大麻素受體CB1對子宮腺肌病子宮內膜-肌層交界區(qū)平滑肌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制

汪沙,段華,郭正晨,沈雪,李博涵

子宮腺肌病為婦科常見的雌激素依賴性疾病，其本質為子宮內膜異位至子宮肌層，發(fā)病機制不清[1]。隨著對保留生育和生理功能要求的增加，子宮腺肌病靶向治療成為婦科臨床研究的熱點[2]。近年來，隨著對子宮腺肌病病因機制研究的深入，發(fā)現(xiàn)子宮內膜-肌層交界區(qū)(endometrial-myometrial interface,EMI)的結構與功能異常，與子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展密切相關[3-4]。子宮腺肌病中子宮內膜直接侵入與之緊密相連的子宮肌層，致使EMI平滑肌細胞反應性增生、細胞間距擴大、細胞正常排列被破壞，導致EMI不規(guī)則增厚[5]。但引起EMI平滑肌細胞異常增殖的具體機制尚不清楚。

內源性大麻素是上世紀90年代初期，人們通過對大麻中的主要精神活性物質△9-四氫大麻酚(△9-tetrahydrocannabinol，△9-THC)作用機制的研究所發(fā)現(xiàn)。大量研究表明，內源性大麻素可通過與受體結合觸發(fā)不同的信號傳導通路，發(fā)揮多種病理生理作用，如炎癥調節(jié)、纖維化、痛覺調控、抗腫瘤、性腺功能和生殖調控等[6-8]，并已成為國際上關注的熱點。I型大麻素受體(cannabinoid receptor 1,CB1)屬于G蛋白耦聯(lián)受體，是目前公認的內源性大麻素的兩大受體之一，也是其發(fā)揮生物學效應的主要配體。AM251和ACEA分別為CB1受體的選擇性拮抗劑和激動劑，在多種體內外實驗中用作CB1受體的干預藥物[9]。既往報道顯示CB1參與了子宮內膜異位癥痛覺的調控[10]、病變部位神經(jīng)和病灶生長[11]及小鼠子宮和人孕期子宮肌層收縮的調控[12]。此外，在生殖領域亦發(fā)現(xiàn)CB1較CB2有著更為重要的作用[13]，然而CB1在子宮腺肌病中的研究尚未見報道。因此，本研究擬原代培養(yǎng)腺肌病組和對照組EMI平滑肌細胞，通過對細胞CB1受體行藥理學干預以觀察CB1對EMI平滑肌細胞增殖凋亡能力及相關信號通路的影響，探討大麻素受體CB1在子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料來源及分組

選擇2017年7月至2018年8月期間于首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心因子宮腺肌病行開腹或腹腔鏡全子宮切除術的16例患者的子宮標本作為腺肌病組，平均(45.2±3.6)歲，同期因宮頸上皮內瘤變III級、宮頸癌IA期等切除子宮的11例非子宮腺肌病的患者的子宮標本為對照組，平均(43.7±4.4)歲。所有子宮標本均經(jīng)病理檢查，證實腺肌病組為子宮腺肌病，對照組子宮肌層無異常。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會同意(No.2016-KY-012)，患者的病例信息采集及標本收集均于術前獲得患者充分的知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織取材 子宮切除后立即進行組織取材，于無菌條件下自子宮前壁“Y”字型剖開，于子宮體前壁靠近宮底處切取內膜下約0.5 cm×1 cm×1 cm大小的EMI平滑肌組織2塊，置于冷D-Hank’s液(內含青霉素1 000 U/mL,鏈霉素1 000 U/mL)后行平滑肌細胞培養(yǎng)及鑒定，具體方法參考本課題組已發(fā)表文獻[14]。

