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    4種外用方劑對DNFB致小鼠慢性濕疹的影響

    2022-02-12 09:50:12吳白芬何芳雁周志宏浦仕彪
    關鍵詞:藥組濕疹小鼠

    吳白芬,尚 李,尚 怡,劉 錄,何芳雁,周志宏,浦仕彪

    (云南中醫(yī)藥大學 云南省高校中藥飲片工程研究中心,云南 昆明 650500)

    現代社會造就了許多新物質,方便人們生活的同時也引入了諸多過敏原,導致越來越多的遲發(fā)型變態(tài)反應,最常見和多發(fā)的就是反復發(fā)作、遷延不愈的濕疹[1-2].濕疹劇烈瘙癢嚴重影響生活質量.嬰幼兒由于機體免疫系統發(fā)育不成熟,皮膚屏障功能不完善,更容易發(fā)生大面積濕疹,而大劑量使用糖皮質激素和抗組胺藥物的對癥治療對患兒生長發(fā)育構成潛在安全隱患,極大地增加了家長的精神負擔,迫切需要尋找更安全、有效的治療手段[3-5].中醫(yī)藥外治嬰幼兒濕疹作用直接、療程短、副反應小,可緩解臨床癥狀,有效改善皮損,避免外用激素的不良反應,并在一定程度上可控制疾病復發(fā),故越來越受到重視[6].本文采用DNFB復制小鼠慢性濕疹模型,探討4種臨床驗方對濕疹的療效及初步作用機制,為臨床應用和深度開發(fā)提供實驗依據.

    1 實驗材料

    1.1 受試樣品

    方劑1(1#),由顯齒蛇葡萄、桑白皮及三七等組成;方劑2(2#),由顯齒蛇葡萄、桑白皮及全蝎等組成;方劑3(3#),由白鮮皮、紫草及全蝎等組成;方劑4(4#),由顯齒蛇葡萄、白鮮皮、紫草、桑白皮、三七及全蝎等組成.取各處方藥材,分別加水煎煮3次,合并濾液濃縮至含生藥濃度依次為0.84、0.80、0.80、1.04 g/mL,于4~8 ℃ 冷藏備用.實驗時,各受試藥液分別稀釋5、10倍作為高、低劑量.

    1.2 陽性對照

    復方醋酸地塞米松乳膏(999皮炎平),華潤三九醫(yī)藥股份有限公司(1706004H),直接取適量涂于小鼠局部皮膚.兒膚康搽劑,成都森科制藥有限公司(170807),稀釋2倍為中藥對照的濃度.

    1.3 實驗動物

    雄性ICR小鼠,6~8周齡,體重24~26 g,成都達碩實驗動物有限公司, 生產許可證:SCXK(川)2015-030;飼養(yǎng)于IVC動物實驗室,溫度20~25 ℃,濕度40%~70%,照明 12 h:12 h 明暗交替,照度150~300 lx,噪音≤60 dB,使用許可證:SYXK(滇)K2018-0005.

    1.4 主要試劑

    2,4-二硝基氟苯(DNFB),中國醫(yī)藥(集團)上?;瘜W試劑公司(F20120726);橄欖油,國藥集團化學試劑有限公司(20160912);丙酮,天津市富宇精細化工有限公司(20160626).甲醛,廣東光華科技股份有限公司(20171018);磷酸二氫鈉(20151222)、磷酸氫二鈉(20170204),天津市風船化學試劑科技有限公司. IFN-γ、IL- 10 、IL- 2試劑盒(2018010),北京四正柏生物科技有限公司;IL- 6試劑盒(T10017038),武漢華聯科生物技術有限公司.

    1.5 主要儀器

    ADVENURERTM電子天平,奧豪斯儀器(上海)有限公司;全波長酶標儀,ThermoFisher集團;Biofuge冷凍離心機,Thermo公司;Milli-Q超純水機,Merch Millipore德國;XK96-A快速混勻器,江蘇新康醫(yī)療器械有限公司.

