小鼠耳芥PEBP基因家族全基因組鑒定及表達(dá)分析

李永光，金玉環(huán)，郭力，艾昊，李瑞寧，黃先忠,3

小鼠耳芥PEBP基因家族全基因組鑒定及表達(dá)分析

李永光1,2，金玉環(huán)1，郭力1，艾昊2，李瑞寧2，黃先忠2,3

1. 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832003 2. 安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，鳳陽 233100 3. 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，植物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003

PEBP (phosphatidylethanolamine-binding protein)家族包含保守的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，其中FT和TFL1蛋白構(gòu)成植物成花素–反成花素系統(tǒng)調(diào)控植物的開花時(shí)間和株型結(jié)構(gòu)被廣泛關(guān)注。小鼠耳芥()是早春短命植物，生長在古爾班通古特沙漠南緣荒漠地帶，對環(huán)境具有較好的適應(yīng)性。本研究對小鼠耳芥PEBP基因家族進(jìn)行全基因組鑒定，發(fā)現(xiàn)其基因組包含11個(gè)基因(1個(gè)2個(gè)、2個(gè)、2個(gè)、2個(gè)和2個(gè))，均由4個(gè)外顯子與3個(gè)內(nèi)含子組成。共線性分析表明，小鼠耳芥與擬南芥()、琴葉擬南芥()基因間存在11對共線性關(guān)系，PEBP家族在小鼠耳芥基因組中發(fā)生了明顯的擴(kuò)張，并且基因復(fù)制類型為全基因組復(fù)制/片段復(fù)制。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)在種子中高表達(dá)，和主要在花和果莢中表達(dá)，在莖尖中高表達(dá)，但在根中高表達(dá)。進(jìn)一步分析了6個(gè)基因在4種非生物脅迫下的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)在10% PEG6000模擬干旱脅迫下，基因整體上調(diào)表達(dá)，在低溫(4℃)脅迫下整體下調(diào)表達(dá)。在鹽脅迫(250 mmol/L NaCl)下，/下調(diào)表達(dá)，/先下調(diào)表達(dá)后上調(diào)表達(dá)，而/明顯上調(diào)表達(dá)。高溫(40℃)脅迫下，/和/顯著下調(diào)表達(dá)，但/上調(diào)表達(dá)。綜上，/在鹽、干旱和高溫脅迫下均顯著上調(diào)表達(dá)。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明，ApPEBP主要與開花通路中的相關(guān)蛋白及核糖體蛋白互作。推測基因在小鼠耳芥響應(yīng)荒漠逆境調(diào)節(jié)生長發(fā)育、開花轉(zhuǎn)變過程中起著重要的作用。

短命植物；小鼠耳芥；開花轉(zhuǎn)變；PEBP；逆境

PEBP (phosphatidylethanolamine-binding protein)蛋白含有磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白保守結(jié)構(gòu)域[1]，在開花轉(zhuǎn)變及株型結(jié)構(gòu)建立中起著重要的作用[2]。進(jìn)化分析表明，PEBP家族主要分為3個(gè)亞家族：MOTHER OF FT AND TFL1 (MFT)、FLOWERING LOCUS T (FT)和TERMINAL FLOWER 1 (TFL1)[3]。擬南芥() PEBP家族含有6個(gè)成員：、、()、、()和()。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)是和的祖先[3]，MFT蛋白通過負(fù)反饋回路調(diào)控ABA信號控制種子的萌發(fā)[4]。FT和TFL1蛋白構(gòu)成植物成花素–反成花素系統(tǒng)主要組分，調(diào)控植物開花時(shí)間和株型結(jié)構(gòu)[5,6]。除此之外，還能夠調(diào)控?cái)M南芥氣孔開放[7]和雜種優(yōu)勢[8]、馬鈴薯()的結(jié)薯[9]、洋蔥()鱗莖的形成[10]和蔗糖的運(yùn)輸[11]等。的功能和相反，抑制開花轉(zhuǎn)變[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，還能調(diào)控種子的發(fā)育[13]。

在長日照條件下，表達(dá)量升高，在葉片韌皮部的伴胞細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄和翻譯為FT蛋白并通過韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)到莖尖[14,15]，之后其與14-3-3蛋白、bZIP轉(zhuǎn)錄因子FD蛋白相互作用形成成花素激活復(fù)合物，誘導(dǎo)花分生組織特征基因的表達(dá)，如()和()，從而促進(jìn)開花轉(zhuǎn)變[16,17]。在短日照條件下TFL1與FD形成復(fù)合物，并通過拮抗FT-FD成花素激活復(fù)合物來延遲開花[18]。雖然TFL1-FD作為共抑制子，F(xiàn)T-FD作為共激活子共同調(diào)控植物生長，但由于TFL1-FD和FT-FD復(fù)合物只存在于極少數(shù)細(xì)胞類型中，并且蛋白質(zhì)豐度低，因此對TFL1-FD和FT-FD復(fù)合物在體內(nèi)的作用機(jī)制、拮抗作用仍然了解較少。近年來，多個(gè)課題組通過ChIP-seq鑒定了大量FD或TFL1結(jié)合位點(diǎn)及早期TFL1-FD直接抑制的靶標(biāo)[19～21]，說明TFL1-FD復(fù)合物作用的復(fù)雜性。

