兩種混合STR分型分析軟件的比較與應(yīng)用

李 甫，徐 磊，藺 晨，凃 政，靳小攀，徐 珍,*

（1.北京市東城區(qū)公安司法鑒定中心，北京 100061；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038；3.北京瑞源文德科技有限公司，北京 100176）

現(xiàn)場勘查質(zhì)量的提高，DNA檢驗技術(shù)日新月異的發(fā)展，儀器檢測靈敏度的增強(qiáng)和實驗技術(shù)人員操作水平的提升，都使得越來越多原來無法利用的現(xiàn)場檢材DNA可應(yīng)用于案件分析與偵破工作，如低模板量DNA以及混合DNA[1]。在實際案件中，混合STR分型分析可以為偵查提供線索，為訴訟提供證據(jù)，能夠大大提高混合生物樣本的利用價值。但混合STR分析對技術(shù)人員的專業(yè)基礎(chǔ)及經(jīng)驗要求較高，同時還需要熟練運(yùn)用概率統(tǒng)計學(xué)等知識對結(jié)果進(jìn)行科學(xué)合理的分析解釋，因此，其又成為目前法醫(yī)學(xué)工作者面臨的難點與挑戰(zhàn)[2-3]。

傳統(tǒng)的人工拆分方式主要針對兩個供體的混合樣本，多數(shù)情況下需利用其中已知供體的基因型，結(jié)合峰高、峰面積等參數(shù)推算混合比例，進(jìn)而拆分出另外一個供體的基因型。這種方式雖針對性強(qiáng)，但過于依賴個人經(jīng)驗和判斷，且沒有統(tǒng)一量化標(biāo)準(zhǔn)，其結(jié)果不能作為定案的唯一物證，只能作為偵查線索或參考證據(jù)[4]。近幾年，隨著技術(shù)的發(fā)展，一種智能化混合STR分析方法應(yīng)運(yùn)而生，即利用混合STR分型分析軟件進(jìn)行分析。該方法引入統(tǒng)計學(xué)概率模型，能更充分地利用混合圖譜中的數(shù)據(jù)信息，同時設(shè)置可量化的標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)性好，減少了主觀性，拆分結(jié)果更加客觀[5-7]。目前，國內(nèi)混合STR分型分析主要依賴人工拆分方式，分析軟件的應(yīng)用還極少。本文針對目前國際上已獲廣泛認(rèn)可的兩款混合分型分析軟件STRmix和云算GPM，從基本信息、理論比較、分析過程和實戰(zhàn)應(yīng)用等多個方面進(jìn)行分析與比較，以期為當(dāng)前國內(nèi)案件中混合STR分型分析這一難題提供解決方案，為法醫(yī)DNA工作者提供選擇參考和依據(jù)，也期望能夠推動國內(nèi)混合分型分析及與國際交流互鑒。

1 軟件簡介

STRmix混合圖譜分析系統(tǒng)由新西蘭皇家科學(xué)院環(huán)境科學(xué)研究院（ESR）與南澳大利亞法庭科學(xué)研究中心（FSSA）共同設(shè)計開發(fā)，嚴(yán)格遵循SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR Typing by Forensic DNA Testing Laboratories 3.3.2所認(rèn)證的概率型基因分型分析技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，目前已被包括美國FBI、英國KFS在內(nèi)的全球多家犯罪學(xué)實驗室購買使用，其對混合圖譜的解釋結(jié)果得到了廣泛認(rèn)可[8]。

云算GPM混合圖譜分析系統(tǒng)其核心為德國MDG集團(tuán)的全連續(xù)法概率分型軟件GenoProof?Mixture 3，國內(nèi)瑞源公司對其進(jìn)行二次開發(fā)，針對軟件的網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用方面也進(jìn)行優(yōu)化。GenoProof?Mixture 3軟件按照SWGDAM Interpretation Guidelines for Autosomal STR Typing by Forensic DNA Testing Laboratories 3.3.2要求進(jìn)行驗證，同時也符合德國DNA委員會對混合斑解釋建議要求，分析結(jié)果可作為法庭示證使用[9]。

