畜禽糞污中7種磺胺類和8種氟喹諾酮類獸藥殘留UPLC-MS/MS檢測方法研究

宋艷紅，李燕秀，馮俊吾*，武晉孝，趙平偉，張 薇，米彥飛，郭 禹，馬晉東

(1.山西省檢驗檢測中心，太原 030027；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷 030801)

磺胺類和氟喹諾酮類廣譜抗菌藥作為畜牧業(yè)投入品，被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中，除治療外，還可預(yù)防、促生長，提升動物源食品產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。然因此類獸藥在畜禽體內(nèi)不能被完全吸收、代謝和降解，大部分殘留藥物及代謝物會隨著畜禽糞污排出體外，進入自然環(huán)境中，這些同樣具有生物活性[2]的殘留藥物及代謝產(chǎn)物，會對環(huán)境、動植物和人體造成直接或者間接的危害。隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；⒓s化飛速發(fā)展，我國畜禽糞污量同比大幅增加。據(jù)統(tǒng)計，目前我國年產(chǎn)畜禽糞污已達40億噸[3]，畜禽糞污中獸藥殘留污染問題已經(jīng)成為一個不容忽視的問題。因此，為了更好地掌握畜禽糞污中殘留獸藥的現(xiàn)狀，有必要建立一種方便、高效、準(zhǔn)確的畜禽糞污多獸藥殘留檢測方法。目前，獸藥殘留檢測方法通常有液相色譜法、微生物法、電化學(xué)檢測、免疫分析法、高效液相色譜-質(zhì)譜法、生物芯片法等[4]。與其他檢測方法相比，超高效液相色譜-質(zhì)譜進行檢測具有較高的特異性和靈敏度，抗干擾能力強，定量分析及定性分析更為準(zhǔn)確[5-7]。因此，本文擬利用固相萃取及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立同時測定豬、雞、牛、羊糞污中7種磺胺及8種氟喹諾酮類常用獸藥的分析方法，為畜禽養(yǎng)殖場實時監(jiān)測獸藥使用情況提供技術(shù)支撐，對解決我國畜禽糞污中獸藥殘留污染問題具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：UPLC TQ-S，美國Waters公司；電子天平：TP-1102，1100～0.01 g，丹佛儀器有限公司；電子天平：BP211D，210～0.01 mg，北京賽多利斯天平有限公司；高速冷凍離心機：Biofuge stratos，德國郝黎氏公司；氮吹儀：N-EVAP，美國Organomation Associates公司；渦旋震蕩器：MS-3，德國IKA公司；固相萃取裝置：SPE-24，美國Supelco公司。

1.2 試藥與試劑 磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺甲氧噠嗪(SMP)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺喹噁啉(SQ)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)(美國Dr.E公司，純度分別為99.2%、99.5%、99.4%、99.7%、94.2%、98.9%、99.4%)；環(huán)丙沙星(Cipro.)、達氟沙星(Dano.)、恩諾沙星(Enro.)、沙拉沙星(Sara.)(美國Dr.E公司，純度分別為92.3%、94.2%、99.9%、85.82%)；諾氟沙星(Nor.)、培氟沙星(Pe.)、洛美沙星(Lome.)、氧氟沙星(O.)(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度分別為99.4%、99.6%、98.6%、99.5%)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氨水，色譜純；其余均為分析純；高純氮；高純氬；試驗用水均為一級水；固相萃取柱：Oasis HLB(3cc/60 mg)，美國Waters公司。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18(1.7 μm，2.1×100 mm)；流動相：A 為 0.1%的甲酸水，B 為 0.1%的甲酸乙腈。采用梯度洗脫，柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL，梯度洗脫方法見表1。

表1 梯度洗脫表Tab 1 Gradient elution table

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧正離子模式(ESI+)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電離電壓：2.7 kV；源溫：150 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；碰撞氣流量：0.15 mL/min；15種獸藥的定性/定量離子對、錐孔電壓及碰撞能量見表2。