短命植物是一種生長于干旱荒漠地區(qū)能利用早春雨水或雪水在夏季干旱到來之前完成生活周期的植物類群，被稱為演替過程中的先鋒植物，某些極端環(huán)境的開拓者[22,23]。目前的研究多集中在短命植物適應(yīng)荒漠環(huán)境的生理生態(tài)學(xué)方面，但對其與環(huán)境相適應(yīng)的分子機(jī)制還研究較少。小鼠耳芥()是一種生長在古爾班通古特沙漠南緣荒漠地帶的短命植物，屬十字花科藍(lán)芥族鼠耳芥屬[24]，具有快速開花結(jié)果、結(jié)實(shí)量大、光合效率高和耐鹽抗寒的特點(diǎn)，并且基因組較小，是研究生物與環(huán)境相適應(yīng)機(jī)制的理想材料[25～27]。本研究利用小鼠耳芥全基因組序列鑒定出11個(gè)小鼠耳芥基因，并開展了家族生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)及響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)特征分析，為進(jìn)一步挖掘短命植物PEBP基因家族的潛在功能以及遺傳應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

小鼠耳芥種子按照Huang等[25]描述的方法進(jìn)行表面消毒和種植。收集小鼠耳芥生長8 d的根和子葉，30 d的蓮座葉、莖尖和莖，65 d的花和70 d的果莢等組織。生長42 d的小鼠耳芥使用改良Hoagland營養(yǎng)液[25]分別進(jìn)行NaCl (250 mmol/L)、干旱(10% PEG6000)水培處理，處理0 h、12 h、24 h和48 h共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別取葉片組織。生長28 d的小鼠耳芥分別放置在4℃和40℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫與高溫處理，處理0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別取葉片組織。以上所有時(shí)間點(diǎn)的材料均重復(fù)3次取樣，收集后立即用液氮冷凍，然后置于–80℃冰箱保存。

1.2 基因組數(shù)據(jù)來源

從Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl. org/index.html)下載十字花科植物擬南芥和琴葉擬南芥()的基因組數(shù)據(jù)。小鼠耳芥基因組數(shù)據(jù)為本實(shí)驗(yàn)室提供(數(shù)據(jù)暫未公開)。從NCBI(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中獲取擬南芥及琴葉擬南芥PEBP蛋白序列。

1.3 PEBP基因家族成員的鑒定

以擬南芥6個(gè)PEBP蛋白的氨基酸序列為query，與小鼠耳芥的蛋白序列進(jìn)行BLASTP比對，-value≤ 1e–5，其余參數(shù)為默認(rèn)值。將得到的候選蛋白序列使用hmmer (http://www.hmmer.org/)比對到PFAM (http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫中，基于Pfam的PEBP模型(PF01161)進(jìn)行進(jìn)一步比對篩選，參數(shù)為默認(rèn)值，從而確定小鼠耳芥PEBP家族成員，最后根據(jù)與擬南芥同源基因的聚類進(jìn)行命名。蛋白分子量和等電點(diǎn)使用ExPASy (https://web.expasy.org/ protparam/)蛋白分析工具估算。亞細(xì)胞定位通過ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml)進(jìn)行預(yù)測。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建、基因結(jié)構(gòu)和蛋白motif分析

使用ClustalW[28]將小鼠耳芥與擬南芥PEBP家族蛋白序列進(jìn)行多重序列比對，參數(shù)為默認(rèn)值。使用MEGA6.0[29]軟件構(gòu)建Neighbor-Joining樹?；谛∈蠖婊蚪Mgff3文件，利用基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器GSDS (http://gsds.gao-lab.org/)分析ApPEBP家族基因的外顯子–內(nèi)含子分布。ApPEBP家族成員蛋白質(zhì)的保守motif利用MEME網(wǎng)站(http://meme-suite. org/tools/meme)進(jìn)行分析，motif長度范圍為10～60個(gè)氨基酸殘基，motif最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目為10個(gè)，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。

1.5 基因比較進(jìn)化分析

共線性分析使用MCScanX[30]預(yù)測物種間及小鼠耳芥物種內(nèi)的同源基因，參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值。分別將擬南芥、琴葉擬南芥和小鼠耳芥3個(gè)物種的基因組兩兩BLASTP比對，-value≤1e–5，提取PEBP基因家族中的基因重復(fù)對信息，可篩選出3個(gè)物種間的直系同源基因。將ApPEBP蛋白在小鼠耳芥基因組內(nèi)進(jìn)行BLASTP比對，-value≤1e–5，篩選出小鼠耳芥物種內(nèi)的旁系同源基因，即重復(fù)基因?qū)?。使用Tbtools[31]展示擬南芥、琴葉擬南芥和小鼠耳芥等物種間的直系同源基因以及小鼠耳芥物種內(nèi)旁系同源基因的共線性關(guān)系。使用MCScanX[30]下游分析程序duplicate_gene_classifier分析小鼠耳芥PEBP家族成員的復(fù)制類型。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)分析

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄參照Huang等[25]方法，qRT- PCR參照J(rèn)in等[26]方法，PCR儀為ABI ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Life Technologiesl，美國)。使用Primer 3.0工具(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計(jì)基因的特異性擴(kuò)增引物，以為內(nèi)參基因[26](附表1)，利用2–ΔCT法[32]計(jì)算基因不同組織的相對表達(dá)量；利用2–ΔΔCT法計(jì)算基因響應(yīng)不同非生物脅迫下的相對表達(dá)量[32]，使用單因素方差分析(Duncan’s multiple range test)計(jì)算樣本之間的差異顯著性(<0.05)。

