食品(飲料)加工車間機(jī)載微流控霉菌檢測(cè)裝置

趙中營(yíng) 徐佩鋒 嚴(yán) 方

(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400)

霉菌是自然界分布極其廣泛的真菌，其孢子直徑一般為2～10 μm，可借助于空氣流動(dòng)散播到較遠(yuǎn)的地方。霉菌孢子的繁殖能力極強(qiáng)，在適宜的環(huán)境條件下可大量生長(zhǎng)繁殖，污染環(huán)境，引起傳染。食品(飲料)加工車間一旦污染霉菌，在水分活性、溫度、濕度等適宜條件下，會(huì)快速生長(zhǎng)繁殖導(dǎo)致食物變質(zhì)，甚至產(chǎn)生毒性。食品生產(chǎn)企業(yè)由于空氣污染到食品出現(xiàn)菌落總數(shù)超標(biāo)等問題不是個(gè)別現(xiàn)象，面對(duì)越來越嚴(yán)格的國(guó)標(biāo)，越來越多的食品企業(yè)開始注重車間內(nèi)空氣中霉菌孢子數(shù)的控制。在食品(飲料)加工車間空氣中快速檢測(cè)霉菌，有助于快速切斷霉菌的源頭以及傳播途徑，并且針對(duì)性地進(jìn)行霉菌防范處置。

單一的微生物檢測(cè)技術(shù)采用的是菌落直接沉降法[1]，在車間選擇取樣點(diǎn)通過采集沉降菌進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方式測(cè)定生產(chǎn)環(huán)境中的污染程度，該方法需要專業(yè)的技術(shù)人員及相應(yīng)的培養(yǎng)條件。隨著光學(xué)傳感技術(shù)的發(fā)展，可以利用粒子在光照下成像的原理實(shí)現(xiàn)對(duì)空氣中霉菌孢子的采集，從而判斷環(huán)境污染程度，但光學(xué)成像后專業(yè)圖像辨識(shí)技術(shù)對(duì)空氣中微顆粒的有效分類比較復(fù)雜，受到顆粒疊加、光學(xué)陰影等因素干擾，影響了霉菌孢子污染數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[2-3]。在倉(cāng)儲(chǔ)等領(lǐng)域一定濃度的霉菌孢子的檢測(cè)，可以通過CO2濃度等關(guān)聯(lián)性參數(shù)測(cè)量獲取[4]，但此類檢測(cè)方法需要霉菌達(dá)到足夠的濃度。采用分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)可以檢測(cè)到非常微量真菌數(shù)量，可達(dá)10 個(gè)/mL[5]，但需要對(duì)特定基因以及特異性引物進(jìn)行針對(duì)性選擇與設(shè)計(jì)。

微流控是一種廣泛應(yīng)用于微量微顆粒檢測(cè)的技術(shù)[6-8]，可以在空氣中捕獲微量的霉菌孢子，微流控芯片通過專業(yè)的動(dòng)力學(xué)設(shè)計(jì)，可以將空氣中的微顆粒進(jìn)行分離，從而針對(duì)粒徑為2～10 μm的霉菌進(jìn)行富集；室內(nèi)無(wú)人機(jī)因?yàn)槠潇`活機(jī)動(dòng)性能，在室內(nèi)巡邏、倉(cāng)儲(chǔ)盤點(diǎn)等方面有著廣泛應(yīng)用。研究擬采用室內(nèi)無(wú)人機(jī)加載微流控芯片檢測(cè)食品(飲料)加工車間空氣中的霉菌孢子，以期為食品(飲料)加工車間有效監(jiān)測(cè)并防控霉菌孢子污染提供一個(gè)新的途徑。

1 霉菌孢子捕捉裝置

傳統(tǒng)的孢子捕捉裝置直接將霉菌孢子富集在載玻片上，再通過顯微鏡對(duì)富集后的微顆粒進(jìn)行辨識(shí)。這種辨識(shí)一方面需要非常專業(yè)的知識(shí)，另一方面載玻片上各種微顆粒的疊加情況較為嚴(yán)重，即便是顯微鏡下也難以分辨。食品(飲料)加工車間的空氣中霉菌孢子數(shù)量較少，而微流控的孔徑也是非常小，因此直接用微通道采集空氣中的孢子非常困難，要想快速捕捉到霉菌孢子，就需要在微流控芯片入口處設(shè)計(jì)一個(gè)霉菌孢子捕捉裝置，其基本原理是通過微正壓形成孢子捕捉區(qū)域的空氣微循環(huán)，再利用微流控芯片的負(fù)壓風(fēng)機(jī)提高捕捉空氣中霉菌孢子的概率。通過負(fù)壓風(fēng)機(jī)強(qiáng)制監(jiān)視空間的空氣流動(dòng)，可以增加孢子在捕捉口出現(xiàn)的概率，而且根據(jù)空氣動(dòng)力學(xué)原理，強(qiáng)制流動(dòng)可以引起循環(huán)空氣氣流多次縮放，使得捕捉室內(nèi)循環(huán)空氣中的水汽凝結(jié)與汽化現(xiàn)象比不流通空氣更為顯著，從而增強(qiáng)水汽凝結(jié)后的微顆粒聚集作用，增加空氣中微顆粒在空氣中的駐留時(shí)間，提高捕捉室內(nèi)的微顆粒密度。