表2 15種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)Tab 2 Mass spectrometric parameters of 15 veterinary drugs

1.4 樣品制備

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.4.1.1 單標(biāo)儲備液的配制 分別精密稱取適量的各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)共計15種，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇超聲使其溶解，放至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成1 mg/mL的單標(biāo)儲備液。

1.4.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制 精密吸取上述15種1 mg/mL的單標(biāo)儲備液，各0.1 mL，置同一100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.4.1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 分別精密吸取1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液10、20、50、100、200、500、1000 μL，置于不同10 mL容量瓶中，用復(fù)溶液定容，搖勻，即得濃度為1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.2 試液的制備

1.4.2.1 提取液的配制 分別取2%氨化乙腈50 mL和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液50 mL，充分混勻，即得。

1.4.2.2 磷酸鹽緩沖液的配制 精密稱取0.8 g磷酸二氫鉀和0.2 g磷酸氫二鉀，加80 mL水充分溶解后，定容至100 mL，混勻，即得。

1.4.2.3 酸性洗脫液的配制 取1 mL甲酸，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，即得。

1.4.2.4 堿性洗脫液的配制 取2 mL的濃氨水，加入50 mL甲醇、50 mL乙酸乙酯，混勻，即得。

1.4.2.5 復(fù)溶液的配制 取20 mL乙腈，加入80 mL 0.1%甲酸水，混勻。

1.4.3 空白糞污樣品的篩選 選擇太原市及周邊多家豬、雞、牛、羊養(yǎng)殖場，通過現(xiàn)場確認以及畜禽用藥原始記錄，有針對性地選取30 d內(nèi)未使用過磺胺類和氟喹諾酮類藥物的養(yǎng)殖場進行新鮮空白糞污樣品的采集，方法確立前使用顧欣等建立的豬糞便中獸藥殘留量檢測方法[6]進行樣品前處理，上液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，選擇對15種獸藥均無明顯干擾的樣品作為相應(yīng)基質(zhì)的空白樣品。

1.4.4 樣品溶液的制備 采集的新鮮糞污樣品，充分混勻，置-20 ℃冷凍保存。檢測時，稱取完全解凍的糞污樣品1.00±0.02 g(精確到 0.01 g)，置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入提取液10 mL，充分渦旋30 s，震蕩5 min，4 ℃下8000 r/min離心5 min，移出上清液。剩余殘渣再加10 mL提取液重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，混勻，作為備用液1。

精密吸取2 mL備用液1于10 mL離心管中，40 ℃水浴條件下氮吹至近干。加入3 mL磷酸鹽緩沖液溶解，渦旋30 s，4 ℃下8000 r/min離心5 min，取上清液作為備用液2。

取HLB 固相萃取小柱(3cc/60 mg)依次用3 mL甲醇、3 mL磷酸鹽緩沖液進行活化。取備用液2過柱，用3 mL5%甲醇水溶液進行淋洗，抽干。用2 mL酸性洗脫液洗脫，抽干，作洗脫液1。再用2 mL堿性洗脫液洗脫，抽干，作洗脫液2。收集洗脫液1、2于同一個15 mL離心管中。于40 ℃水浴條件下氮吹至近干，用1 mL復(fù)溶液溶解殘渣，溶液過0.22 μm濾膜(聚四氟乙烯膜)，供UPLC-MS/MS檢測分析。

1.4.5 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 準(zhǔn)確稱取豬、雞、牛、羊空白糞污樣品各6份，每份1.00 g(精確至0.01 g)，按照1.4.4項下的方法進行提取、凈化、氮吹，于六份空白樣品中分別加入1 mL 的 1、2、5、10、20(豬、雞、羊糞污)、50(牛糞污)、100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶，充分震蕩，使殘渣溶解，制成濃度為 1、2、5、10、20(豬、雞、羊糞污)、50(牛糞污)、100 μg/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。進行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，每個濃度溶液重復(fù)進樣三次。獲得15種獸藥的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和峰面積，分別作為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，繪制出相對應(yīng)的目標(biāo)獸藥標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.6 空白樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取已初步篩選好的空白豬、雞、牛、羊糞污樣品1.00±0.02 g(精確到 0.01 g)，置于50 mL離心管中，照1.4.4項下步驟同步平行操作，得空白樣品溶液。