1.7 小鼠耳芥PEBP基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析

將每個(gè)基因起始密碼子上游2500 bp序列提交至PlantCARE (http://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/)，預(yù)測基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件。

1.8 小鼠耳芥PEBP蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析及驗(yàn)證

使用OrthoVenn2工具(https://orthovenn2. bioinfotoolkits.net/)鑒定在擬南芥中的直系同源基因。利用AraNetV2 (http://www.inetbio.org/ aranet/)和STRING (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)小鼠耳芥在擬南芥中的直系同源基因預(yù)測與ApPEBP相互作用的蛋白。利用Cytoscape軟件[33]顯示預(yù)測的交互網(wǎng)絡(luò)。

設(shè)計(jì)小鼠耳芥和()用于酵母雙雜的特異性擴(kuò)增引物(附表1)，將和的蛋白編碼區(qū)序列片段通過酶切連接，分別構(gòu)建到、載體上。隨后將、共轉(zhuǎn)入到AH109菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，涂在二缺(SD/-Trp-Leu)板上，待長出單克隆，挑取單克隆用100 μL的ddH2O懸起，按照10倍梯度進(jìn)行稀釋。將稀釋的菌液吸取5 μL分別點(diǎn)在二缺和四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)2 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠耳芥PEBP基因家族成員的鑒定

首先以擬南芥PEBP蛋白序列為query，利用小鼠耳芥全基因組序列進(jìn)行BLASTP比對，比對結(jié)果去重復(fù)后進(jìn)行HMMER鑒定。從小鼠耳芥中共鑒定到11個(gè)基因：1個(gè)2個(gè)、2個(gè)、2個(gè)、2個(gè)和2個(gè)。編碼蛋白均含有保守的PEBP結(jié)構(gòu)域。對ApPEBP蛋白的氨基酸數(shù)量、蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)以及亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測分析表明，ApPEBP蛋白由173～178個(gè)氨基酸組成，其中ApTFL1-2氨基酸序列最長(178 aa)，ApMFT序列最短(173 aa) (附表2)。蛋白質(zhì)分子量為19.12～20.25 kDa，其中TFL1-2分子量最大為20.25 kDa，ApMFT分子量最小為19.12 kDa。等電點(diǎn)范圍為7.02～9.59，大部分大于7，為堿性蛋白，可能在偏堿性的環(huán)境中發(fā)揮作用。蛋白定位預(yù)測結(jié)果顯示所有ApPEBP蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和蛋白motif

小鼠耳芥與擬南芥共17個(gè)PEBP蛋白氨基酸多重序列比對結(jié)果顯示，所有PEBP蛋白均包含與配體結(jié)合位點(diǎn)形成有關(guān)的DPDxP和GxHR保守結(jié)構(gòu)域(附圖1)。ApTFL1-2的第89位區(qū)分FT與TFL功能的關(guān)鍵氨基酸殘基由組氨酸His (H)變?yōu)樘於彼酇sp (N)，功能可能發(fā)生改變(附圖1)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明17個(gè)基因分別屬于、、和亞家族(圖1A)，除了亞家族僅包含1個(gè)和1個(gè)，其余5個(gè)亞家族皆包含2個(gè)和1個(gè)?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，同一亞家族成員外顯子–內(nèi)含子結(jié)構(gòu)相似，并且17個(gè)基因均由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成(圖1B)。和基因內(nèi)含子較長，但與不同的是第二和第三外顯子相距較遠(yuǎn)。、與基因內(nèi)含子較短，但第二與第三外顯子距離與相似。通過MEME在線程序?qū)?1個(gè)ApPEBP蛋白進(jìn)行保守motif分析，共預(yù)測出6個(gè)保守motif (圖1C，附表3)。motif 3包含保守位點(diǎn)DPDxP，motif 1包含保守位點(diǎn)GxHR。除ApFT1和ApTFL1-2比其他ApPEBP多了一個(gè)motif 6外，小鼠耳芥PEBP家族成員motif組成沒有區(qū)別，并且motif順序排列相同，說明小鼠耳芥PEBP家族基因的高保守性。

2.3 小鼠耳芥與擬南芥、琴葉擬南芥PEBP基因的共線性分析

為了研究PEBP基因家族成員在進(jìn)化中的收縮與擴(kuò)張情況，利用MCScanX[30]軟件分析小鼠耳芥與擬南芥、琴葉擬南芥間直系同源基因的共線性關(guān)系。結(jié)果表明在擬南芥中存在6個(gè)小鼠耳芥直系同源基因(圖2)，分別為、、、和。基因數(shù)量約是的兩倍。二者直系同源基因存在11對共線性關(guān)系。而琴葉擬南芥雖然染色體數(shù)量比擬南芥多，但也只含有6個(gè)小鼠耳芥直系同源基因(圖2)，同樣，二者直系同源基因也只存在11對共線性關(guān)系。以上結(jié)果表明家族成員發(fā)生了擴(kuò)張。小鼠耳芥基因組內(nèi)的旁系同源基因?qū)Ψ治霰砻?附圖2)，有5對旁系同源基因?qū)?，分別為/、/、/、/和/，每個(gè)基因都位于不同染色體上。分析這些旁系同源基因?qū)Φ膹?fù)制類型發(fā)現(xiàn)，基因成員為全基因組復(fù)制/片段復(fù)制(附表4)。

