菊花多糖對2型糖尿病大鼠的降血糖作用

趙凱迪 王秋丹 林長青

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，吉林 延吉 133000)

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)是菊科菊屬的多年生宿根草本植物，又名壽客、金英、延年、隱逸花。其主要活性成分為黃酮類化合物、多糖、揮發(fā)油類等，并具有抑菌、抗病毒、抗氧化、促進(jìn)膽固醇代謝等作用[1-2]。

植物多糖，又稱為植物多聚糖，一般分為中性多糖和酸性多糖?，F(xiàn)有研究已指出植物多糖具有抗氧化[3]、降血脂[4-5]、調(diào)節(jié)免疫功能[6-7]、抗腫瘤[8-9]、降血糖[5]、抑菌[3]等功效。植物多糖因其豐富的生物活性功能，現(xiàn)已被開發(fā)為多種保健食品[10]。但目前對于菊花多糖的報道多是集中在菊花多糖的提取工藝以及純化研究[11-12]，在功能性方面報道過菊花多糖抗氧化、抗腫瘤等[13-14]。

2型糖尿病(T2DM)已成為一種全球代謝性疾病，備受人們關(guān)注。據(jù)報道[15]，2019年中國糖尿病患者有1.164億人，全球超過4億成年人受到T2DM的影響，估計2040年將有超過6.4億成年人患上T2DM。

菊花富含多種營養(yǎng)活性成分，但對菊花多糖在治療糖尿病方面的報道較少，且都是對1型糖尿病的研究[16-17]。試驗旨在研究菊花多糖對2型糖尿病的降血糖作用及可能機制，為開發(fā)菊花成為新降血糖產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊花：延吉市同仁堂藥店；

雄性SD大鼠：SPF級，體重(250±20) g，長春億斯試驗動物中心；

鹽酸二甲雙胍片：北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司；

鏈脲佐菌素(STZ)：美國Sigma公司；

大鼠胰島素(INS)ELISA試劑盒：武漢博士德生物公司；

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平，以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)：南京建成生物工程研究所；

蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒：索萊寶公司；

核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、KELCH樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Keap1)、血紅素氧合酶(HO-1)：美國Cell Signaling Technology公司；

離心機：TDZ5-WS型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；

旋蒸冷凝器：CCA-1111-CE型，東京理化器械株式會社；

血糖儀：AG-605型，天津九安醫(yī)療電子股份有限公司；

電泳儀：Western Blot型，BIO-RAD Laboratories Inc.；

凝膠成像系統(tǒng)：BioSpectrum510型，美國UVP公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菊花多糖提取 將菊花烘干粉碎，過40目篩，參照梁艷妮等[18]的方法并稍作改動，料液比(m菊花粉∶V水)為1∶25 (g/mL)，提取時間2 h，提取溫度90 ℃，浸提2次，合并2次提取液，用85%乙醇醇沉24 h，Sevage法除蛋白，脫色，凍干成粉，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菊花多糖含量測定 采用王彥平等[19]的方法并稍作改動：將葡萄糖配制成不同濃度梯度，按苯酚硫酸法進(jìn)行操作，測定490 nm處不同濃度葡萄糖的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱量菊花多糖粉末3 mg，蒸餾水定容至10 mL，取1 mL，加入苯酚和濃硫酸，混合后室溫放置20 min，測定490 nm處的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算菊花多糖含量。

1.2.3 試驗動物分組及給藥 動物置于延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周，一次性大劑量腹腔注射STZ(30 mg/kg·BW)進(jìn)行造模，72 h 后空腹血糖值FBG高于16.7 mmol/L視為造模成功，試驗分為空白組、模型組、菊花多糖高劑量組(400 mg/kg)、菊花多糖低劑量組(200 mg/kg)，連續(xù)灌胃8周，正常組和模型組每天灌以等量的蒸餾水。試驗過程中，記錄大鼠攝食量、飲水量，每2周記錄所有大鼠的體重和FBG。

