細(xì)胞自噬調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在肺纖維化中的作用機(jī)制

胡琴 張晨曦 柯少瑞

河南中醫(yī)藥大學(xué)1呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，2河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3中醫(yī)藥科學(xué)院，4藥學(xué)院（鄭州450046）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是以肺實(shí)質(zhì)纖維化和肺功能喪失為特征進(jìn)行的最終致死性疾?。?］。歐美數(shù)據(jù)顯示，70 歲以上老年人患IPF 風(fēng)險(xiǎn)是40 歲以上人群的6.9 倍［2-3］，在2000年至2008年，IPF 的發(fā)病率增加了35%，累計(jì)患病率從13.4/10 萬上升到18.2/10 萬［4-5］。肺泡上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是IPF 發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［6-7］。臨床研究證實(shí)IPF 患者肺組織內(nèi)存在肺泡上皮細(xì)胞EMT 異?；钴S的現(xiàn)象，肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT 轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)病程發(fā)展［8］。目前，IPF 的治療原則主要集中在抗纖維化、抗炎、抗氧化等方面，主要治療藥物有吡非尼酮、尼達(dá)尼布、糖皮質(zhì)激素、N-乙酰半胱氨酸等［9］，但均存在較多副作用。因此，亟需加強(qiáng)IPF 分子病理機(jī)制研究，為其有效防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究表明，自噬與IPF 的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［10-11］。LI 等［12］實(shí)驗(yàn)表明，瑞格非尼通過TGF-β1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞自噬，抑制肌成纖維細(xì)胞的活化和EMT 的產(chǎn)生，從而緩解肺纖維化。TENG 等［13］在TGF-β1 刺激的肝星形細(xì)胞中熊去氧膽酸通過下調(diào)線粒體自噬的表達(dá)抑制肝纖維化。由此可推測細(xì)胞自噬與EMT在IPF 進(jìn)程及治療中具有重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)利用TGF-β1 誘導(dǎo)人源肺泡上皮細(xì)胞A549 建立纖維化模型，觀察肺上皮細(xì)胞EMT 及自噬水平的改變，并通過使用雷帕霉素（rapamycin，RAPA）促進(jìn)自噬，觀察其對(duì)A549 細(xì)胞EMT 的影響，探討自噬對(duì)A549 細(xì)胞EMT 的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步闡明IPF 的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑人源肺泡上皮細(xì)胞A549，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA 消化液、PBS 緩沖液（Biological Industries 公司，南美）；自噬激動(dòng)劑RAPA（MedChemExpress 公司，美國）；RIPA裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；PAGE 凝膠制備試劑盒、彩色預(yù)染蛋白Marker（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司）；GAPDH、Beclin1、E-cadherin（E-cad）、N-cadherin（N-cad）、Fibronectin（FN1）抗體，山羊抗鼠、抗兔二抗，免疫熒光二抗（武漢Proteintech 公司）；LC3 抗體（GeneTex 公司，美國）；p62 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；4%多聚甲醛、QuickBlock免疫染色封閉液、免疫染色通透液（Triton X-100）等試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 建立TGF-β1 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞模型A549細(xì)胞用含10%胎牛血清和1% 青/鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)30%左右，更換為無血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)2 h，分別以2.5、5、7.5、10、15 ng/mL 的TGF-β1 刺激細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后觀察細(xì)胞形態(tài)，利用CCK8 檢測24、48 h細(xì)胞活力，Western blot 檢測EMT 相關(guān)蛋白E-cad、N-cad 及自噬相關(guān)蛋白Beclin1、p62 的表達(dá)，篩選出細(xì)胞形態(tài)較好、無細(xì)胞毒性、蛋白表達(dá)變化明顯的誘導(dǎo)濃度及時(shí)間，最終以5 ng/mL TGF-β1刺激A549細(xì)胞48 h建立肺纖維化體外模型。模型建立后，選用10 nmol/L RAPA觀察自噬對(duì)A549細(xì)胞EMT的影響，將A549 分為空白組（control）、模型組（5 ng/mL TGF-β1）、RAPA組（10 nmol/L）、TGF-β1+RAPA（5 ng/mL TGF-β1+10 nmol/L RAPA）組，培養(yǎng)48 h 后，進(jìn)行檢測。