1.4.7 檢出限(LOD)與定量限(LOQ) 分別稱取豬、雞、牛、羊糞污空白樣品各1 g，精密加入一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按照1.4.4項下步驟處理樣品，上機，計算信噪比(S/N)，以響應(yīng)值最弱的組分信噪比為3時，對應(yīng)的添加濃度為方法的檢出限，以響應(yīng)值最弱的組分信噪比為10時，對應(yīng)的添加濃度為方法的定量限。

1.4.8 準(zhǔn)確度和精密度樣品溶液的制備 稱取豬、雞、牛、羊空白糞污樣品各54份，每份1 g，分成3批，每批均精密加入一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，渦旋混勻，制成50、100、500 μg/kg低、中、高三個不同添加濃度的加標(biāo)樣品，每個濃度做6個平行樣，按1.4.4項下步驟處理樣品，照1.3項下儀器條件上機測定，用單點外標(biāo)法定量，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；其中采用同批6個回收率數(shù)據(jù)計算批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用3批平均回收率數(shù)據(jù)計算批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)效應(yīng) 取上述1.4.5項下制備的10 ng/mL各基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及1.4.1.3項下純?nèi)軇┡渲频南嗤瑵舛鹊幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.3項下儀器條件注入液質(zhì)聯(lián)用儀，以兩者同一種獸藥質(zhì)譜響應(yīng)值比值的百分數(shù)來評價基質(zhì)效應(yīng)(Matrix Effect，ME)，若ME大于100%，則存在基質(zhì)增強效應(yīng)；若ME小于100%，則存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；若ME接近100%，則不存在基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，15種獸藥除磺胺嘧啶(SD)和諾氟沙星(Nor.)部分結(jié)果出現(xiàn)基質(zhì)增強效應(yīng)外，其余獸藥均存在不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，尤其是磺胺喹噁啉(SQ)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)以及沙拉沙星(Sara.)基質(zhì)抑制效應(yīng)略微顯著(圖1)。為盡可能減少基質(zhì)效應(yīng)干擾，本實驗采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量，雖然各個待測物存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，但不影響檢測結(jié)果。

圖1 15種獸藥在豬、雞、牛、羊糞污中的基質(zhì)效應(yīng)Fig 1 Matrix effect of 15 veterinary drugs in pig, chicken, cattle and sheep manure

2.2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照1.4.5項下步驟，豬、雞、羊糞污制成濃度為 1、2、5、10、20、100 μg/mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，牛糞污制成濃度為 1、2、5、10、50、100 μg/mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。X軸為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C，Y軸為定量離子對應(yīng)的色譜峰面積A，繪制15種獸藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：豬、雞、牛、羊糞污中15種獸藥在1～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均較良好，試驗結(jié)果見表3。15種獸藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液及對應(yīng)空白基質(zhì)樣品溶液色譜圖見圖2～圖9。

表3 豬、雞、牛、羊糞污中15種獸藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及決定系數(shù)Tab 3 Regression equation and coefficient of determination of matrix matching standard curve for 15 veterinary drugs in pig, chicken, cattle and sheep manure

圖2 空白豬糞污樣品溶液色譜圖Fig 2 Chromatogram of sample solution of blank pig manure

圖3 豬糞污基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(濃度50 μg/kg)Fig 3 Chromatogram of matched standard solution of pig manure matrix (concentration 50 μg/kg)注：1-SD、2-Nor.、3-O.、4-Cipro.、5-Pe.、6-Dano.、7-Lome.、8- SM2、9-Enro.、10-SMP、11-Sara.、12-SMM、13-SMZ、14-SQ、15-SDM。