2.4 ApPEBP基因組織表達(dá)特征分析

qRT-PCR分析基因在根、子葉、蓮座葉、莖、莖尖、花、果莢共7個(gè)組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11個(gè)基因在小鼠耳芥不同組織中表達(dá)差異明顯(圖3)。在果莢中表達(dá)量最高，在根和花中低表達(dá)，在其他組織中不表達(dá)。和表達(dá)模式接近，均在花和果莢中高表達(dá)，但在其他組織中微量表達(dá)或不表達(dá)。其中在果莢中的表達(dá)量最高，而在花中的表達(dá)量最高。和的表達(dá)特征非常相似，在果莢中表達(dá)量最高，花中次之。但除了在子葉中低表達(dá)以外，在其他組織中均有表達(dá)，在莖尖中表達(dá)量最高。2個(gè)基因的表達(dá)特征高度相似，均在莖尖中表達(dá)量最高，其次在根中低表達(dá)，但在其他組織中幾乎不表達(dá)。和在根中表達(dá)量最高，在其他組織中不表達(dá)，但在莖中低表達(dá)，在其他組織中幾乎不表達(dá)。兩個(gè)基因表達(dá)模式也非常相似，均在花和果莢中高表達(dá)，并且在花組織中的相對表達(dá)量最高。

圖1 擬南芥和小鼠耳芥PEBP家族基因系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和蛋白motif分布

A：擬南芥和小鼠耳芥17個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹；B：17個(gè)基因的外顯子–內(nèi)含子分布；C：17個(gè)PEBP蛋白的6個(gè)保守基序分布特征。

圖2 擬南芥、琴葉擬南芥和小鼠耳芥中PEBP基因的共線性關(guān)系

黑色圓柱分別代表擬南芥、小鼠耳芥、琴葉擬南芥的5、16、8條染色體，黑色線條表示物種間共線性關(guān)系，灰色線條表示所有基因成員的共線性關(guān)系。

2.5 ApPEBP響應(yīng)鹽、干旱、低溫和高溫脅迫的表達(dá)特征

進(jìn)一步分析6個(gè)基因分別在250 mmol/L NaCl、10% PEG6000模擬干旱、低溫(4℃)和高溫(40℃)脅迫下的表達(dá)特征。結(jié)果表明，在鹽脅迫12 h，和的表達(dá)量迅速下降，24 h稍上升后下降，二者在鹽脅迫過程中降低表達(dá)(圖4A)。和在鹽脅迫0～24 h表達(dá)量降低，但在24～48 h表達(dá)量升高。鹽脅迫處理12 h，和基因表達(dá)量迅速升高，后逐漸下調(diào)表達(dá)，但在鹽脅迫48 h又上調(diào)表達(dá)，同對照相比二者顯著上調(diào)表達(dá)。干旱脅迫48 h，和持續(xù)上調(diào)表達(dá)，但和表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(圖4B)。和隨著干旱脅迫時(shí)間的增加表達(dá)量緩慢升高，但在脅迫48 h表達(dá)量急劇升高，達(dá)到最大值。在低溫脅迫下，除了，其余5個(gè)均迅速下調(diào)表達(dá)，的表達(dá)較為復(fù)雜，先下調(diào)后上調(diào)表達(dá)，脅迫24 h又下調(diào)，后又上調(diào)表達(dá)，但整體的表達(dá)水平低于對照(圖4C)。高溫脅迫下，兩個(gè)和同源基因均明顯下調(diào)表達(dá)；在脅迫6 h上調(diào)表達(dá)，后下調(diào)表達(dá)，但在48 h迅速上調(diào)表達(dá)，而脅迫至24 h始終下調(diào)表達(dá)，但在48 h脅迫時(shí)和表達(dá)類似，迅速上調(diào)表達(dá)(圖4D)。并且順式作用元件分析表明啟動(dòng)子區(qū)含有大量響應(yīng)逆境脅迫的順式作用元件(附圖3)，這與的表達(dá)應(yīng)答逆境脅迫結(jié)果對應(yīng)。

2.6 ApPEBP蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

為了更好的理解ApPEBP家族生物學(xué)功能，本文預(yù)測了ApPEBP蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明與ApPEBP互作的擬南芥蛋白共21個(gè)，根據(jù)基因功能將互作蛋白分為兩類(圖5)。一類為開花通路蛋白，例如CONSTANS (CO)、AP1、AGAMOUS-like 20 (AGL20)、LFY、LATE FLOWERING (LATE)、SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP)、GIGANTEA (GI)、FLOWERING LOCUS C (FLC)、AGL8、SYNAPTIC 1 (SYN1)和bZIP27。其中，F(xiàn)LC和SVP抑制開花轉(zhuǎn)變[34,35]，LFY和GI促進(jìn)開花轉(zhuǎn)變[36,37]。并且ApPEBP家族成員中與擬南芥開花通路互作的蛋白主要是ApFT和ApTFL1。另外一類為核糖體蛋白，例如RPL4、RPL5、RPL17-1、RPL17-2、RPL17-3、RPL19、RPS5、DECOY、RPL4-2和RPS29。進(jìn)一步通過酵母雙雜實(shí)驗(yàn)對ApCEN與ApRPL5蛋白進(jìn)行蛋白互作的驗(yàn)證，結(jié)果表明ApCEN與ApRPL5能夠互作(圖6)，該結(jié)果暗示ApPEBP蛋白功能的實(shí)現(xiàn)與核糖體蛋白緊密關(guān)聯(lián)，詳細(xì)的功能機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖3 ApPEBP基因在小鼠耳芥不同組織中的表達(dá)特征