1.3 細(xì)胞活力檢測A549 細(xì)胞接種于96 孔板中，每組設(shè)立6 個(gè)復(fù)孔，孵育24 h，給予不同濃度TGFβ1 分別處理24、48 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8溶液混勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，在450 nm 處檢測各組吸光值，計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)活力。細(xì)胞活力（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值×100%。

1.4 TEM 的檢測細(xì)胞收集后置于2.5%的戊二醛中固定24 h 后，用PBS 洗滌3 次。細(xì)胞沉淀在25 ℃下用1%鋨酸進(jìn)行后固定2 h，再次用PBS 洗滌三次，然后在0%、50%、70%、80%、95%、100%梯度乙醇溶液中脫水，每個(gè)梯度處理15 min，再用100%丙酮脫水處理2 次。用100%環(huán)氧樹脂浸潤細(xì)胞沉淀10 min，重復(fù)3 次，再用1∶1（Epon812：丙酮）緩慢搖晃滲透2 h 以上，Epon812 中浸潤24 h 以上。將樣品轉(zhuǎn)移至包埋槽之中，加入適量的Epon812，置于60 ℃的烘箱中處理48 h 以上。超薄切片機(jī)將樣品切成超薄切片（40 ～70 nm），用1%乙酸雙氧鈾和0.1%檸檬酸鉛染色各30 min，并在透射電鏡下（Tecnai G220 S-Twin 美國）觀察并拍照。

1.5 Western blot收集不同處理組細(xì)胞后，使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整各組蛋白濃度，使各組蛋白濃度一致，蛋白變性后每孔加入20 μg 蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，隨后進(jìn)行封閉，TBST 洗滌3 次。加入稀釋好的一抗，GAPDH 抗體（1∶5 000）、Beclin1 抗體（1∶5 000）、p62 抗體（1∶1 000）、E-cad 抗體（1∶5 000）、N-cad 抗體（1∶5 000），置于4 ℃過夜。次日棄一抗，TBST 洗3 次；加入二抗，室溫孵育1 h，棄二抗，TBST 洗3 次，滴加ECL 發(fā)光液，使用超高靈敏化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并保存結(jié)果圖片，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.6 免疫熒光檢測A549 接種于24 孔板細(xì)胞爬片中，RAPA 預(yù)處理2 h，TGF-β1 刺激48 h 后用PBS洗滌2 次，4%多聚甲醛固定20 min 后，PBS 洗滌2 次。每孔滴加500 μL 通透液（Triton X-100），室溫通透10 min 后，PBS 洗滌2 次。每孔加入500 μL免疫染色封閉液，室溫封閉2 h 后，PBS 洗滌3 次。加入兔抗LC3 和鼠抗FN1 抗體（1∶500），混勻之后加入孔中，4 ℃過夜后，PBS 洗滌4 次，5 min/次。加入免疫熒光二抗（1∶300），室溫孵育1 h，PBS 洗滌4 次，5 min/次。滴加適量抗熒光淬滅封片液（含DAPI）至載玻片上，取出細(xì)胞爬片倒扣于載玻片，用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用IBM SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)；多組間差異比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 對(duì)A549 細(xì)胞形態(tài)及活力的影響利用不同濃度的TGF-β1（0、2.5、5、7.5、10、15 ng/mL）分別作用于A549 細(xì)胞。誘導(dǎo)48 h 后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，見圖1A-F，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，呈不規(guī)則多邊形；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?，形態(tài)發(fā)生顯著性變化。CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，TGF-β1誘導(dǎo)24、48 h后對(duì)A549細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性作用（P＞0.05，圖1 G、H）。

圖1 不同濃度TGF-β1 對(duì)A549 細(xì)胞形態(tài)及活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of TGF-β1 on morphology and viability of A549 cells