    2 統計學處理

    采用SPSS17統計軟件,計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析法;方差齊采用LSD法檢驗,方差不齊采用Tamhane′s法檢驗;P<0.05有統計學意義,P<0.01有顯著統計學意義.

    3 實驗方法

    3.1 模型制備與給藥

    選取24~26 g 雄性小鼠,實驗前日(0 d)腹部剪毛、背部脫毛約 2 cm×3 cm,除隨機抽取10只脫毛小鼠為正常對照外,其余各鼠均于腹部涂抹2%的DNFB溶液 0.1 mL,試驗當日(1 d)再強化致敏1次.將造模小鼠隨機分為11組,見表1.各組動物于2次致敏后 4 h 開始于背部脫毛處及雙耳內外涂布給藥,每日2次,連續(xù) 21 d.第6天上午給藥后 1 h,除正常對照組外各組小鼠均用0.5%DNFB 50 μL 于背部脫毛處均勻涂抹進行攻擊,以后每5天重復上述激發(fā)過程,共激發(fā)3次.末次激發(fā)后5日給藥 1 h 后,用0.5% DNFB 30 μL 涂抹小鼠右耳內外,左耳涂抹 30 μL 丙酮-橄攬油溶液為對照,6 h 后再次涂耳給藥1次.耳部激發(fā) 24 h 后眼眶取血、取雙耳和胸腺及脾臟,分別用于相關指標檢測.

    3.2 觀察指標測定

    試驗期間,觀察模型制備前后對各組小鼠體重、毛色、飲食、活動等一般狀況有無影響.每次激發(fā)后 2 d,對小鼠背部接觸性皮炎癥狀進行評分(標準:有結痂及滲出為4分;有明顯紅斑、水腫及滲出為3分;紅斑、水腫伴少量滲出為2分;輕度紅斑、水腫無滲出為1分;正常為0).耳部激發(fā)后 24 h 眼眶采血,3 000 r/min 離心 10 min,分離血清,測定IFN-r、IL-2、IL-10、IL-6水平.取血后脫頸椎處死小鼠,沿雙耳基線剪下耳片,用 8 mm 打孔器于雙耳同部位等面積切下,稱重,以2耳片重量之差作為腫脹度;取背部皮膚及右耳置入10%福爾馬林溶液中固定,用于病理組織學檢查;摘取胸腺、脾臟稱重,計算臟器系數.

    4 試驗結果

    4.1 一般觀察

    與正常組相比,模型組小鼠激發(fā)后背部皮膚大面積紅斑,并逐漸增厚、粗糙、干燥,有血痂,常搔抓、躁動;與模型組相比,各給藥組小鼠皮膚紅斑及增厚減輕,少干燥,較安靜;皮炎平組小鼠較模型組皮膚明顯變薄,有皺褶現象,紅斑明顯,激發(fā)部位無毛發(fā)生長,結果見表1.

    由表1可見,首次激發(fā)后 2 d,模型組小鼠背部皮膚損傷的評分顯著高于正常對照組,除皮炎平組能明顯降低模型小鼠皮膚評分外,其余各給藥組與對照組相比均無統計學差異;2次激發(fā)后,模型組小鼠皮膚損傷評分持續(xù)升高,除1#、2#和4#高劑量組僅有作用趨勢外,其余各組均能明顯降低模型小鼠的皮膚評分;3次激發(fā)后,模型組小鼠皮膚損傷評分繼續(xù)升高,所有給藥組均能明顯降低模型小鼠的皮膚評分.給藥結束,除皮炎平組小鼠體重比模型組明顯減輕外,其余各組體重與模型組相比無明顯差異.

    表1 對慢性濕疹小鼠皮損評分及體重的影響

    4.2 對耳腫脹度及免疫器官系數的影響

    與模型組相比,各給藥組連續(xù)局部涂藥 21 d,均可顯著抑制DNFB誘導小鼠的耳腫脹,不同程度降低胸腺系數和脾臟系數.其中,除2#高劑量和兒膚康組外,各給藥組均能明顯降低模型小鼠的胸腺系數;除皮炎平、兒膚康、1#和4#高劑量組能明顯降低脾臟系數外,其余各組對脾臟系數僅有降低趨勢而無統計學意義,詳見表2.