圖1為機(jī)載霉菌孢子捕捉裝置，通過通流負(fù)壓風(fēng)機(jī)形成監(jiān)測(cè)區(qū)域空氣循環(huán)?？諝獾难h(huán)為空氣中的孢子以及其他微顆粒帶來摩擦力，從而形成對(duì)孢子與其他微顆粒的牽引力，使空氣中的孢子隨著空氣在捕捉通道內(nèi)循環(huán)流動(dòng)。空氣在捕捉窗、捕捉孔、縮放孔、通流孔等區(qū)域縮放，會(huì)增加空氣中的水汽凝結(jié)與汽化現(xiàn)象發(fā)生概率，從而增加微顆粒在空氣中隨空氣流動(dòng)的阻尼，當(dāng)阻尼大于孢子和其他微顆粒的牽引力，會(huì)使孢子或其他微顆粒減速，增加孢子在采集裝置中的停留時(shí)間。采集裝置從前后左右下側(cè)收集周邊空氣，從上側(cè)排出空氣，無(wú)人機(jī)機(jī)翼又使排出空氣向下流動(dòng)，這樣可以形成采集區(qū)域的空氣循環(huán)。

1. 通流負(fù)壓風(fēng)機(jī) 2. 微流負(fù)壓風(fēng)機(jī) 3. 富集窗 4. 微流控芯片 5. 鞘流壓縮空氣泵 6. 富集孔 7. 縮放孔 8. 通流孔 9. 殼體

微流控芯片的微通道為100 μm(高)×500 μm(寬)，微顆粒通過微流負(fù)壓風(fēng)機(jī)進(jìn)入通道形成霉菌孢子的空氣流，在分離區(qū)通過鞘流壓縮空氣泵進(jìn)行微顆粒分離。微流負(fù)壓風(fēng)機(jī)與鞘流壓縮空氣泵轉(zhuǎn)速對(duì)于霉菌孢子的富集與分離具有一定影響，需要結(jié)合通道長(zhǎng)度、微顆粒種類等進(jìn)行設(shè)置。

2 微流控芯片

參照Xu等[9]設(shè)計(jì)的一種針對(duì)2～10 μm的霉菌進(jìn)行富集的微流控芯片(如圖2所示)設(shè)計(jì)富集微流控芯片。其前端為采集管，通過微流負(fù)壓風(fēng)機(jī)使霉菌孢子在微管道以V0的流速移動(dòng)。在微流控芯片中部設(shè)計(jì)有一個(gè)鞘流壓縮空氣泵，形成鞘流，用于偏轉(zhuǎn)微顆粒，分離出霉菌孢子。分離富集邊緣采用流型設(shè)計(jì)，微粒子在鞘流作用下發(fā)生不同的偏轉(zhuǎn)，如圖4所示富集在不同的區(qū)域。

1. 采集口 2. 加速通道 3. 本體 4. 富集與分類區(qū) 5. 微流負(fù)壓風(fēng)機(jī)口 6. 鞘流通道 7. 鞘流壓縮空氣泵入口

有研究[10]表明，室內(nèi)氣溶膠在2.79～10.00 μm的微顆粒數(shù)量較少，在2 μm以下的微顆粒數(shù)量較多。在嚴(yán)格控制氣溶膠的食品(飲料)加工車間，2.79～10.00 μm的微顆粒數(shù)量更少。空氣中的微顆粒大致分為兩類：密度較大的灰塵顆粒和相對(duì)密度較小的孢子顆粒。而微流控芯片可分離出2.79～10.00 μm的灰塵顆粒(Ⅰ類顆粒)，2.79～10.00 μm的霉菌孢子顆粒(Ⅱ類顆粒)，2.79 μm以下的灰塵顆粒和霉菌孢子顆粒(Ⅲ類顆粒)，10.00 μm以上的灰塵顆粒(Ⅳ類顆粒)，以及10 μm以上的孢子顆粒(Ⅴ類顆粒)。

