“金三角”來源海洛因樣品的關(guān)聯(lián)性判別及來源推斷

段正萍，廉 潔，楊發(fā)震，李 虹，李 彬

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，昆明 650500；2.中國人民公安大學(xué)偵查與刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100038；3.玉溪市公安局，云南 玉溪 653100；4.毒品分析及禁毒技術(shù)公安部重點實驗室，昆明 650228；5.北京中天鋒安全技術(shù)防護有限公司，北京 100044）

海洛因，化學(xué)名稱“二乙酰嗎啡”，俗稱“白粉”，具有高度的成癮性，是最常被濫用的毒品之一。罌粟種植地域、海洛因非法生產(chǎn)工藝以及摻雜物等的不同，均會使海洛因在各方面表現(xiàn)出顯著差異，有利于進行其地理來源地、販運路徑等的推斷[1]。從20世紀70年代開始，毒品原產(chǎn)地判別及樣品間關(guān)聯(lián)性的分析一直是國際上毒品分析領(lǐng)域最關(guān)注的前沿和熱點。目前，關(guān)于海洛因溯源及關(guān)聯(lián)性的研究，有采用氣相色譜法（GC）[2-3]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC/MS-MS）[4-5]、超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF）[6]、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-MS/MS）[7-8]、毛細管凝膠電泳法（CE）[9]、紅外光譜法（IR）[10]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）[11-12]等技術(shù)手段，對海洛因的鹽型、純度以及樣品中的主要生物堿、摻雜物、微量雜質(zhì)、無機元素[13-14]等進行分析，結(jié)合統(tǒng)計、數(shù)字、圖形等多種計量分析方法[15-16]，判別來自“金三角”“金新月”等毒源地的海洛因樣品，建立海洛因數(shù)據(jù)庫，為禁毒執(zhí)法部門提供法律服務(wù)和戰(zhàn)略、戰(zhàn)術(shù)情報服務(wù)。

云南與“金三角”相毗鄰，是境外毒品走私入境滲透內(nèi)流的重要通道，也是受毒品危害的重災(zāi)區(qū)。通過云南邊境地區(qū)所破獲大宗毒品案件繳獲樣品，開展“金三角”來源毒品特征分析，為串并案件、深挖毒品犯罪提供科學(xué)依據(jù)，具有重要的現(xiàn)實意義。海洛因生產(chǎn)，即乙?；^程中乙酸酐與嗎啡、罌粟堿、去甲牢丹素等生物堿發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生雜質(zhì)成分，在不同非法生產(chǎn)廠或不同生產(chǎn)批次下，其具體量存在差異。公安部國家毒品實驗室經(jīng)過多年的研究積累，形成了海洛因的產(chǎn)地溯源及特征分析技術(shù)規(guī)范，在全國禁毒實戰(zhàn)中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，為一批批毒品案件的成功偵破提供了強有力的科學(xué)依據(jù)。Liu等[6,8,17]通過中性/酸性雜質(zhì)開展的海洛因溯源研究中對該方法的理論依據(jù)和參數(shù)依據(jù)進行了明確闡述。本研究主要參考該方法，應(yīng)用檢測靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定性好、檢測周期短的UPLC-MS/MS法，檢測海洛因樣品中普遍存在且穩(wěn)定性和顯著性較好的15種中性/酸性特征雜質(zhì)，結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計法對樣品數(shù)據(jù)進行分析，完成對“金三角”來源海洛因樣品的特征分析。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Acquity Ⅰ UPLC和 Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（美國Waters公司），HS-501水平振蕩器（德國IKA公司），XS105電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），H2050R臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀儀器有限公司），Dispensette?Organic有機型瓶口分液器（0.5～5 mL，德國普蘭德上海貿(mào)易有限公司），0.22 μm GHP雙相微孔濾膜（德國PALL公司）。

乙腈和甲醇（色譜級，美國Fisher Scientifi c公司），二氯甲烷（分析純，美國J.T.Baker公司），石油醚（分析純，低沸程30～60 ℃，美國J.T.Baker公司），濃硫酸（濃度大于等于98%，分析純，北京化工廠），甲酸銨鹽（分析純，瑞士Fluka公司），Milli-Q純水系統(tǒng)（美國密理博公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品