1：根；2：子葉；3：蓮座葉；4：莖；5：莖尖；6：花；7：果實(shí)。

3 討論

本研究從小鼠耳芥基因組中共鑒定得到11個(gè)基因，是模式植物擬南芥的1.8倍[38]。其中、和均有兩個(gè)復(fù)制基因，但只有一個(gè)，猜測另一個(gè)與水稻一樣在進(jìn)化中丟失[39]。多重序列比對發(fā)現(xiàn)ApTFL1-2的第89位區(qū)分FT與TFL1功能的關(guān)鍵氨基酸殘基由組氨酸His (H)變?yōu)榱颂於彼酇sp (N)，蛋白motif分析發(fā)現(xiàn)ApFT1、ApTFL1-2比他們的同源基因多了motif 6，順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)部分復(fù)制基因?qū)胁煌捻樖阶饔迷?，以上結(jié)果說明同源基因在進(jìn)化中可能產(chǎn)生功能分化。在裸子植物中頻繁的基因和基因組重復(fù)極大地促進(jìn)了PEBP基因家族的擴(kuò)張[40]。小鼠耳芥與擬南芥、琴葉擬南芥的共線性分析表明，小鼠耳芥PEBP基因家族發(fā)生了擴(kuò)張，基因的復(fù)制類型為全基因組/片段復(fù)制，表明小鼠耳芥PEBP基因家族主要通過全基因組復(fù)制的方式進(jìn)行擴(kuò)張。基因組測序分析發(fā)現(xiàn)十字花科植物須彌芥為適應(yīng)青藏高原特殊地理環(huán)境抗紫外線的家族發(fā)生明顯的擴(kuò)張[41]。PEBP基因家族調(diào)控植物開花，而開花對短命植物在有限的時(shí)間內(nèi)完成生活周期至關(guān)重要，因此PEBP家族基因的擴(kuò)張使小鼠耳芥更適應(yīng)新疆的荒漠環(huán)境。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)與ApPEBP互作的蛋白主要分為兩類，一類是開花通路蛋白，他們主要與ApFT和ApTFL1互作，說明與在開花調(diào)控通路中起核心調(diào)控的作用。而另一類ApPEBP互作蛋白主要是核糖體蛋白，他們在DNA修復(fù)、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控和細(xì)胞分化等核糖體外功能上具有重要作用[42]，表明基因除了能調(diào)控小鼠耳芥開花轉(zhuǎn)變外，還能調(diào)控其生長發(fā)育，ApCEN和ApRPL5的互作證明了這一觀點(diǎn)。在擬南芥中影響下胚軸和根的形成[43]。

圖4 6個(gè)ApPEBP基因響應(yīng)4種非生物脅迫的表達(dá)特征

A：250 mmol/L NaCl；B：10% PEG6000模擬干旱；C：低溫(4℃) ；D：高溫(40℃)。

圖中不同的小寫字母表示統(tǒng)計(jì)顯著性差異(<0.05)。

圖5 ApPEBP蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

節(jié)點(diǎn)之間的連線隨combined_score值(代表預(yù)測出的兩個(gè)蛋白相互作用的可信度，數(shù)值為0～1)的增大而變粗。節(jié)點(diǎn)大小隨與節(jié)點(diǎn)蛋白相互作用的蛋白數(shù)增多而增大。藍(lán)色圓代表小鼠耳芥PEBP家族成員；綠色圓代表擬南芥中與小鼠耳芥PEBP家族成員互作的蛋白。

圖6 ApCEN和ApRPL5的互作關(guān)系

三角形表示10倍稀釋梯度，3AT代表3-氨基三唑，T、L、H和A分別代表色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤。