微流控芯片加速通道的靜摩擦系數(shù)較小，氣流對(duì)微顆粒的牽引力足以克服其摩擦力，當(dāng)加速通道足夠長(zhǎng)時(shí)，在微流負(fù)壓風(fēng)機(jī)作用下氣溶膠各微顆粒在加速通道出口的初速度(V0)與氣流速度一致。富集區(qū)域靜摩擦系數(shù)較大，當(dāng)顆粒進(jìn)入富集區(qū)域后其所承受的摩擦力大于氣流的索引力時(shí)，便沉降富集在富集區(qū)域。

微流控芯片對(duì)微顆粒進(jìn)行篩選的基本原理見圖3(a)和圖3(b)，微顆粒在通道中的受力見圖3(c)。在鞘流的作用下，微顆粒體積越大所獲得的縱向速度Vy越大，質(zhì)量越大摩擦力越大，而微流負(fù)壓風(fēng)機(jī)作用下的氣溶膠各微顆粒初速度V0是一致的。根據(jù)式(1)在富集區(qū)不同粒徑微顆粒的垂直位移Sy有差異。直徑大的微顆粒在FD的作用下，垂直位移Sy較大，直徑小的Sy較小。質(zhì)量大的微顆粒承受的阻力大，橫向速度下降快，其富集區(qū)域離出口近，質(zhì)量小的離富集區(qū)域出口遠(yuǎn)。根據(jù)受力分析5類氣溶膠顆粒出現(xiàn)較大概率的富集區(qū)域如圖4所示。

圖3 微顆粒在微流控芯片中受力分析

圖4 不同顆粒的大概率富集區(qū)域示意圖

Sy=LJGVy/V0，

(1)

式中：

Sy——微顆粒的垂直位移，μm；

LJG——通道x軸行程，μm；

V0——?dú)馊苣z各微顆粒初速度，μm/s；

Vy——鞘流作用下微顆粒y軸速度分量，μm/s。

3 機(jī)載微流控霉菌檢測(cè)裝置在食品(飲料)加工車間檢測(cè)效果

3.1 檢測(cè)方案設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用微型無(wú)人機(jī)作為霉菌孢子捕捉裝置的載體，微型無(wú)人機(jī)對(duì)采集區(qū)域的氣流擾動(dòng)較小，同時(shí)圖1所設(shè)計(jì)的負(fù)壓捕捉裝置在一定程度上減弱了微型無(wú)人機(jī)的氣流擾動(dòng)影響。試驗(yàn)樣本霉菌孢子是2020年4月由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)獲得，試驗(yàn)利用氣溶膠發(fā)生器可將孢子樣本制作成氣溶膠粒子，均勻釋放在單位體積為1，10，100 L的容器中，獲不同濃度的樣本。分別取105，104，103個(gè)/mL的樣本，在無(wú)人機(jī)檢測(cè)過程中噴制時(shí)間為10 s，允許自然沉降，噴制在無(wú)人機(jī)采集點(diǎn)的上方，分別采用傳統(tǒng)的落板法和微流控采集法進(jìn)行霉菌氣溶膠采集，富集時(shí)間均設(shè)定為20 min，富集后的載玻片和微流芯片均采用光學(xué)顯微鏡觀察成像，采用顯微圖像法計(jì)算獲得平均孢子濃度。

3.2 結(jié)果與分析

不同濃度下微流控法的霉菌孢子富集圖片在光學(xué)顯微鏡下的成像如圖5所示。105，104，103個(gè)/mL試驗(yàn)環(huán)境下微流控法收集的霉菌孢子分別為367，73，19個(gè)，而采用傳統(tǒng)落板法的分別為63，22，0個(gè)。從試驗(yàn)結(jié)果來看，采用無(wú)人機(jī)機(jī)載微流控芯片可以快速收集到空氣中游離的霉菌孢子，在光學(xué)顯微鏡下收集到的孢子數(shù)量隨著濃度的增加而增加，但試驗(yàn)結(jié)果雖然反映出孢子濃度的大小趨勢(shì)，但并未建立嚴(yán)格的線性關(guān)系(見圖6)。這種非線性關(guān)系現(xiàn)象一方面與微流控芯片微通道自身的采集概率相關(guān)[8]，同時(shí)在一定程度上受到無(wú)人機(jī)對(duì)采集區(qū)域氣流的擾動(dòng)影響。

圖5 霉菌孢子富集后光學(xué)顯微成像

4 霉菌孢子的圖像分析與數(shù)量統(tǒng)計(jì)算法

4.1 圖像灰度計(jì)算

Canny邊緣檢測(cè)算子是John F. Canny于1986年提出的。經(jīng)典Canny算法用了4個(gè)梯度算子來分別計(jì)算水平，常用的邊緣差分算子有Rober、Prewitt、Sobel。使用Canny算法前先要將圖6按式(2)進(jìn)行灰度化。