2.2 TGF-β1 對(duì)自噬和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響檢測經(jīng)TGF-β1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞48 h 后EMT 標(biāo)志物E-cad 和N-cad，自噬標(biāo)志物Beclin1 和p62的相對(duì)蛋白表達(dá)水平。見圖2，與對(duì)照組相比，經(jīng)TGF-β1 濃度梯度誘導(dǎo)后，Beclin1、E-cad 的蛋白表達(dá)下調(diào)，p62、N-cad 的蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。最終選擇5 ng/mL TGF-β1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞48 h 作為最佳作用濃度和時(shí)間，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖2 不同濃度TGF-β1 對(duì)自噬和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of TGF-β1 on autophagy and EMT-related protein expression

2.3 TGF-β1 對(duì)A549 細(xì)胞自噬的影響TEM 觀測5 ng/mL TGF-β1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞48 h 后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，見圖3，和對(duì)照組相比，TGF-β1 誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)向梭形轉(zhuǎn)變，發(fā)生顯著變化；對(duì)照組中細(xì)胞內(nèi)可以觀察到自噬溶酶體，而TGF-β1 誘導(dǎo)后自噬溶酶體數(shù)量顯著減少。

圖3 TEM 觀察TGF-β1 對(duì)A549 細(xì)胞自噬的影響Fig.3 TEM observation of the effect of TGF-β1 on autophagy of A549 cells

2.4 自噬激動(dòng)劑對(duì)自噬和EMT 蛋白表達(dá)的影響通過Western blot 檢測加入自噬激動(dòng)劑RAPA后自噬指標(biāo)（Beclin1、p62）和EMT相關(guān)指標(biāo)的變化。見圖4，與對(duì)照組相比，模型組中Beclin1、E-cad表達(dá)下調(diào)，p62、N-cad 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，RAPA+TGF-β1 組中，Beclin1、E-cad 表達(dá)上調(diào)，p62、N-cad 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。

圖4 自噬激動(dòng)劑對(duì)自噬和EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of autophagy agonists on the expression of autophagy and EMT-related proteins

2.5 免疫熒光檢測自噬激動(dòng)劑對(duì)LC3 和FN1 表達(dá)的影響通過免疫熒光的方法檢測各組細(xì)胞的LC3、Fibronectin 蛋白的表達(dá)水平，見圖5，與對(duì)照組相比，TGF-β1 組LC3 的表達(dá)水平明顯降低，而FN1 的表達(dá)明顯升高；加入自噬激動(dòng)劑后，與TGFβ1 相比，LC3 表達(dá)水平明顯上升，同時(shí)FN1 表達(dá)水平明顯降低。

圖5 免疫熒光檢測自噬激動(dòng)劑對(duì)LC3 和FN1 表達(dá)的影響（400×）Fig.5 Immunofluorescence detection of the effect of autophagy agonists on the expression of LC3 and FN1（400×）

3 討論

TGF-β1 是一種重要的促纖維化細(xì)胞因子，是器官纖維化的重要調(diào)控因子，可通過介導(dǎo)EMT、成纖維細(xì)胞活化、膠原沉積等過程加重肺纖維化［14］。本研究采用TGF-β1 對(duì)A549 細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則多邊形向梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞分散開來，呈現(xiàn)出EMT的典型表象。Western blot 結(jié)果也證實(shí)，模型組出現(xiàn)了上皮標(biāo)志物蛋白E-cad 下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物蛋白N-cad 上調(diào)，說明TGF-β1 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞的EMT模型是可行的、成功的而且相對(duì)穩(wěn)定。