2 軟件比較

2.1 理論比較

2.1.1 基本原理

混合分型分析軟件按照技術(shù)原理劃分，主要有二進(jìn)制法、半連續(xù)法和全連續(xù)法三類[10]。

1）二進(jìn)制法通過設(shè)定閾值來處理峰的隨機(jī)性并篩選數(shù)據(jù)，該方法舍棄了一部分?jǐn)?shù)據(jù)信息，在處理低拷貝DNA、降解DNA、混合比例差異較大DNA及三人以上混合DNA時結(jié)果不理想。

2）半連續(xù)法優(yōu)于二進(jìn)制法，但忽略了峰值的變異性、混合比例及stutter峰所占百分比等因素，在拆分的合理性、準(zhǔn)確性上還有待提高[11]。

3）全連續(xù)法建立了較為完善的生物模型，綜合了影響STR峰值信號的全部因素，并且聯(lián)合MCMC先進(jìn)算法，模擬分析圖譜中包含的所有信息，最終以概率的形式給出可能的分型組合[12-13]，是目前公認(rèn)最先進(jìn)的混合圖譜拆分系統(tǒng)。

本文討論的兩種混合分型分析軟件STRmix和云算GPM均屬于全連續(xù)法分析系統(tǒng)，其主要計算原理是通過建立生物模型來計算每個等位基因的總產(chǎn)物量[14]，通過MCMC算法的迭代運(yùn)算不斷優(yōu)化計算其中的各個參數(shù)，直到找到能夠解釋證據(jù)圖譜的最佳基因型組合。

2.1.2 結(jié)果呈現(xiàn)形式

目前對于混合分型圖譜的解釋，常見以下四種方法：定性評價、計算匹配概率、計算排除概率、計算似然率（likelihood ratio, LR），國際法庭遺傳學(xué)會推薦采用似然率法進(jìn)行分析和解釋[15-16]。STRmix和云算GPM均可以結(jié)合參照樣本的基因型進(jìn)行對比綜合分析計算，并以似然率的方式呈現(xiàn)在結(jié)果報告中。

STRmix和云算GPM在模型構(gòu)建時除了考慮等位基因峰高和峰面積之外，還充分考慮到低拷貝數(shù)目、等位基因丟失、隨機(jī)插入、雜合子不均衡等情況。其中云算GPM還可根據(jù)需要進(jìn)行二進(jìn)制法LR計算、全連續(xù)法LR計算、隨機(jī)個體不被排除概率（RMNE）、隨機(jī)匹配概率（RMP）等。

2.2 分析過程比較

2.2.1 數(shù)據(jù)處理

兩款軟件數(shù)據(jù)導(dǎo)入形式差異較大。 STRmix僅支持經(jīng)GeneMapper或GeneMarker分型軟件分析完畢的數(shù)據(jù)所導(dǎo)出的文本文件（或csv格式文件），且對生成的文本文件有格式要求，需在上述數(shù)據(jù)分析軟件中作預(yù)設(shè)。云算GPM集成了更加完整的全流程數(shù)據(jù)分析功能，支持導(dǎo)入HID或FSA格式的原始數(shù)據(jù)，可以在軟件內(nèi)部進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，手動分析完畢后也支持樣本文件的生成，進(jìn)而進(jìn)行下游的計算工作。

2.2.2 自定義功能

兩款軟件在自定義功能的內(nèi)容和數(shù)量上存在著不同點，具體差異見表1。

表1 軟件自定義功能對比Table 1 Comparison of application-defi ned functions between two pieces of software

2.2.3 報告輸出

STRmix的計算結(jié)果會以彈出的Calculation Results界面預(yù)覽展示，分析完畢的結(jié)果數(shù)據(jù)會根據(jù)類型保存在本地指定目錄的不同文件夾內(nèi)，根據(jù)需要可以分別打開并查看。生成報告時，支持生成PDF文件或Codis格式文件，并通過勾選去掉不需要輸出至報告的內(nèi)容。