基因參與植物不同組織器官的生長發(fā)育調(diào)控，具有明顯的組織表達(dá)特異性。在果莢中高表達(dá)與擬南芥和玉米()的同源基因表達(dá)特征相似[4,44]。在啟動(dòng)子區(qū)具有一個(gè)胚乳表達(dá)元件及3個(gè)ABA響應(yīng)元件，而擬南芥通過ABA信號途徑調(diào)控種子發(fā)育與萌發(fā)，說明與功能相似。在擬南芥中，F(xiàn)T在葉片中合成后通過韌皮部被運(yùn)送到植物莖尖，在花和果莢中高表達(dá)、在莖中低表達(dá)[45]。本研究發(fā)現(xiàn)/、與的表達(dá)特征相符，表明他們可能參與小鼠耳芥的開花調(diào)控，但在莖尖中高表達(dá)可能對分生組織的活性起著重要的作用，確切的功能需要進(jìn)一步驗(yàn)證。同樣，基因的表達(dá)模式與基因的表達(dá)模式十分相似，但他們功能的異同還需進(jìn)一步研究。擬南芥在開花轉(zhuǎn)變階段的莖尖中表達(dá)量顯著上調(diào)[12]，金魚草()在花序頂端表達(dá)[46]。/在莖尖中高表達(dá)，推測與功能相似，抑制成花轉(zhuǎn)變并維持花序無限生長[47]。/在根中表達(dá)量最高，在其他組織幾乎不表達(dá)，與金魚草表達(dá)模式相異。分析啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件發(fā)現(xiàn)其包含分生組織表達(dá)元件及種子特異表達(dá)元件，表明可能除了具有調(diào)控小鼠耳芥根系分化的功能，還具有調(diào)控種子發(fā)育的功能，有研究表明具有調(diào)控種子大小的功能[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，大部分發(fā)生擴(kuò)張的PEBP家族基因發(fā)生了新功能化或亞功能化[2]。小鼠耳芥生長在古爾班通古特沙漠南緣，生長周期一般從3月中旬開始萌發(fā)到5月下旬成熟，這期間氣溫升高，干旱少雨，土壤表層鹽堿度升高。為了探究小鼠耳芥應(yīng)對環(huán)境的表達(dá)變化特征，發(fā)掘PEBP基因家族在小鼠耳芥適應(yīng)荒漠環(huán)境過程中可能產(chǎn)生的功能變化，本文分析了6個(gè)基因在4種非生物脅迫下的表達(dá)特征。在250 mmol/L NaCl脅迫下，和表達(dá)特征與擬南芥相似沒有明顯變化，但在鹽脅迫后表達(dá)量快速升高，結(jié)合的組織表達(dá)特征，暗示參與的鹽脅迫應(yīng)答過程與根的發(fā)育緊密相關(guān)。、和在干旱(10% PEG6000)脅迫下均上調(diào)表達(dá)，而擬南芥的、和的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生明顯改變[47]，推測PEBP基因家族在小鼠耳芥適應(yīng)新疆荒漠環(huán)境過程中產(chǎn)生了抵抗干旱脅迫的功能。在低溫(4℃)脅迫下，和擬南芥同源基因的表達(dá)類似，、和均下調(diào)表達(dá)，但僅微弱下調(diào)，順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)含有低溫響應(yīng)元件，說明參與植物在低溫環(huán)境下的開花調(diào)控。在高溫(40℃)脅迫下，擬南芥、和表達(dá)量無明顯變化[48]，但和下調(diào)表達(dá)，只有上調(diào)表達(dá)，表明在一定程度內(nèi)高溫可誘導(dǎo)的表達(dá)。綜合起來，在4種非生物脅迫下，只有在鹽、干旱和高溫脅迫下全都上調(diào)表達(dá)，尤其在鹽脅迫下的表達(dá)水平是對照的60～80倍，暗示是潛在的脅迫相關(guān)基因，在小鼠耳芥適應(yīng)新疆鹽、干旱和高溫脅迫環(huán)境中起著重要作用。

綜上所述，從基因結(jié)構(gòu)、蛋白motif和共線性分析表明小鼠耳芥基因既具有保守性也具有差異性，除了，小鼠耳芥其他基因明顯擴(kuò)張?；蚪M織表達(dá)、響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)差異暗示基因功能的差異及可能發(fā)生功能分化。尤其是明顯響應(yīng)高鹽、干旱和高溫脅迫，可能是小鼠耳芥適應(yīng)荒漠環(huán)境調(diào)節(jié)開花轉(zhuǎn)變的重要因子?；驊?yīng)答環(huán)境的生物學(xué)功能及機(jī)制，還需進(jìn)一步的深入研究。本研究豐富了植物PEBP基因家族的信息，為深入研究小鼠耳芥快速生長發(fā)育的機(jī)制提供參考，也為探索植物與環(huán)境相適應(yīng)的分子機(jī)制研究提供了線索。

附加材料詳見文章電子版www.chinagene.cn。

[1] Banfield MJ, Barker JJ, Perry AC, Brady RL. Function from structure? The crystal structure of human phosphatidylethanolamine-binding protein suggests a role in membrane signal transduction., 1998, 6(10): 1245–1254.

[2] Jin S, Nasim Z, Susila H, Ahn JH. Evolution and functional diversification of/family genes in plants.,2021, 109: 20–30.

[3] Karlgren A, Gyllenstrand N, K?llman T, Sundstr?m JF, Moore D, Lascoux M, Lagercrantz U. Evolution of the PEBP gene family in plants: functional diversification in seed plant evolution., 2011, 156(4): 1967–1977.

[4] Xi WY, Liu C, Hou XL, Yu H.regulates seed germination through a negative feedback loop modulating ABA signaling in., 2010, 22(6): 1733–1748.

[5] Higuchi Y. Florigen and anti-florigen: flowering regulation in horticultural crops., 2018, 68(1): 109–118.

[6] Eshed Y, Lippman ZB. Revolutions in agriculture chart a course for targeted breeding of old and new crops., 2019, 366(6466): eaax0025.

[7] Kinoshita T, Ono N, Hayashi Y, Morimoto S, Nakamura S, Soda M, Kato Y, Ohnishi M, Nakano T, Inoue SI, Shimazaki KI.regulates stomatal opening., 2011, 21(14): 1232–1238.

[8] Krieger U, Lippman ZB, Zamir D. The flowering genedrives heterosis for yield in tomato., 2010, 42(5): 459–463.

[9] Navarro C, Abelenda JA, Cruz-Oró E, Cuéllar CA, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K, Prat S. Control of flowering and storage organ formation in potato by., 2011, 478(7367): 119–122.

[10] Lee R, Baldwin S, Kenel F, McCallum J, Macknight R.genes control onion bulb formation and flowering., 2013, 4: 2884.

