蜜蜂嗅覺(jué)識(shí)別過(guò)程的分子機(jī)制

任勤 王瑞生 姬聰慧 曹蘭 劉佳霖 陳恒 蔣雨

（重慶市畜牧科學(xué)院，榮昌 402460）

蜜蜂作為高度社會(huì)化的昆蟲，嗅覺(jué)系統(tǒng)在其生命活動(dòng)中具有重要作用。依靠復(fù)雜的嗅覺(jué)系統(tǒng)，可以識(shí)別個(gè)體和群體之間各類信息素和外界環(huán)境中的各種氣味物質(zhì)，如蜂王通過(guò)信息素來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂群的調(diào)控、蜂王與雄蜂的交配、產(chǎn)卵、分工、分蜂、防衛(wèi)、尋找蜜源并準(zhǔn)確定位等[1,2]。蜜蜂可以鑒定和識(shí)別環(huán)境中不同的化學(xué)氣味，并將這些化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，引起蜜蜂不同的行為反應(yīng)，如群居、覓食、抵御天敵、交配等[3-5]，從而使其能適應(yīng)環(huán)境選擇以保證群體的生存和種群繁衍。如何對(duì)環(huán)境中特定的氣味進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別及選擇，就需要蜜蜂敏銳的嗅覺(jué)識(shí)別系統(tǒng)，而蜜蜂對(duì)特定氣味的識(shí)別是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，多種蛋白參與了對(duì)氣味分子的識(shí)別[6]。隨著遺傳學(xué)、生物學(xué)等研究的不斷深入，更依賴于現(xiàn)代分子技術(shù)，如氣相色譜-觸角電位聯(lián)用技術(shù)、RAN 原位雜交等技術(shù)的發(fā)展，對(duì)蜜蜂嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制的研究更加深入。本文對(duì)蜜蜂嗅覺(jué)識(shí)別系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能、參與嗅覺(jué)識(shí)別的蛋白及嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制進(jìn)行綜述，以期進(jìn)一步探索嗅覺(jué)識(shí)別在蜜蜂飼養(yǎng)、疾病防控等領(lǐng)域的作用以及為蜜蜂嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制的研究提供參考依據(jù)。

1 嗅覺(jué)感受器及其識(shí)別過(guò)程

蜜蜂的社會(huì)活動(dòng)很大程度上受到各種外界環(huán)境刺激影響，如味覺(jué)、嗅覺(jué)及各種觸覺(jué)刺激等，而觸角是感受這些刺激的主要化學(xué)感受器官，起著調(diào)節(jié)蜜蜂行為生理等各種環(huán)境刺激因子的關(guān)系[7,8]。蜜蜂依賴觸角感受外界環(huán)境各種信號(hào)，經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)、綜合協(xié)調(diào)而對(duì)外界作出各種應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生各種行為表現(xiàn)形式，因此觸角對(duì)于蜜蜂維護(hù)蜂群間關(guān)系、繁殖、行為控制等方面發(fā)揮著重要作用。和大多數(shù)昆蟲一樣，蜜蜂的嗅覺(jué)感受器主要分布在觸角、下顎須和唇須上，在尾須上也有少量分布。在蜜蜂的觸角上分布著不同的各種感受器，可對(duì)外界各種刺激進(jìn)行感受[9,10]，其中板形感受器、毛形感受器、錐形感受器，都是觸角中主要嗅覺(jué)感受器[11,12]。不同型級(jí)的蜂觸角上嗅覺(jué)感受器數(shù)量明顯不同，說(shuō)明其嗅覺(jué)能力有所差異[13]。

每個(gè)嗅覺(jué)感受器包含1～4 根嗅覺(jué)神經(jīng)元（ORNs），這些神經(jīng)細(xì)胞屬于雙極神經(jīng)元，樹突端延伸到嗅覺(jué)感受器，并浸沒(méi)在表皮細(xì)胞分泌的富含鉀離子和蛋白質(zhì)的淋巴液內(nèi)，樹突部的細(xì)胞膜上能特異性表達(dá)相應(yīng)的嗅覺(jué)受體蛋白，表達(dá)相同嗅覺(jué)受體ORNs 的軸突端匯集到觸角葉中相同的嗅小球中。觸角葉中的功能組織與脊椎動(dòng)物的嗅球相似，是傳遞和處理嗅覺(jué)信息的初級(jí)中樞。在嗅小球中，ORNs 的突觸連接到二級(jí)神經(jīng)元，稱為投射神經(jīng)元（PNs），PN 的軸突投射到位于蘑菇體（MB）和原腦葉外側(cè)角（LH）等區(qū)域的三級(jí)神經(jīng)元，從而在腦部形成關(guān)于該氣味分子的抽象信息，引發(fā)相應(yīng)行為[14]。