云算GPM的Results界面列舉各位點基于當(dāng)前假設(shè)的似然率、檢（辯）方假設(shè)概率以及總似然率，不同信息分列在不同的下拉選項卡中，客戶端分析的結(jié)果數(shù)據(jù)會上傳至服務(wù)器中存儲。生成報告時，可選擇PDF或Word形式，并通過勾選去掉不需要輸出至報告的內(nèi)容。

3 實戰(zhàn)應(yīng)用

3.1 應(yīng)用需要

混合DNA樣本由兩名或兩名以上個體的血液、精液、分泌物、排泄物、脫落上皮細(xì)胞等同種或不同種類型物質(zhì)附著在不同的犯罪現(xiàn)場載體上而形成。

一類是由不同個體的同一種體液或組織混合而成，常見如多個個體的混合血痕，多人受傷的傷害、殺人案件中提取的檢材。

另一類是由不同個體的不同體液或組織混合而成，最常見為性犯罪案件中提取到的檢材，主要為陰道擦拭物、被害人內(nèi)褲、床單、衛(wèi)生紙、犯罪嫌疑人陰莖拭子等，這類檢材包含精子和陰道上皮細(xì)胞，屬男、女個體成分的混合物?；旌蟂TR分型的分析對還原現(xiàn)場重建、案情調(diào)查均有幫助，還能提供嫌疑人線索，對協(xié)助案件偵破等有重要作用。

近年來混合檢材的DNA有效檢出比例越來越高，部分混合樣本可以通過實驗技術(shù)分離組分后進(jìn)行分析，如激光捕獲顯微切割[17-18]、差異裂解[19]、單細(xì)胞分離[20-21]，但均有一定的難度和局限性。

使用STRmix、云算GPM等混合分型分析軟件，利用統(tǒng)計學(xué)的方法進(jìn)行智能化計算，可方便高效地進(jìn)行多人混合拆分，目前最多可拆分5人混合，同時對拆分出來的基因型組合提供統(tǒng)計學(xué)權(quán)重。

3.2 實踐案例

經(jīng)對2018—2019年檢驗的案件進(jìn)行梳理，篩選來源均已知的2人混合分型圖譜共54例（其中性犯罪類案件檢材37例，盜搶類案件檢材6例，傷害殺人類案件檢材6例，其他案件檢材5例），3人混合分型圖譜1例（為故意傷害案件檢材），分別應(yīng)用STRmix和云算GPM進(jìn)行計算，均拆分出了準(zhǔn)確的供體分型。

另外，選取盜竊類案件來源均未知的2人混合分型圖譜25例，3人混合分型圖譜7例，分別應(yīng)用2種軟件進(jìn)行計算，其結(jié)果報告按基因座分別以概率的形式給出了可能的分型組合，再選取其中權(quán)重較高的分型通過全國公安機(jī)關(guān)DNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行快速比對，并將比中的人員提供給偵查部門進(jìn)行后期甄別。

3.3 典型案例

簡要案情：某日，某地某商戶發(fā)生一起盜竊案件，店內(nèi)監(jiān)控顯示嫌疑人曾翻動過收銀臺上物品，勘查人員使用植絨棉簽分別提取收銀臺上夾子、POS機(jī)、USB線插頭、U盤拭子。

經(jīng)檢驗，USB線插頭拭子檢出混合STR分型結(jié)果（圖1），其中可能包含有價值的破案信息。對該混合STR分型分別使用STRmix和云算GPM兩種軟件進(jìn)行分析，拆分其中主要貢獻(xiàn)者。STRmix軟件拆分結(jié)果報告見圖2，云算GPM的結(jié)果報告見圖3。

結(jié)果顯示，兩個軟件拆分出的主要貢獻(xiàn)者在14個基因座上基因分型均一致且權(quán)重均大于90%，在D21S11基因座兩者分別給出了可能性較高的分型及對應(yīng)的權(quán)重。

將上述拆分出的男性STR分型通過全國公安機(jī)關(guān)DNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行快速比對，成功比中1名違法犯罪人員，該信息為案件偵破提供了關(guān)鍵線索。