海洛因樣品為云南省邊境州市公安機關(guān)2019—2020年繳獲的千克以上毒品案件的樣品，共計489份。選取兩份特征雜質(zhì)典型的海洛因樣品，各稱取15 g研磨混勻后制備成一份具有代表性的對照樣品，用于UPLC-MS/MS系統(tǒng)檢查。

1.2.2 樣品前處理

稱取120 mg研磨混勻的海洛因樣品置于玻璃離心管中，加入2 mL稀硫酸溶液（0.25 mol/L）超聲溶解，再加入2.5 mL石油醚和二氯甲烷混合溶液（體積比為3∶2），水平振蕩30 min后離心5 min，取有機層自然揮干，取1 mL甲醇復(fù)溶后過0.22 μm微孔濾膜，供UPLC-MS/MS分析。對照樣品同上述步驟處理，空白樣品為甲醇溶液。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫：35 ℃，進樣室溫度：10 ℃。流動相A：10 mmol/L甲酸銨緩沖液，流動相B：乙腈。洗脫梯度程序：0～1 min，25% B；1～2 min，25%～33% B ；2～6 min，33% B ；6～8 min，33%～55% B ；8～8.5 min，55%～100% B ；8.5～10 min，100% B ；10～10.5 min，100%～25% B ；10.5～13 min，25% B。流速為0.4 mL/min，進樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子源（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；毛細管電壓3.50 kV；錐孔電壓20 V；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣流速1 000 L/h；錐孔氣150 L/h；碰撞氣：氬氣，流速0.12 mL/min；采集時間0～9.2 min；15種目標雜質(zhì)的質(zhì)譜采集參數(shù)和保留時間見表1。

表1 15種目標雜質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)和保留時間Table 1 Mass spectrometric parameters and retention time of the selected 15 target impurities from heroin samples

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理時，先對實驗樣品的峰面積進行歸一化和開平方處理后再進行Pearson相關(guān)性分析和主成分分析。對于樣品中未定性檢出的目標物，峰面積均以200計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法穩(wěn)定性評估

取對照樣品按1.2.2處理，單樣平行測定6次，一天進樣1次，連續(xù)4 d，進行日內(nèi)、日間穩(wěn)定性測試，以15種目標雜質(zhì)的相對標準偏差（RSD%）考察方法的穩(wěn)定性。結(jié)果日內(nèi)數(shù)據(jù)RSD在0.3%～9.3%之間，日間數(shù)據(jù)RSD在1.7%～10.9%之間。

2.2 Pearson相關(guān)性數(shù)學(xué)模型

挑選出103份案件信息明確的海洛因樣品構(gòu)建關(guān)聯(lián)性數(shù)學(xué)模型。“關(guān)聯(lián)”組包含25個樣品組，每組為2～5份海洛因樣品。另外，從單個樣品案件中挑選出明確不具有相關(guān)性的案件樣品37份。

參考Lociciro[18]、Durourdy[19]和樊穎鋒等[9]的研究，本文以15種中性/酸性目標雜質(zhì)參數(shù)計算模型樣品間的關(guān)聯(lián)系數(shù)（r）。實驗矩陣中可得到10 506個表示兩兩樣品間關(guān)聯(lián)性的有效數(shù)據(jù)，其中，表示25組樣品具有關(guān)聯(lián)性的有效數(shù)據(jù)有132個，無關(guān)聯(lián)性的有效數(shù)據(jù)有10 374個。以不同關(guān)聯(lián)系數(shù)的1-特異度（1-Spe）為橫坐標，靈敏度（Sen）為縱坐標，繪制ROC曲線，確定模型的關(guān)聯(lián)性閾值，圖1為ROC曲線圖。靈敏度為具有關(guān)聯(lián)性的樣品數(shù)據(jù)被正確檢出的百分率，特異度為無關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)被正確檢出的百分率。當(dāng)關(guān)聯(lián)系數(shù)取0.965時，Youden指數(shù)最大（為0.997），模型的靈敏度和特異度都較高。因此，實驗選定0.965為海洛因樣品的關(guān)聯(lián)性閾值，即當(dāng)r大于等于0.965時確定兩樣品間具有關(guān)聯(lián)性，小于0.965則表示兩樣品間不具有關(guān)聯(lián)性。