[11] Abelenda JA, Bergonzi S, Oortwijn M, Sonnewald S, Du MR, Visser RGF, Sonnewald U, Bachem CWB. Source- sink regulation is mediated by interaction of an FT homolog with a SWEET protein in potato., 2019, 29(7): 1178–1186.e6.

[12] Bradley D, Ratcliffe O, Vincent C, Carpenter R, Coen E. Inflorescence commitment and architecture in., 1997, 275(5296): 80–83.

[13] Zhang B, Li CX, Li Y, Yu H. Mobile TERMINAL FLOWER1 determines seed size in., 2020, 6(9): 1146–1157.

[14] Corbesier L, Vincent C, Jang S, Fornara F, Fan QZ, Searle I, Giakountis A, Farrona S, Gissot L, Turnbull C, Coupland G. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of., 2007, 316(5827): 1030–1033.

[15] Tamaki S, Matsuo S, Wong HL, Yokoi S, Shimamoto K. Hd3a protein is a mobile flowering signal in rice., 2007, 316(5827): 1033–1036.

[16] Abe M, Kobayashi Y, Yamamoto S, Daimon Y, Yamaguchi A, Ikeda Y, Ichinoki H, Notaguchi M, Goto K, Araki T. FD, a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex., 2005, 309(5737): 1052–1056.

[17] Wigge PA, Kim MC, Jaeger KE, Busch W, Schmid M, Lohmann JU, Weigel D. Integration of spatial and temporal information during floral induction in., 2005, 309(5737): 1056–1059.

[18] Hanano S, Goto K.is involved in the regulation of flowering time and inflorescence development through transcriptional repression., 2011, 23(9): 3172–3184.

[19] Collani S, Neumann M, Yant L, Schmid M.modulates genome-wide DNA-binding of the bZIP transcription factor., 2019, 180(1): 367–380.

[20] Romera-Branchat M, Severing E, Pocard C, Ohr H, Vincent C, Née G, Martinez-Gallegos R, Jang S, Andrés F, Madrigal P, Coupland G. Functional divergence of theflorigen-interacting bZIP transcription factorsand., 2020, 31(9): 107717.

[21] Zhu Y, Klasfeld S, Jeong CW, Jin R, Goto K, Yamaguchi N, Wagner D. TERMINAL FLOWER 1-FD complex target genes and competition with FLOWERING LOCUS T., 2020, 11(1): 5118.

[22] Mao ZM. Early spring ephemeral plant area characteristics., 1992, 9(1): 11–12.

毛祖美. 早春短命植物區(qū)系特點(diǎn). 干旱區(qū)研究, 1992, 9(1): 11–12.

[23] Yuan SF, Tang HP. Research advances in the eco-physiological characteristics of ephemerals adaptation to habitats., 2010, 19(1): 240–247.

袁素芬, 唐海萍. 短命植物生理生態(tài)特性對生境的適應(yīng)性研究進(jìn)展. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 19(1): 240–247.

[24] Mao ZM, An ZX, Zhou GL, Yang CY, Han YL, Li XY, Zhang YF. Flora of Xinjiang (vol. 2, part 2). Urumqi: Xinjiang Science and Technology Health Press, 1995, 145–146.

毛祖美, 安爭夕, 周桂玲, 楊昌友, 韓英蘭, 李學(xué)禹, 張彥福. 《新疆植物志》(第二卷第二分冊). 烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社, 1995, 145–146.

[25] Huang XZ, Yang LF, Jin YH, Lin J, Liu F. Generation, annotation, and analysis of a large-scale expressed sequence tag library fromto explore salt-responsive genes., 2017, 8: 955.

[26] Jin YH, Liu F, Huang W, Sun Q, Huang XZ. Identification of reliable reference genes for qRT-PCR in the ephemeral plantbased on full-length transcriptome data., 2019, 9(1): 8408.

[27] Li XC, Kang KC, Huang XZ, Fan YB, Song MM, Huang YJ, Ding JJ.Genome-wide identification, phylogenetic analysis and expression profiling of the MKK gene familyin., 2020, 42(4): 403–421.

李曉翠, 康凱程, 黃先忠, 范永斌, 宋苗苗, 黃韻杰, 丁佳佳. 小擬南芥基因家族全基因組鑒定及進(jìn)化和表達(dá)分析. 遺傳, 2020, 42(4): 403–421.

[28] Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX., 2002, Chapter 2: Unit 2.3.

[29] Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0., 2013, 30(12): 2725–2729.

[30] Wang YP, Tang HB, DeBarry JD, Tan X, Li JP, Wang XY, Lee TH, Jin HZ, Marler B, Guo H, Kissinger JC, Paterson AH. MCScanX: a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity., 2012, 40(7): e49.

[31] Chen CJ, Chen H, Zhang Y, Thomas HR, Frank MH, He YH, Xia R. TBtools: an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data., 2020, 13(8): 1194–1202.

[32] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T)) method., 2001, 25(4): 402–408.

[33] Shannon P, Markiel A, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D, Amin N, Schwikowski B, Ideker T. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks., 2003, 13(11): 2498–2504.

[34] Michaels SD, Amasino RM.encodes a novel MADS domain protein that acts as a repressor of flowering., 1999, 11(5): 949–956.

[35] Hartmann U, H?hmann S, Nettesheim K, Wisman E, Saedler H, Huijser P. Molecular cloning of: a negative regulator of the floral transition in., 2000, 21(4): 351–360.

[36] Weigel D, Alvarez J, Smyth DR, Yanofsky MF, Meyerowitz EM.controls floral meristem identity in., 1992, 69(5): 843–859.