4 討論

STRmix和云算GPM這兩款軟件的核心算法均基于目前最先進(jìn)的全連續(xù)法分析系統(tǒng)，通過統(tǒng)計學(xué)概率模型構(gòu)建和MCMC算法進(jìn)行綜合分析，以概率的形式給出可能的分型組合，兩者實際應(yīng)用于混合圖譜拆分過程時，針對不同的計算需求存在一定的差異性。

STRmix的優(yōu)勢在于其每一步計算過程均提供高自由度的參數(shù)修改編輯功能，可使有更多需求的使用者在充分考慮每一個變量的前提下，在進(jìn)行每一次的計算過程并獲得更有針對性的分析結(jié)果的同時，能盡量避免反復(fù)計算，節(jié)約時間和人力成本。但該軟件在正式應(yīng)用于案件分析之前，需要進(jìn)行大量的內(nèi)部驗證實驗，以獲得針對相關(guān)實驗室的具體設(shè)置參數(shù)，該過程較為費(fèi)時費(fèi)力。而云算GPM的內(nèi)部驗證工作主要由軟件開發(fā)公司完成，如果各實驗室的操作流程規(guī)范、儀器、試劑、耗材等方面均符合軟件的操作指南，則可以使用通用參數(shù)設(shè)置得出符合其標(biāo)準(zhǔn)的運(yùn)算結(jié)果。

云算GPM的優(yōu)勢在于融入了原始數(shù)據(jù)圖譜分析功能，可直接導(dǎo)入HID或FSA格式的原始數(shù)據(jù)并在軟件內(nèi)部進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的工作，做到邊分析邊計算。在連接公安數(shù)據(jù)庫后，能對各個基因座的拆分結(jié)果按照概率進(jìn)行排列組合，將所得的大量可疑供體分型自動進(jìn)行快速比對。與STRmix將各項參數(shù)的編輯修改功能整合至單項計算窗口中不同，云算GPM拆分操作過程相對簡單，但其大部分參數(shù)設(shè)置和功能預(yù)置需要在分析前進(jìn)入獨立的設(shè)置菜單中修改，在實時修訂參數(shù)、實時計算數(shù)據(jù)方面整體流暢度不如STRmix，有可能無法完全滿足有特殊或復(fù)雜計算需求的使用者。

綜上，STRmix和云算GPM兩款軟件作為當(dāng)下國際認(rèn)可度較高的混合STR分析工具，均是基于統(tǒng)計學(xué)概率模型，遵照權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計算，其拆分?jǐn)?shù)據(jù)結(jié)果有可量化的標(biāo)準(zhǔn)；實際應(yīng)用過程中，兩者在內(nèi)部驗證、參數(shù)修訂、數(shù)據(jù)流轉(zhuǎn)等方面有一定差異。目前，國內(nèi)混合STR分析主要依賴于傳統(tǒng)的人工拆分方式，分析軟件的應(yīng)用可以為解決案件中常見的混合STR分型分析這一難題提供參考和依據(jù)，但具體的軟件選擇還應(yīng)結(jié)合實際應(yīng)用需求確定[3]。

法醫(yī)DNA領(lǐng)域現(xiàn)在正經(jīng)歷著復(fù)雜分型的解釋方法學(xué)轉(zhuǎn)變。與現(xiàn)有的二元法相比，概率統(tǒng)計學(xué)分析軟件為解釋微量、復(fù)雜的混合STR分型提供了有力的理論依據(jù)[22]。然而目前這些分析軟件不能也不應(yīng)該替代經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員[10,23]。對STR圖譜仍需先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)分析和嚴(yán)格評估，在充分理解軟件計算原理的條件下，完成數(shù)據(jù)的輸入（混合DNA分型）直至輸出（似然率），將拆分軟件作為一種幫助工具而非判定依據(jù)。恰如Buyckleton等所言：“為了理解分型比對軟件的優(yōu)勢和劣勢，使用者和相關(guān)獲益者最好能理解系統(tǒng)基本原理，并以最全面的、深思熟慮的方式使用該系統(tǒng)以實現(xiàn)公共利益”[24]。