1.2.2 蛋白印跡法檢測兩組細胞中CB1蛋白及通路蛋白的表達 收集腺肌病組和對照組EMI平滑肌細胞，用蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白樣品濃度。等量的蛋白經(jīng)10% 十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠 (PAGE)電泳后轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(鼠抗人Cell Signaling Tchnology)4℃過夜。次日洗膜后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后，將膜置于增強化學發(fā)光(ECL)法檢測試劑中，凝膠成像系統(tǒng)顯影，以目的蛋白條帶灰度值與內參照蛋白β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.2.3 CCK8檢測AM251、ACEA處理后腺肌病EMI平滑肌細胞增殖情況 分別取3～6代對數(shù)生長期的腺肌病組EMI平滑肌細胞，予胰酶消化后離心收集細胞，制成細胞懸液并細胞計數(shù)，調整濃度后按照4 000個/孔接種于96孔板中，每孔100 μL體積。置于37°C,100%飽和濕度和JP5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進行藥理學干預。加入預先用無血清無酚紅培養(yǎng)基配好10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、5×10-6mol/L的AM251溶液和10-7mol/L、10-6mol/L、5×10-6mol/L、10-5mol/L的ACEA溶液，另設對照孔(培養(yǎng)基+細胞)和空白孔(僅培養(yǎng)基)，每孔100 μL體積，同時設5個復孔。置于培養(yǎng)箱孵育12 h后向每孔加入10 μL的CCK8溶液。繼續(xù)孵育4 h后酶標儀下測定各孔在450 nm處的吸光度OD。增殖率=[(實驗孔OD-空白孔OD)/(對照組OD-空白孔OD)]×100%。抑制率=1-增殖率=[(對照孔OD-實驗孔OD)/(對照組OD-空白孔OD)]×100%。GraphPad Prism 6.0軟件計算出AM251的半效抑制濃度IC50。隨后，無血清無酚紅培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后實驗孔根據(jù)標記依次換用無血清無酚紅培養(yǎng)基、10-6mol/L的AM251溶液、5×10-6mol/L的ACEA、10-6mol/L的AM251溶液預處理30 min后+5×10-6mol/L的ACEA，另設對照孔(培養(yǎng)基+細胞)和空白孔(僅培養(yǎng)基)，每孔100 μL體積，同時設5個復孔。后續(xù)步驟同上。實驗重復3次。

1.2.4 蛋白印跡法檢測腺肌病組進行藥理學干預后CB1及通路蛋白表達 取3～6代對數(shù)生長期的腺肌病組EMI平滑肌細胞按濃度為2×105個/孔接種于60 mm培養(yǎng)皿中，每孔5 mL體積，相同條件下培養(yǎng)24 h后，分別加入無血清無酚紅培養(yǎng)基、10-6mol/L的AM251溶液、5×10-6mol/L的ACEA、10-6mol/L的AM251溶液預處理30 min后+5×10-6mol/L的ACEA，每孔5 mL體積，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后檢測CB1和通路蛋白表達，方法同上。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組子宮內膜-肌層交界區(qū)平滑肌細胞CB1蛋白及增殖凋亡相關通路蛋白表達的比較

以目的蛋白條帶CB1和內參β-actin灰度值進行半定量，得到CB1蛋白在腺肌病EMI平滑肌細胞中的相對表達量(0.64±0.16)與對照組EMI平滑肌細胞(0.50±0.11)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018)，詳見圖1。

行AKT和Erk1/2凋亡通路蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，腺肌病組和對照組細胞間總AKT和總Erk1/2的表達量相當，而p-AKT和p-Erk1/2表達量差異明顯。其中，p-AKT/AKT在腺肌病組細胞為(0.48±0.08)，高于對照組(0.27±0.08)；p-Erk/ Erk在腺肌病組細胞為(2.17±0.82)，高于對照組(1.18±0.35)，腺肌病組和對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(p-AKT/AKT的P=0.004，p-Erk/ Erk的P=0.036)，詳見下頁圖1。

注：A：各蛋白的特征性條帶；B：兩組細胞間CB1蛋白表達量的比較；C：兩組細胞間p-AKT/AKT值的比較；D：兩組細胞間p-Erk/ Erk值的比較，*P<0.05。圖1 細胞CB1、AKT、p-AKT、Erk1/2、p-Erk1/2蛋白的表達