[37] Fowler S, Lee K, Onouchi H, Samach A, Richardson K, Morris B, Coupland G, Putterill J.: a circadian clock-controlled gene that regulates photoperiodic flowering inand encodes a protein with several possible membrane-spanning domains., 1999, 18(17): 4679–4688.

[38] Peng FY, Hu ZQ, Yang RC. Genome-wide comparative analysis of flowering-related genes in arabidopsis, wheat, and barley., 2015, 2015: 874361.

[39] Nakagawa M, Shimamoto K, Kyozuka J. Overexpression ofand, rice/homologs, confers delay of phase transition and altered panicle morphology in rice., 2002, 29(6): 743–750.

[40] Liu YY, Yang KZ, Wei XX, Wang XQ. Revisiting the phosphatidylethanolamine-binding protein (PEBP) gene family reveals crypticgene homologs in gymnosperms and sheds new light on functional evolution., 2016, 212(3): 730–744.

[41] Zhang TC, Qiao Q, Novikova PY, Wang Q, Yue JP, Guan YL, Ming SP, Liu TM, De J, Liu YX, Al-Shehbaz IA, Sun H, Van Montagu M, Huang JL, Van de Peer Y, Qiong L. Genome of, a close relative of, shows ecological adaptation to high altitude., 2019, 116(14): 7137–7146.

[42] Mager WH. Control of ribosomal protein gene expression., 1988, 949(1): 1–15.

[43] Van Minnebruggen A, Neyt P, De Groeve S, Coussens G, Ponce MR, Micol JL, Van Lijsebettens M. Themutation identified the ribosomal protein genewith a role in cell expansion during organ growth., 2010, 138(1): 91–101.

[44] Danilevskaya ON, Meng X, Hou ZL, Ananiev EV, Simmons CR. A genomic and expression compendium of the expanded PEBP gene family from maize., 2008, 146(1): 250–264.

[45] Kobayashi Y, Kaya H, Goto K, Iwabuchi M, Araki T. A pair of related genes with antagonistic roles in mediating flowering signals., 1999, 286(5446): 1960–1962.

[46] Bradley D, Carpenter R, Copsey L, Vincent C, Rothstein S, Coen E. Control of inflorescence architecture in., 1996, 379(6568): 791–797.

[47] Conti L, Bradley D. TERMINAL FLOWER1 is a mobile signal controllingarchitecture., 2007, 19(3): 767–778.

[48] Chung KS, Yoo SY, Yoo SJ, Lee JS, Ahn JH.(), a member of the/family, shows distinct pattern of expression during the vegetative growth of., 2010, 5(9): 1102–1104.

Genome-wide identification and expression analysis of thegenes in

Yongguang Li1,2, Yuhuan Jin1, Li Guo1, Hao Ai2, Ruining Li2, Xianzhong Huang2,3

The members of the phosphatidylethanolamine-binding protein (PEBP) family harbor a conserved phosphatidylethanolamine-binding protein domain, of which the FT and TFL1 proteins constitute a plant florigen-antiflorigen system regulating flowering time and plant structure.is an early spring and ephemeral plant, which grows in the southern boundary of the Gulban Tonggut desert and has a good adaptability to the extreme environment. In this study, a genome-wide identification revealed that thegenome contains 11genes (one, two, two, two, two, and two), all of which consist of four exons and three introns. Collinearity analysis showed that there are 11 pairs of collinearity relationships betweenand, and,respectively. The PEBP gene family obviously has expanded in thegenome, with duplication ofgenes in the forms of whole genome duplication/segmental duplication. Tissue expression analysis showed thatwas highly expressed in seeds;andwere mainly expressed in flowers and siliques;was highly expressed in shoot apex; andwas highly expressed in roots. In addition, the expression profiles ofgenes under four abiotic stresses were also analyzed in this study. The results revealed thatgenes were generally up-regulated under drought stress (10% PEG6000) and were generally down-regulated under low temperature (4℃) stress. Under salt stress (250 mmol/L NaCl),/were down-regulated,/were initially down-regulated and then up-regulated; and/were strikingly up-regulated. Under high temperature (40℃) stress, the expressions of/and/were significantly down-regulated, but/were noticeably up-regulated. Collectively,/expressions were significantly up-regulated under salt, drought, and heat stresses. Protein interaction network analysis showed thatPEBP proteins interacted with proteins in flowering pathways and ribosomal proteins. These results suggested thatgenes play an important role(s) in the regulation of growth, development, and flowering transition ofin response to desert adversities.

ephemeral plant;; flowering transition; PEBP; adversity

2021-08-24；

2021-11-15；

2022-01-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：U1303302)，石河子大學(xué)國際科技合作項(xiàng)目(編號：GJHZ201806)和安徽科技學(xué)院學(xué)科帶頭人引進(jìn)人才啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(編號：NXYJ202001)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. U1303302), the International Science and Technology Cooperation Project of Shihezi University (No. GJHZ201806) andthe Talent Introduction Start-up Fund Project of Anhui Science and Technology University (No. NXYJ202001)]

李永光，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: zongheng1476408@163.com

黃先忠，博士，教授，研究方向：植物響應(yīng)逆境生理生態(tài)適應(yīng)的分子機(jī)制。E-mail: huangxz@ahstu.edu.cn

10.16288/j.yczz.21-305

(責(zé)任編委: 孔凡江)