圖6 霉菌孢子噴灑濃度與檢測(cè)數(shù)非線性關(guān)系

Gr(x,y)=0.229R(x,y)+0.587G(x,y)+0.114B(x,y)，

(2)

式中：

Gr(x,y)——待求像素點(diǎn)(x,y)的灰度值；

R(x,y)——待求像素點(diǎn)(x,y)的顏色值R分量；

G(x,y)——待求像素點(diǎn)(x,y)的顏色值G分量；

B(x,y)——待求像素點(diǎn)(x,y)的顏色值B分量。

4.2 Canny算子低通濾波與邊緣特征計(jì)算

對(duì)灰度圖像Gr(x,y)進(jìn)行卷積低通濾波，濾波函數(shù)選取Gs(x,y):

(3)

Canny算子通過應(yīng)用高斯函數(shù)Gs(x,y)對(duì)灰度圖像進(jìn)行卷積低通濾波，形成式(4)。

f(x,y)=Gs(x,y)*Gr(x,y)，

(4)

式中：

*——卷積。

使用一階有限差分[式(5)、式(6)]近似計(jì)算x與y偏導(dǎo)數(shù)的兩個(gè)陣列。

(5)

(6)

再通過x與y偏導(dǎo)數(shù)的兩個(gè)陣列計(jì)算圖像的邊緣梯度幅值和邊緣的發(fā)展方向值，用于圖像邊緣提取的特征判據(jù)，分別用M(x,y)、θ(x,y)表達(dá)。

(7)

(8)

4.3 Canny算子的簡(jiǎn)化計(jì)算與邊緣特征提取

為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化計(jì)算，也可以根據(jù)式(9)、式(10)近似計(jì)算圖像的邊緣梯度幅值和邊緣的發(fā)展方向值M(x,y)、θ(x,y)。

(9)

(10)

進(jìn)一步對(duì)M(x,y)進(jìn)行非極大值抑制，用雙閾值算法檢測(cè)和連接邊緣。檢測(cè)效果如圖7所示，對(duì)照?qǐng)D5可以發(fā)現(xiàn)所提取的霉菌孢子數(shù)量要與實(shí)際的霉菌孢子數(shù)量基本接近，尤其是圖7(b)、圖7(c)十分顯著，但個(gè)別孢子形狀也變小了。從圖7的實(shí)際處理效果來看，孢子在疊加的情形下，如圖7(b)、圖5(b)所示，難以通過圖像邊緣分割后獲得準(zhǔn)確的孢子數(shù)量。通過圖7與圖5的對(duì)比，在Canny算子邊緣檢測(cè)過程中，孢子辨識(shí)的直徑總體趨于直徑變小，變小的比例與孢子成像的邊緣特征相關(guān)，因此需要對(duì)Canny算子進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以確保圖像辨識(shí)的保真度。

圖7 Canny算法檢測(cè)效果

5 結(jié)論

采用霉菌孢子前端采集裝置和微流控富集裝置，可以快速采集到食品(飲料)加工車間噴灑的霉菌孢子，試驗(yàn)最小的測(cè)試濃度為103個(gè)/mL，所收集到的孢子數(shù)量為19個(gè)，而傳統(tǒng)的落板法測(cè)量不到。在試驗(yàn)過程中，機(jī)載微流控霉菌孢子檢測(cè)裝置所采檢測(cè)到的孢子數(shù)量可以反映噴灑在空氣中的霉菌孢子濃度增長(zhǎng)趨勢(shì)，但并未建立線性關(guān)系，其測(cè)量的非線性一方面受到霉菌孢子在空氣中的擴(kuò)散速度和噴灑方式影響，另一方面也與無(wú)人機(jī)機(jī)翼氣流的擾動(dòng)有一定關(guān)系。同樣傳統(tǒng)的落板法所采檢測(cè)到的孢子數(shù)量與噴灑在空氣中的霉菌孢子濃度也不存在很顯著的線性關(guān)系。采用機(jī)載無(wú)人機(jī)在空氣中檢測(cè)食品(飲料)生產(chǎn)車間霉菌污染，不僅可行，并且操作非常簡(jiǎn)單，實(shí)施成本也非常低，是一種值得進(jìn)一步研究的檢測(cè)方式。后續(xù)將進(jìn)一步研究無(wú)人機(jī)的飛行路徑對(duì)孢子濃度檢測(cè)的影響、霉菌孢子的圖像辨識(shí)計(jì)數(shù)等。