圖4 空白雞糞污樣品溶液色譜圖Fig 4 Chromatogram of sample solution of blank chicken manure

圖5 雞糞污基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(濃度50 μg/kg)Fig 5 Chromatogram of matched standard solution of chicken manure matrix (concentration 50 μg/kg)注：1-SD、2-Nor.、3-O.、4-Cipro.、5-Pe.、6-Dano.、7-Lome.、8- SM2、9-Enro.、10-SMP、11-Sara.、12-SMM、13-SMZ、14-SQ、15-SDM。

圖6 空白牛糞污樣品溶液色譜圖Fig 6 Chromatogram of sample solution of blank cattle manure

圖7 牛糞污基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(濃度50 μg/kg)Fig 7 Chromatogram of matched standard solution of cattle manure matrix (concentration 50 μg/kg)1-SD、2-Nor.、3-O.、4-Cipro.、5-Pe.、6-Dano.、7-Lome.、8- SM2、9-Enro.、10-SMP、11-Sara.、12-SMM、13-SMZ、14-SQ、15-SDM。

圖8 空白羊糞污樣品溶液色譜圖Fig 8 Chromatogram of sample solution of blank sheep manure

圖9 羊糞污基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(濃度50 μg/kg)Fig 9 Chromatogram of matched standard solution of sheep manure matrix (concentration 50 μg/kg)1-SD、2-Nor.、3-O.、4-Cipro.、5-Pe.、6-Dano.、7-Lome.、8- SM2、9-Enro.、10-SMP、11-Sara.、12-SMM、13-SMZ、14-SQ、15-SDM。

2.3 檢出限(LOD)和定量限(LOQ) 測定結(jié)果表明，豬、雞、牛、羊糞污中15種獸藥殘留檢測方法的檢出限為20.0 μg/kg，定量限為50.0 μg/kg。

2.4 準(zhǔn)確度與精密度 分別取3批制備好的50、100、500 μg/kg低、中、高三個不同添加濃度各6個平行的加標(biāo)樣品溶液，上機測定，計算回收率和RSD，結(jié)果見表4。

表4 豬、雞、牛、羊糞污中15種獸藥添加回收率與精密度Tab 4 Recovery and RSD of 15 veterinary drugs added to pig, chicken, cattle and sheep manure

續(xù)表

結(jié)果顯示，在50、100、500 μg/kg三個添加濃度下，豬、雞、牛、羊糞污中15種獸藥平均回收率為60.5%～115.5%，批內(nèi)RSD(n=6)為1.2%～17.6%，批間RSD(n=3)為0.2%～17.6%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度、精密度良好。

2.5 樣品測定 隨機抽取從養(yǎng)殖場采回的8個畜禽糞污樣品，用已建立的分析方法進行測定，每份樣品取2個平行樣，結(jié)果取平均值(表5)。

表5 畜禽糞污樣品中15種獸藥殘留檢測結(jié)果(n=2)Tab 5 Detection results of 15 veterinary drug residues in livestock and poultry manure samples (n=2)

由表5結(jié)果可知，恩諾沙星檢出率75%，環(huán)丙沙星檢出率62.5%，磺胺間甲氧嘧啶和諾氟沙星檢出率均為25%，磺胺二甲基嘧啶、達氟沙星和氧氟沙星檢出率均為12.5%，其余組分未檢出。因數(shù)據(jù)有限無法體現(xiàn)山西省畜禽糞污獸藥殘留真實狀況，需積累更多的樣品數(shù)據(jù)，利用專業(yè)的統(tǒng)計學(xué)軟件進行全方位多角度地分析。

3 討論與結(jié)論

3.1 提取條件的選擇 目前抗菌藥物的提取主要采用有機試劑，部分使用無機試劑進行提取。甲醇、乙腈等有機試劑極性強，但是有一定的毒性作用，試驗過程中曾采用水相提取試劑，分別采用磷酸鹽緩沖液兩次提取以及EDTA溶液和磷酸鹽緩沖液分步提取的方式，后者較前者的回收率高，但ND代表未檢出或檢測結(jié)果低于檢出限。