2.3 Pearson關(guān)聯(lián)性分析

依據(jù)上述模型分析489份“金三角”海洛因樣品間的關(guān)聯(lián)性。當(dāng)r大于等于0.965時，有433份與其他樣品具有關(guān)聯(lián)性的海洛因樣品，并從中篩選出了46個關(guān)聯(lián)性極強的樣品組，每組包含了2～22份海洛因樣品。其中，含有2～5份樣品的組有22個，含有6～10份樣品的組有17個，含有11～22份樣品的組有7個。

計算上述46個關(guān)聯(lián)組中各目標雜質(zhì)數(shù)據(jù)的平均值和RSD值，對關(guān)聯(lián)組進行分析，表2為其中某個關(guān)聯(lián)性組的數(shù)據(jù)及結(jié)果。各組內(nèi)目標雜質(zhì)數(shù)據(jù)RSD值均小于20%，表明該關(guān)聯(lián)性閾值能夠較好地區(qū)分實驗樣品間的關(guān)聯(lián)性，判別結(jié)果可靠。根據(jù)實驗結(jié)果，本文推測同一組份海洛因樣品的生產(chǎn)原料及工藝相同，為同一批次的相似度極高。其次，還發(fā)現(xiàn)氫化可他寧（T1）、O6,N-二乙酰嗎啡（T4）、N,O6-二乙?？纱颍═5）和4,6-二乙酰氧基-3-甲氧基-5-[2-(N-甲基-乙酰氨基)]乙基菲（T11）4種特征雜質(zhì)平均值組間差距較明顯，此結(jié)果對樣品來源推斷具有重要意義。

表2 某個關(guān)聯(lián)性組內(nèi)樣品各目標雜質(zhì)具體數(shù)據(jù)、平均值、SD和RSD值Table 2 The average, SD and RSD values of each target impurity in a certain correlativity group

2.4 主成分分析

主成分分析（PCA）為多元統(tǒng)計中的一種數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，其優(yōu)點在于可消除評價指標間的相關(guān)影響，能保證評價的客觀性[20]。采用PCA將樣品中15種目標雜質(zhì)變量參數(shù)降維，提取出2個主成分，PC1和PC2累計貢獻率達76.478%，圖2為碎石圖。

根據(jù)圖3海洛因樣品的PCA分布圖中不同樣品的主成分得分及分布聚集情況，將樣品數(shù)據(jù)初步劃分在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個區(qū)域內(nèi)。如分布在Ⅰ區(qū)域的樣品主成分得分范圍PC1為-0.9 ～ 0.4，PC2為-0.9 ～ 0.9；Ⅲ區(qū)域 PC1 為 2.0 ～ 3.3，PC2 為 -4.5 ～ -2.1。

結(jié)合案件繳獲信息分析不同區(qū)域的海洛因樣品，我們發(fā)現(xiàn)在德宏繳獲的200多份海洛因樣品集中分布在Ⅰ區(qū)域，且出現(xiàn)不同案件樣品間相互關(guān)聯(lián)的情況較多；在臨滄繳獲的140多份樣品絕大多數(shù)分布在Ⅱ區(qū)域，少數(shù)分布在Ⅰ和Ⅲ區(qū)域；保山、普洱等其余邊境州市繳獲的海洛因樣品在PCA分布圖中無明顯特征。因此，推測由德宏、臨滄兩地繳獲的海洛因樣品來源或加工工藝可能不同。

3 結(jié)論

本文采用UPLC-MS/MS法，以海洛因中的15種中性/酸性雜質(zhì)峰面積建立Pearson關(guān)聯(lián)性數(shù)學(xué)模型，確定0.965為海洛因樣品關(guān)聯(lián)性閾值。對489份“金三角”海洛因樣品進行特征分析，篩選出46個關(guān)聯(lián)性極強的樣品組，每組包含了2～22份樣品，推測同一組份海洛因樣品的生產(chǎn)原料及工藝相同，為同一批次的相似度極高。同時，結(jié)合案件信息、關(guān)聯(lián)性分組及主成分分析結(jié)果，推測在德宏、臨滄兩地繳獲的海洛因樣品來源或加工工藝可能不同。

致謝

衷心感謝公安部禁毒情報技術(shù)中心國家毒品實驗室對本項目研究給予的大力支持與幫助，感謝花鎮(zhèn)東、孟鑫兩位博士給予的技術(shù)支持與指導(dǎo)！