EMT 是上皮細(xì)胞失去細(xì)胞-細(xì)胞黏附和頂端-基底極性的生物學(xué)過程，從而獲得遷移、侵襲和產(chǎn)生ECM 成分的間質(zhì)特征，導(dǎo)致底層基膜的降解［15］。臨床病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，IPF 患者肺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT 轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)病程的發(fā)展，EMT 已成為IPF 發(fā)病的重要機(jī)制之一。在特發(fā)性肺纖維化的人體組織樣本中，EMT主要信號(hào)通路標(biāo)記物在成纖維細(xì)胞病灶和受損的上皮細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)，為EMT 在人類病理學(xué)中發(fā)揮作用提供了間接證據(jù)［16-17］。研究證實(shí)，在IPF中，肺泡上皮細(xì)胞EMT 的發(fā)生涉及缺氧、蛋白磷酸化、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)失衡等多種因素。最近研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬可能是調(diào)控肺泡EMT 有效改善肺纖維化的另一條重要途徑，而關(guān)于細(xì)胞自噬和肺纖維化的分子機(jī)制研究卻鮮有報(bào)道。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)缺乏、生長因子剝奪、感染和缺氧等不同形式下應(yīng)激所做出的適應(yīng)性過程。自噬活性變化能夠影響神經(jīng)退行性病變、腫瘤和傳染性疾病等多種疾病的病理過程。SHI 等［18］發(fā)現(xiàn)IPF 患者miR199a-5p 通過靶向Sirt1/AMPK 信號(hào)通路調(diào)控自噬且通過調(diào)節(jié)自噬可誘導(dǎo)IPF 患者間充質(zhì)干細(xì)胞衰老；同時(shí)證實(shí)抑制miR199a-5p 可恢復(fù)間充質(zhì)干細(xì)胞活力，延緩小鼠肺纖維化進(jìn)程。此外，BAEK 等［19］發(fā)現(xiàn)亞精胺通過激活I(lǐng)PF 成纖維細(xì)胞和博來霉素誘導(dǎo)的纖維化肺組織中關(guān)鍵的自噬分子LC3-Ⅱ、Beclin-1 和ATG7 的表達(dá)來促進(jìn)自噬小體的形成，有助于緩解肺部纖維化。LC3 含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少呈正相關(guān)，與自噬程度呈正相關(guān)［20］。p62 是一種自噬降解底物蛋白，當(dāng)內(nèi)膜上的LC3-Ⅱ蛋白則被解離為LC3-Ⅰ并回到細(xì)胞質(zhì)再次被利用，p62 蛋白則被降解，其表達(dá)水平往往與自噬水平負(fù)相關(guān)［21］。Beclin1 是在自噬過程中與形成吞噬小體的起始有關(guān)，對(duì)自噬至關(guān)重要［22］。Western blot和免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞EMT 的過程中，Beclin1 和LC3 蛋白表達(dá)下調(diào)，而p62 蛋白表達(dá)顯著性增加，表明細(xì)胞自噬水平顯著降低；TEM 結(jié)果也證實(shí)，TGF-β1誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞的自噬水平下降。因此，進(jìn)一步深入研究細(xì)胞自噬在肺上皮細(xì)胞EMT 中的作用將有助于探索調(diào)控EMT 過程的新的分子生物學(xué)機(jī)制，為早期干預(yù)IPF 的形成提供靶點(diǎn)。

自噬激動(dòng)劑RAPA 在體內(nèi)與重組人FKBP12蛋白相結(jié)合產(chǎn)生復(fù)合物，該復(fù)合物能夠與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）相結(jié)合，并抑制mTOR 的活化，達(dá)到增強(qiáng)自噬的作用［23］。本研究選用RAPA 促進(jìn)細(xì)胞自噬，以觀察自噬對(duì)EMT 的影響。Western blot 與免疫熒光結(jié)果均顯示，與模型組相比，RAPA+TGF-β1 組提高了細(xì)胞的自噬水平，激活細(xì)胞自噬能顯著改善TGF-β1 誘導(dǎo)的EMT 現(xiàn)象，進(jìn)而緩解肺泡上皮細(xì)胞纖維化的發(fā)生。

綜上所述，肺泡上皮細(xì)胞A549 在TGF-β1 誘導(dǎo)下發(fā)生EMT，同時(shí)細(xì)胞自噬水平下降；利用RAPA提高細(xì)胞自噬水平可以抑制EMT 過程，表明提高細(xì)胞自噬水平可能對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的EMT 具有抑制作用，這為未來從自噬角度研發(fā)IPF 的防治藥物提供了理論依據(jù)。然而，細(xì)胞自噬在TGF-β1 誘導(dǎo)的A549 纖維化模型中的過程中發(fā)揮的具體作用及分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明，故需更多的細(xì)胞、動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步探索自噬與IPF 的作用關(guān)系。