是回收率未達到60%以上，考慮與提取試劑的使用順序有關(guān)，決定將EDTA和磷酸鹽緩沖液區(qū)分前后順序進行提取。結(jié)果：先用EDTA溶液再用磷酸鹽緩沖液提取時，整體回收率未達到60%以上，先用磷酸鹽緩沖液再用EDTA溶液提取時，磺胺類回收率達60%，氟喹諾酮仍然無法達到60%以上，因此，決定采用有機試劑進行提取，根據(jù)磺胺類和氟喹諾酮類抗菌藥物的理化特性，采用堿性有機試劑進行提取，并對提取液和震蕩時間進行考察。改變單一變量，以回收率作為評價指標(biāo)，確定最終前處理方法。試驗過程中發(fā)現(xiàn)震蕩時間過長回收率略有降低，可能是震蕩時間過長導(dǎo)致抗菌藥物發(fā)生降解，影響提取效果，同涂宏建，錢詩穎等研究結(jié)果一致[8-9]。最終通過對比回收率確定將2%氨化乙腈+0.1 mol/L氫氧化鈉溶液(50∶50，V/V)作為提取液，震蕩5 min進行提取，回收率能夠滿足要求。

3.2 凈化條件的選擇 為了確定固相萃取方法步驟，課題組先后對固相萃取柱類型(C18柱、HLB3cc、HLB6cc)、復(fù)溶液、洗脫液以及淋洗液進行了一一考察。在保持其他前處理方法步驟一致的情況下，只改變單一變量，以回收率結(jié)果作為評價指標(biāo)，選回收率高的變量為最終確定的方法。其中針對洗脫液的篩選優(yōu)化，程家興驗證不同種類洗脫液對磺胺類和氟喹諾酮類的洗脫效果不同，結(jié)果酸性甲醇的洗脫效果總體較好[10]。但本試驗單獨采用酸性洗脫液或者堿性洗脫液，均不能使磺胺類和氟喹諾酮類的回收率達到“雙贏”的結(jié)果，經(jīng)多次反復(fù)試驗，考慮到目標(biāo)抗菌藥物具有酸堿兩性，最終采取酸性、堿性洗脫液分步洗脫的方式，兩類目標(biāo)抗菌藥物的回收率均能同時滿足要求。最終確定最佳的凈化方式是提取液過HLB3cc固相萃取柱，5%甲醇水溶液淋洗，酸性洗脫液(1%甲酸甲醇)和堿性洗脫液(甲醇/乙酸乙酯/氨水，50/50/2，V/V/V)分步洗脫，濃縮，最后選用乙腈：0.1%甲酸水(20/80，V/V)進行復(fù)溶。

3.3 方法優(yōu)化 本課題建立的檢測方法能兼顧磺胺類及氟喹諾酮類藥物均達到滿意的回收率，且方法穩(wěn)定性、精密度良好。對比國內(nèi)外抗菌藥物殘留液質(zhì)聯(lián)用檢測方法[11-12]，后期需要在確保雜質(zhì)凈化效果的前提下，進一步簡化前處理步驟，提高方法的檢測限，以便能建立更加高效、準(zhǔn)確、快速、靈敏的畜禽糞污抗菌藥殘留檢測方法。

本研究建立了一種SPE-UPLC-MS/MS同時適用于豬、雞、牛、羊糞污中7種磺胺類、8種氟喹諾酮類獸藥殘留檢測方法。通過考察，該方法準(zhǔn)確度、精密度良好，方法可行。該方法的建立為后期進行山西省不同地區(qū)不同規(guī)模的養(yǎng)殖場糞污中的抗菌藥物檢測提供技術(shù)支撐，并為進一步研究獸藥在環(huán)境中的遷移，對環(huán)境的影響提供檢測方法和數(shù)據(jù)支持。