1.2.4 大鼠OGTT的測定 在給藥最后1周，大鼠隔夜禁食12 h，灌胃葡萄糖溶液，劑量為1 g/kg·BW，每隔30 min 測定大鼠血糖含量，共測定4個時間點。

1.2.5 大鼠INS、HOMA-IR的測定 Elisa法測定大鼠INS，按試劑盒說明進(jìn)行操作。按式(1)計算胰島素敏感性水平。

HOMA-IR=FBG×INS/22.5，

(1)

式中：

HOMA-IR——胰島素抵抗指數(shù)；

FBG——大鼠空腹血糖值，mmol/L；

INS——胰島素含量，μU/mL。

1.2.6 大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的測定 將血清取出放至室溫備用，依次按試劑盒說明書進(jìn)行操作，于510 nm 處測定各孔吸光值并進(jìn)行計算。

1.2.7 大鼠SOD、GSH、CAT、MDA的測定 將肝臟用0.1 mol/L Tris-HCl制備成組織勻漿，并按照說明書測定肝臟組織中SOD、GSH、CAT、MDA的活性。

1.2.8 Western Blot法測定相關(guān)蛋白 用RIPA強裂解液提取肝臟組織蛋白，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，用PBS進(jìn)行稀釋，將質(zhì)量濃度調(diào)整為1.5 μg/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)目標(biāo)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，電壓100 V，電泳時間120 min，電泳結(jié)束后以100 V，60 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，之后于5%的脫脂奶粉中封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯影并拍照。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所得的數(shù)據(jù)以圖表和均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。P<0.05表示有顯著性差異，P>0.05表示無顯著性差異即無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花多糖含量

圖1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液吸光度及標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=11.247x-0.007 7，R2=0.995 1。由此算出菊花多糖含量為89.67%。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 菊花多糖對T2DM大鼠體重、攝食量、飲水量的影響

T2DM大鼠的典型特征為“三多一少”，即攝食多、飲水多、尿量多、體重下降。由表1可知，模型組大鼠體重最低，顯著低于其他各組(P<0.05)，經(jīng)菊花多糖灌胃后，能夠緩解T2DM大鼠體重的下降，模型組大鼠的攝食量和飲水量顯著高于其他各組(P<0.05)，經(jīng)菊花多糖灌胃后，能夠顯著減少其攝食量和飲水量(P<0.05)。這可能由于菊花多糖對T2DM大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)生了影響，從而影響其體重、攝食量和飲水量。由此可見，菊花多糖能夠有效改善糖尿病大鼠三多一少的癥狀。

表1 菊花多糖對大鼠體重、攝食量、飲水量的影響?

2.3 菊花多糖對T2DM大鼠FBG及OGTT的影響

由圖2可知，經(jīng)過8周的菊花多糖灌胃后，T2DM大鼠的FBG顯著下降，與模型組有極顯著差異(P<0.01)，且菊花多糖高劑量組效果更好，與陽性組效果相當(dāng)。OGTT試驗測定了大鼠在灌胃葡萄糖后0，30，60，90 min時的血糖水平，由圖3可知，經(jīng)過菊花多糖灌胃后，能夠提高T2DM大鼠的糖耐量，且高劑量組糖耐量極顯著好于模型組(P<0.01)。經(jīng)菊花多糖灌胃后，可能對T2DM大鼠體內(nèi)對葡萄糖的攝取及利用起到了調(diào)節(jié)作用，從而降低了其FBG水平，提高了機體的OGTT水平。菊花多糖顯示出較好的降低T2DM大鼠FBG以及提高OGTT水平的作用。吳建中等[20]和張露等[21]指出，番石榴多糖具有顯著的降血糖效果?？梢?，植物多糖具有很好的降血糖功效。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