2.2 藥理學干預CB1受體對腺肌病子宮內膜-肌層交界區(qū)平滑肌細胞增殖的影響

CCK8結果顯示，CB1受體拮抗劑AM251可抑制腺肌病EMI平滑肌細胞體外增殖，其作用有劑量依賴性，即隨藥物濃度的加大，抑制作用逐漸增強、細胞存活率逐漸下降。各用藥組與未用藥組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(下頁圖2A)。通過回歸分析，計算得出AM251對腺肌病EMI平滑肌細胞的IC50為6.931×10-7mol/L(下頁圖2B)，故后續(xù)實驗中AM251濃度選擇10-6mol/L。

注：A：不同濃度AM251作用后細胞的存活率；B：不同濃度AM251對細胞的抑制率，50%抑制率對應的X軸上的點即半效抑制濃度IC50以10為底的對數(shù)；C：不同濃度ACEA作用后細胞的存活率；D：不同藥物作用后細胞存活率的比較。(Log10 M,摩爾濃度以10為底的對數(shù)；*,P<0.05,**,P<0.01,***,P<0.001,****,P<0.0001)。圖2 藥理學干預CB1對腺肌病子宮EMI平滑肌細胞增殖的影響

相反，CB1受體激動劑ACEA可促子宮EMI平滑肌細胞體外增殖，予10-7mol/L、10-6mol/L、5×10-6mol/L的ACEA溶液處理后，細胞存活率逐漸上升，而10-5mol/L的ACEA處理組細胞存活率(159.4±8.6)%，較5×10-6mol/L濃度組(171.1±10.86)%有下降趨勢(下頁圖2C)，故后續(xù)實驗ACEA濃度選擇5×10-6mol/L。

為進一步明確CB1受體的作用，我們依次予無血清無酚紅培養(yǎng)基、10-6mol/L的AM251溶液、5×10-6mol/L的ACEA、10-6mol/L的AM251溶液預處理30 min后+5×10-6mol/L的ACEA分4組對細胞進行藥理學干預CB1受體。通過CCK8檢測發(fā)現(xiàn)，單獨用ACEA組細胞存活率為(169.9±18.3)%，單獨用AM251組為(41.5±3.5)%，與培養(yǎng)基對照組(將對照組設為100%)相比，差異均有統(tǒng)計學意義(ACEA組P<0.001，AM251組P<0.001)。而聯(lián)合用藥組細胞存活率(103.4±11.5)%，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)(下頁圖2D)。

2.3 藥理學干預CB1受體對腺肌病子宮內膜-肌層交界區(qū)平滑肌細胞凋亡的影響

流式結果顯示，CB1受體拮抗劑AM251作用于平滑肌細胞后，細胞凋亡率為(32.75±13.00)%，較未用藥組(12.89±4.16)%明顯增加，而CB1受體激動劑ACEA作用后的凋亡率降至(8.08±1.86)%。單獨用ACEA組和AM251組與未用藥組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(ACEA組P=0.003,AM251組P=0.014)，而聯(lián)合用藥組細胞凋亡率(11.04±2.90)%與未用藥組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(下頁圖3)。

注：A：依次為無血清無酚紅培養(yǎng)基、10-6 mol/L的AM251溶液、5×10-6 mol/L的ACEA、10-6 mol/L的AM251溶液預處理30 min后再加5×10-6 mol/L的ACEA作用后細胞的流式圖；B：不同藥物作用后細胞凋亡率(右上象限+右下象限)的比較(*,P<0.05)。圖3 藥理學干預CB1對腺肌病EMI平滑肌細胞凋亡的影響

2.4 藥理學干預CB1受體對腺肌病子宮內膜-肌層交界區(qū)平滑肌細胞中CB1及增殖凋亡相關通路蛋白表達的影響

將各目的蛋白條帶灰度值和內參灰度值進行半定量。結果顯示，ACEA能升高體外培養(yǎng)的腺肌病EMI區(qū)平滑肌細胞CB1蛋白、磷酸化AKT及MAPKs家族中ERK1/2的磷酸化水平，分別與未用藥組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(CB1蛋白P=0.035，p-AKT/AKT的P<0.001,p-Erk/ Erk的P=0.039)。而AM251使其下調，與未用藥組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(CB1蛋白P=0.034，p-AKT/AKT的P=0.044，p-Erk/ Erk的P=0.018)。而聯(lián)合用藥組與未用藥組差異均無統(tǒng)計學意義(CB1蛋白P=0.992，p-AKT/AKT的P=1.0，p-Erk/ Erk的P=0.696)詳見下頁圖4。

