液的還原糖含量，探究酶解時(shí)間(2，3，4，5，6 h)對(duì)玉米芯酶解的最佳條件。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)得到的結(jié)論，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定玉米芯產(chǎn)還原糖的最佳酶解條件。

1.3.4 酶解液還原糖含量測(cè)定 根據(jù)趙凱等[19]方法稍作修改，吸取0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL的1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.5，0.4，0.3，0.2，0.1，0.0 mL的去離子水至1～6號(hào)試管中，再分別加入1.5 mL DNS試劑，放入沸水浴中加熱煮沸5 min。待冷卻后各加入去離子水4 mL，混合均勻靜置待用。1號(hào)管內(nèi)試劑視為空白對(duì)照組，測(cè)定各管試劑在540 nm處吸光度，以還原糖濃度為X軸，吸光度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。玉米芯酶解上清液用去離子水稀釋5倍，吸取0.1 mL稀釋后的上清液與1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，補(bǔ)加去離子水至5 mL，靜置反應(yīng)20 min，測(cè)定樣液在540 nm處吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得出還原糖含量，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert.V8.0.6.1處理分析響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，Excel 2010 軟件繪制標(biāo)曲。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

還原糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性回歸方程為Y=0.83X+0.001，R2=0.999 4。

圖1 還原糖質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)對(duì)玉米芯降解產(chǎn)還原糖的影響 由圖2可知，m纖維素酶∶m半纖維素酶為13∶2時(shí)，還原糖含量達(dá)到最大值，當(dāng)繼續(xù)增大纖維素酶添加比例時(shí)，還原糖含量開始降低。當(dāng)增加纖維素酶占比時(shí)，纖維素酶起主導(dǎo)作用，能充分降解玉米芯中所含的纖維素[20]，產(chǎn)生還原糖，但降低半纖維素酶含量后，破壞玉米芯中包裹纖維素和半纖維素外部木質(zhì)素屏障的能力降低[14]，纖維素酶和半纖維素酶不能達(dá)到最佳降解效果，因而還原糖含量降低。當(dāng)m纖維素酶∶m半纖維素酶為13∶2時(shí)，玉米芯酶解液的酶解效果最好。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 酶添加量對(duì)玉米芯降解產(chǎn)還原糖的影響 由圖3可知，酶添加量為3.0%時(shí)還原糖含量出現(xiàn)最高值，繼續(xù)增大酶添加量，還原糖含量開始降低。這可能是因?yàn)殡S著纖維素酶和半纖維素酶的添加，玉米芯中細(xì)胞壁破壞程度變大[16]，纖維素得到有效降解，還原糖含量增加顯著，但酶用量過高時(shí)，可能由于酶間競(jìng)爭(zhēng)抑制作用[21]，酶促反應(yīng)受到抑制[22]，酶解效率降低，還原糖含量降低。當(dāng)酶添加量為3.0%時(shí)，酶解效果最好。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 酶解溫度對(duì)玉米芯降解產(chǎn)還原糖的影響 由圖4可知，酶解溫度為40～50 ℃時(shí)，還原糖含量呈上升趨勢(shì)，超過50 ℃之后，還原糖含量開始下降。這可能是由于溫度升高，酶的反應(yīng)活力增加，使酶的反應(yīng)速度提高，酶解更完全，但溫度過高時(shí)，纖維素酶和半纖維素酶的酶解活力被抑制，酶解速度降低[23]，還原糖含量減少。當(dāng)酶解溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，酶解效果最好。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)玉米芯降解產(chǎn)還原糖的影響 由圖5可知，酶解時(shí)間為2～5 h時(shí)，還原糖含量隨酶解時(shí)間的增加而升高，但酶解時(shí)間超過5 h之后，還原糖含量開始下降。這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，酶制劑充分發(fā)揮了酶促作用，玉米芯能夠被充分降解，當(dāng)酶解時(shí)間超過5 h后，纖維素酶和半纖維素酶失去活性，還原糖不再增加[23]；而產(chǎn)生的還原糖又可能與玉米芯蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)而被消耗，從而導(dǎo)致玉米芯酶解液中還原糖含量降低。當(dāng)酶解時(shí)間為5 h時(shí)，玉米芯酶解液達(dá)到最佳效果。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)、酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間為影響因素，以還原糖含量為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。不同試驗(yàn)條件下的還原糖含量如表2所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到還原糖含量(Y)與各因素的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=12.24+0.27A+0.19B+0.20C+0.37D+0.065AB-0.20AC+0.07AD+0.13BC-0.042BD-0.22CD-0.41A2-0.64B2-1.02C2-0.39D2。

(1)

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)的方差分析結(jié)果?

2.3.2 影響因素的交互作用分析 由圖6(a)可知，雙酶配比與酶添加量之間交互作用顯著，且雙酶配比的高線變化更為緊密，表明雙酶配比對(duì)還原糖含量的影響更顯著，與方差分析所得結(jié)論一致。圖6(b)顯示，隨著酶解溫度和時(shí)間的增加，還原糖含量呈先上升后降低的趨勢(shì)。圖6(c)中，酶添加量與酶解溫度交互作用的等高線更接近圓形，表明2個(gè)因素交互對(duì)還原糖含量的作用不明顯。

圖6 各因素交互作用等高線及響應(yīng)曲面圖

2.3.3 最優(yōu)條件的選取與驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)結(jié)果，得到由纖維素酶和半纖維素酶復(fù)配的混合酶水解玉米芯的最佳酶解條件為：雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)13.38∶2、酶添加量3.08%、酶解溫度50.10 ℃、酶解時(shí)間5.15 h，在該條件下響應(yīng)面軟件預(yù)測(cè)的還原糖含量為12.40 mg/mL。為方便實(shí)際操作，將工藝參數(shù)修正為雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)13∶2、雙酶添加量3.25%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間5 h的條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其平均還原糖含量為12.45 mg/mL，與模型預(yù)測(cè)的結(jié)果基本一致，表明該模型可以有效反映各因素對(duì)還原糖含量的影響，模型可行。

3 結(jié)論

選用纖維素酶、半纖維素酶為水解酶制劑，利用雙酶協(xié)同降解玉米芯定向制備還原糖，通過單因素試驗(yàn)探究雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)、酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間等因素對(duì)玉米芯還原糖含量的影響，并通過響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定玉米芯最佳酶解工藝為雙酶配比(m纖維素酶∶m半纖維素酶)13∶2，酶添加量3.25%，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間5 h，此條件下得到的玉米芯酶解液還原糖含量為12.45 mg/mL。與陸步詩(shī)等[17]僅用纖維素酶降解玉米芯相比，采用復(fù)合酶法得到的還原糖產(chǎn)量更多，達(dá)到高效生產(chǎn)還原糖的目的。后續(xù)可利用霉菌等微生物將玉米芯酶解液進(jìn)一步發(fā)酵轉(zhuǎn)化為酒精，以進(jìn)一步提高其附加值。