2.4 菊花多糖對T2DM大鼠胰島素INS及HOMA-IR的影響

胰島素水平以及胰島素抵抗指數(shù)能夠反映T2DM大鼠的患病情況。如圖4所示，與模型組相比，經(jīng)過菊花多糖灌胃后的T2DM大鼠胰島素水平得到顯著降低(P<0.05)，胰島素抵抗指數(shù)也顯著降低，且呈劑量依賴性，與陽性組效果相當(dāng)。經(jīng)菊花多糖灌胃后T2DM大鼠體內(nèi)的INS以及HOMA-IR水平下降，可能是由于菊花多糖在T2DM大鼠體內(nèi)修復(fù)了胰島β細(xì)胞，減輕了糖尿病對胰島細(xì)胞的損傷，同時改善了機體對胰島素的敏感性。菊花多糖顯示出較好的降低INS以及HOMA-IR水平的作用。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

2.5 菊花多糖對T2DM大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響

由表2可知，模型組各指標(biāo)均與正常組有顯著性差異(P<0.05)，經(jīng)菊花多糖治療后能夠顯著改善TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平(P<0.05)。這可能由于菊花多糖經(jīng)體內(nèi)吸收后參與了T2DM大鼠的脂代謝并發(fā)揮了作用。Chen等[22]的研究指出牛蒡多糖能夠改善T2DM大鼠的異常脂代謝，與試驗結(jié)果一致。更加證實菊花多糖能夠改善T2DM大鼠異常脂代謝情況。

表2 菊花多糖對T2DM大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響?

2.6 菊花多糖對T2DM大鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影響

由圖5可知，模型組均與正常組存在顯著性差異(P<0.05)，經(jīng)菊花多糖治療后能夠顯著提高SOD、GSH、CAT水平(P<0.05)，并能顯著降低MDA水平(P<0.05)。唐潔[23]研究指出，植物多糖可通過促進(jìn)抗氧化酶的表達(dá)從而抑制機體的脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，與試驗結(jié)果一致。由此可見，菊花多糖能夠改善T2DM大鼠機體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

2.7 菊花多糖對T2DM大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響

如圖6所示，模型組中HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著低于正常組(P<0.05)，Keap1蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組(P<0.05)，經(jīng)菊花多糖治療后的T2DM大鼠HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著提高(P<0.05)，并顯著降低了Keap1蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。但在HO-1和Nrf2蛋白的表達(dá)水平上，低劑量組效果好于高劑量組，可能是由于高劑量組的菊花多糖在吸收過程中，在體內(nèi)各種酶的作用下發(fā)生了更多的代謝，使得其作用到靶蛋白上的有效物質(zhì)減少，從而導(dǎo)致HO-1和Nrf2蛋白的表達(dá)效果不如菊花多糖低劑量組。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，水蛭多糖能夠通過調(diào)控Nrf2/HO-1通路發(fā)揮治療糖尿病的作用。Elango等[25]介紹了Nrf2/Keap1信號通路在糖尿病中的作用，認(rèn)為該信號通路在保護細(xì)胞的過程中起到關(guān)鍵作用，且貫穿于糖尿病的整個發(fā)展過程。由此推測，菊花多糖能夠通過調(diào)控Nrf2/Keap1/HO-1通路起到治療T2DM的作用。

#與正常組相比差異顯著(P<0.05)，##與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；*與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**與模型組相比差異極顯著(P<0.01)

3 結(jié)論

菊花多糖能夠在動物水平改善T2DM大鼠胰島素抵抗的狀況，降低FBG水平，改善T2DM大鼠異常脂代謝情況和氧化應(yīng)激水平，并通過調(diào)控Nrf2/Keap1/HO-1通路起到降低T2DM大鼠血糖的作用，彌補了菊花多糖在T2DM上的空白。但該試驗中僅提取了菊花粗多糖，且對大鼠只做了脂代謝基礎(chǔ)指標(biāo)的測定，以及多種氧化酶和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白，未進(jìn)一步分析其多糖組分以及其對降低T2DM大鼠的其他可能機制，后續(xù)將對菊花多糖進(jìn)行組分分離，并對其在動物以及細(xì)胞水平進(jìn)行進(jìn)一步研究。