注：A：各蛋白的特征性條帶；B：各組細胞間CB1蛋白表達量的比較；C：細胞間p-AKT/AKT值的比較；D：細胞間p-Erk/ Erk值的比較，*P<0.05。圖4 藥理學干預CB1對腺肌病EMI平滑肌細胞CB1、AKT、p-AKT、Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表達的影響

3 討論

3.1 腺肌病子宮內膜-肌層交界區(qū)平滑肌細胞的異常增生

EMI的概念源自于正常子宮肌層在超聲和磁共振下可明顯分為3層的影像學表現(xiàn)，即高信號強度子宮內膜、低信號強度EMI和中信號強度外肌層3層，而腺肌病的存在可以改變或者扭曲這些層次的超聲影像[15]。因此，EMI的改變成為腺肌病影像學診斷的重要依據(jù)[16- 17]，而腺肌病影像學檢查中的特征性表現(xiàn)——彌漫性均質的低回聲則歸因于平滑肌細胞的增生。本課題組前期的研究結果發(fā)現(xiàn)，腺肌病組EMI區(qū)平滑肌細胞的體外增生能力強于對照組細胞，直接從組織學層面解釋了腺肌病EMI異常增厚的原因。

3.2 體外培養(yǎng)腺肌病組子宮內膜-肌層交界區(qū)平滑肌細胞CB1和通路蛋白的表達上調

進一步研究發(fā)現(xiàn)，腺肌病組EMI區(qū)平滑肌細胞CB1蛋白表達均顯著高于對照組。既往有研究報道，腺肌病子宮存在明顯的肌細胞肥大，豐富的中間絲形成胞質集合體，細胞核輪廓清晰，核仁及其周圍排列的核染色質明顯，胞質內粗面內質網(wǎng)和高爾基體更為突出,表明蛋白合成更為活躍,且所有的這些特征都在EMI區(qū)更為顯著[5]。這可能是本實驗觀察到的腺肌病組細胞CB1表達上調的物質基礎，也是腺肌病組EMI區(qū)平滑肌細胞肥大的理論基礎。為了進一步明確腺肌病組和和對照組細胞體外增殖能力差異的可能原因，我們觀察了兩組細胞中AKT和MAPK/Erk通路蛋白的表達水平。AKT和MAPK/Erk通路作為細胞增殖凋亡相關的兩大主要通路，被廣泛證實參與了多種細胞的異常增殖過程，如子宮肌瘤細胞[18]、子宮內膜異位癥中異位內膜細胞及多種癌細胞[19]的增殖。本研究的結果證實異?；罨腁KT和MAPK/Erk通路存在于異常增殖的腺肌病子宮EMI平滑肌細胞中。

3.3 CB1受體激活對腺肌病子宮內膜-肌層交界區(qū)平滑肌細胞體外增殖能力的促進作用

通過CCK8試驗，我們發(fā)現(xiàn)CB1受體拮抗劑AM251呈劑量依賴性抑制腺肌病EMI平滑肌細胞的體外增殖，隨著藥物濃度的加大，細胞存活率逐漸下降，而當預先用AM251處理后再用ACEA，細胞的存活率與未用藥組相當，提示AM251可完全拮抗ACEA對CB1的藥理激活作用，這點與Eckardt K等[20]的報道基本一致，在人骨骼肌細胞中AM251亦可完全阻斷四烯酸乙醇胺(AEA，內源性大麻素的一種)的作用。子宮內膜異位癥動物模型中的研究也提示，CB1受體的激活促進大鼠子宮內膜異位病灶神經(jīng)生長[13]及小鼠子宮內膜異位癥模型的病灶生長[21]。這些均提示CB1受體的激活與細胞的增殖能力增強密切相關，與本研究的結果一致。