    4.3 對血清細胞因子的影響

    與模型組相比,所有給藥組均能明顯降低模型動物的IFN-γ和IL-6水平;不同程度提高IL-10水平,除兒膚康和4#樣品高劑量組對IL-10水平的提升作用接近統計學差異外,其余給藥組均能明顯提高模型小鼠血清IL-10水平,但對IL-2水平無明顯影響,詳見表3.

    表2 對慢性濕疹小鼠耳廓腫脹度及免疫器官系數的影響

    表3 對慢性濕疹小鼠血清細胞因子的影響

    4.4 組織病理學檢查

    4.4.1 耳廓皮膚病理改變

    由圖1可見,對照組小鼠耳廓皮膚鱗狀上皮、角化層、皮下組織均正常;與正常組相比,模型組鱗狀上皮增厚,細胞明顯水腫,真皮層大面積重度水腫、增厚,血管明顯擴張充血,大量炎癥細胞彌漫性浸潤;各給藥組能減輕炎癥細胞的浸潤,改善耳片組織病理學,表現為:耳廓組織水腫及增厚面積較小,血管擴張及充血較輕,炎細胞彌漫性浸潤較模型組有不同程度減輕.

    4.4.2 背部皮膚病理改變

    由圖2可見,對照組小鼠背部皮膚組織結構正常,未見增厚及炎細胞浸潤等病理改變;與正常對照組相比,模型組可見表皮增厚明顯,角質層、棘層、顆粒層明顯增厚,且表皮突明顯下延,角質層角化過度,真皮層毛細血管擴張充血及炎細胞大量浸潤;各給藥組皮損病變均較模型組明顯減輕,表現為:表皮、角質層、棘層、顆粒層增厚及炎細胞浸潤程度較模型組有所減輕.

    圖1 耳廓皮膚組織病理學檢查結果(HE 10×)

    圖2 皮膚組織病理學檢查結果(HE 10×)

    5 討論與小結

    嬰兒濕疹是一種慢性反復發(fā)作的炎癥性皮膚病,Th1 /Th2 免疫功能失衡是導致濕疹發(fā)生的關鍵因素[9].正常情況下 Th1細胞和Th2 細胞處于一種動態(tài)平衡狀態(tài).但在諸多復雜因素刺激下,Th1/Th2 細胞亞群會失去平衡,引起免疫調節(jié)機制紊亂[10],所產生的炎癥因子會對靶器官造成一定損害,從而導致相關疾病的發(fā)生[11],如誘發(fā)濕疹.Th1細胞是遲發(fā)超沒反應中的效應T細胞,Th2 細胞的主要作用是增強B細胞介導的體液免疫應答,兩者均在皮膚變態(tài)反應中發(fā)揮重要作用,表現為Th1細胞的因子(如IL-2、TNF-α、IFN-γ等)升高,Th2細胞的因子(如IL-4、IL-6、IL-10等)降低,且Th1/Th2 的失衡與疾病的嚴重程度相關[12].所以可以通過檢測Th1/Th2 的失衡情況衡量濕疹的轉歸.本研究成功復制DNFB誘發(fā)小鼠慢性濕疹模型,對4種臨床使用的經驗方進行藥效學考察,發(fā)現各方劑樣品均可明顯抑制慢性濕疹模型小鼠的耳組織腫脹(炎癥),改善背部皮膚及耳片皮膚組織的病理學變化,抑制胸腺和脾臟系數,降低血液中IFN-γ和IL-6的水平,提高抑制免疫反應的IL-10水平,提示其對慢性濕疹的治療作用機制可能與對免疫器官的抑制及調節(jié) Th1/Th2 細胞亞群的平衡有關,其深入的作用機制有待于進一步研究.

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