3.4 CB1受體激活對腺肌病子宮內膜-肌層交界區(qū)平滑肌細胞體外凋亡能力的抑制作用

本研究發(fā)現(xiàn)，選擇性CB1受體拮抗劑AM251可促進腺肌病EMI平滑肌細胞的凋亡，并可完全阻斷其激動劑ACEA的抑凋亡作用。既往有關CB1受體在細胞凋亡中作用的研究報道亦提示了CB1受體對細胞凋亡的調控作用。Crunfli F等[22]發(fā)現(xiàn)ACEA處理可通過上調凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達促進神經(jīng)細胞的存活，Carpi S等[23]報道AM251通過下調凋亡抑制蛋白Bcl-2和survivin的表達及上調Bax的表達誘導人黑色素瘤A375細胞的凋亡。而在前列腺癌中的研究顯示，內源性大麻素AEA和2-花生四烯酰甘油(2-arachidonoylglycer,2-AG)可通過激活CB1受體上調活化的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶caspase-3及下調Bcl-2的表達促進癌細胞的凋亡[24]。但是除去各類型細胞之間的本質差異外，各研究采用的大麻素及其相關制劑均不同，實驗的有效濃度和涉及的受體亦不同，尚需更深入的研究來闡明大麻素及其受體的作用。

3.5 藥理學干預CB1受體對腺肌病子宮內膜-肌層交界區(qū)平滑肌細胞AKT和MAPK/Erk通路的影響及其意義

目前，大麻素在體內發(fā)揮生物學作用的機制尚未完全闡明，但是有大量研究認為大麻素受體的激活可能通過以下途徑促使大麻素發(fā)揮作用[25]：① 大麻素受體偶聯(lián)磷脂酶C和A介導Ca2+內流；② 對離子通道的調節(jié)，如電壓門控Ca2+通道、G蛋白偶聯(lián)受體內部整流K+通道；③ 介導環(huán)腺苷酸cAMP和一氧化氮的產(chǎn)生；④ 通過MAPKs通路，包括Erk,p38 MAPK和Jun 氨基末端激酶 (JNK)等，及磷脂酰肌醇3激酶PI3K/Akt等信號通路的介導。本研究證實，異常增殖的腺肌病EMI平滑肌細胞中存在CB1表達的上調，AKT和MAPK/Erk通路的異常激活，CB1受體的激活可以促進腺肌病EMI平滑肌細胞的體外增殖。與此同時，這些結果提示CB1受體對EMI平滑肌細胞的作用可通過激活AKT和MAPK/Erk信號通路介導，而選擇性CB1受體拮抗劑AM251對子宮腺肌病有潛在的治療作用。CB1在細胞內發(fā)揮作用的機制多樣，具體因細胞及作用類型而異。在子宮內膜異位癥中的研究發(fā)現(xiàn)，大麻素可通過激活CB1受體活化PI3K和Erk1/2信號通路促進內膜間質細胞的遷移[9]，提示CB1受體抑制劑對子宮內膜異位癥的潛在治療作用，與本文的結果基本一致。而在神經(jīng)祖細胞中也曾有學者清楚地描述了CB1所介導的AKT和Erk1/2通路活化的分子機制[26]。具體而言，Erk活化是由于CB1與異源三聚體Gi/o蛋白的偶聯(lián)并降低cAMP水平從而在一定程度上阻斷蛋白激酶A對Raf-1的抑制作用所致，而PI3K活化是Gβγ依賴性機制。這些均提示，CB1受體與AKT和MAPK/Erk通路有著千絲萬縷的聯(lián)系，其通過這些通路的活化或抑制在體內發(fā)揮著多種生物學作用，但具體機制尚需更多的研究證實。

綜上所述，本研究已經(jīng)證實腺肌病組EMI平滑肌細胞增殖能力的增強與AKT和MAPK/Erk通路的激活有關。大麻素受體CB1作為內源性大麻素發(fā)揮作用的主要受體，可通過激活AKT和MAPK/Erk信號通路促進腺肌病EMI平滑肌細胞的體外增殖并抑制其凋亡。本研究為進一步明確子宮腺肌病的病因與病理機制，延緩腺肌病發(fā)生發(fā)展提供潛在治療靶點。