一般來(lái)說(shuō)，嗅覺(jué)識(shí)別過(guò)程大致分為以下三步：（1）外界環(huán)境中親脂性的氣味分子通過(guò)昆蟲觸角感器表皮上的微孔進(jìn)入親水性的感器淋巴液，與感器淋巴液中的可溶性氣味結(jié)合蛋白（OBP）結(jié)合，形成氣味分子-OBP復(fù)合體；（2）復(fù)合體穿過(guò)親水性的嗅覺(jué)淋巴液，到達(dá)神經(jīng)樹突膜上的氣味受體（ORs）；（3）氣味受體受到刺激后，膜通透性發(fā)生改變，產(chǎn)生動(dòng)作電位，同時(shí)氣味分子在OBP 作用下又迅速失活，然后在氣味降解酯酶和谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶的作用下降解[1,15]。

2 嗅覺(jué)識(shí)別系統(tǒng)構(gòu)成

蜜蜂的嗅覺(jué)系統(tǒng)構(gòu)成非常復(fù)雜，其主要功能由感受器、氣味結(jié)合蛋白（OBPs）、氣味受體（ORs）、感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白（SNMP）、化學(xué)感受蛋白（CSPs）和氣味降解酶（ODEs）等相互協(xié)調(diào)運(yùn)行完成[16]。蜜蜂的嗅覺(jué)識(shí)別是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，氣味通過(guò)觸角感受器進(jìn)入感受器淋巴液中，然后經(jīng)過(guò)多種蛋白參與完成氣味分子的識(shí)別[17,18]。

2.1 氣味結(jié)合蛋白

蜜蜂觸角上的感覺(jué)神經(jīng)元是識(shí)別氣味的基礎(chǔ)物質(zhì)，其主要分布在親水性的淋巴液中，而蜜蜂能感受的氣味物質(zhì)多為脂溶性分子化合物，其不能直接經(jīng)過(guò)親水性的淋巴液到達(dá)嗅覺(jué)神經(jīng)元，必須與某種蛋白結(jié)合才能運(yùn)輸?shù)綒馕妒荏w（ORs），而執(zhí)行此功能就是氣味結(jié)合蛋白（OBPs）[18,19]。氣味結(jié)合蛋白識(shí)別氣味分子介導(dǎo)至嗅覺(jué)感受神經(jīng)元的觀點(diǎn)已被廣泛接受，在氣味識(shí)別過(guò)程中，OBPs 主要功能有：（1）OBPs 在氣味識(shí)別中起到了外周濾器的作用，能夠選擇性識(shí)別和結(jié)合特異的氣味分子；（2）OBPs 通過(guò)親水性的淋巴液運(yùn)輸脂溶性氣味分子；（3）OBPs 幫助氣味分子通過(guò)特殊途徑到達(dá)受體蛋白，促進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)；（4）OBPs 可能清除外周感器中不需要的或有毒物質(zhì)；（5）OBPs 迅速使完成刺激的氣味分子失活[17]。

有研究發(fā)現(xiàn)，西方蜜蜂中存在一類觸角特異蛋白（ASPs），包括觸角特異蛋白ASP1 和 ASP2[20,21]。原位雜交結(jié)果顯示，基因ASP1 在工蜂和雄蜂的觸角嗅覺(jué)器官中均大量表達(dá)，主要與蜂王信息素物質(zhì)結(jié)合[22]。化學(xué)感受蛋白ASP2 是一種水溶性蛋白，因其高豐度地表達(dá)于工蜂觸角，且不能與蜂王信息素的任何成分結(jié)合，加之其結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，將化學(xué)感受蛋白ASP2歸為普通氣味結(jié)合蛋白[23]。

通過(guò)半定量RT-PCR 及斑點(diǎn)分析法和蛋白質(zhì)組學(xué)等方法，發(fā)現(xiàn)西方蜜蜂基因組上共有21 個(gè)OBPs，其中有9 個(gè)OBPs 基因在觸角中特異性表達(dá)，其余基因在各個(gè)組織或其他特異組織中表達(dá)，并對(duì)這21 個(gè)OBPs 在不同蜂型和不同年齡西方蜜蜂下頜腺中的表達(dá)情況進(jìn)行詳細(xì)研究，揭示了OBPs 家族成員的表達(dá)差異[24,25]。李紅亮利用RT-PCR 技術(shù)分析了ASP1 及ASP2 基因的時(shí)空表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ac-ASP1 高豐度地表達(dá)于工蜂觸角，而在其他器官中呈低豐度表達(dá)，Ac-ASP2 特異地表達(dá)于工蜂觸角的嗅覺(jué)感器上，在其他器官中均不表達(dá)[26]。蜜蜂依賴氣味結(jié)合蛋白完成了對(duì)外界成千上萬(wàn)氣味物質(zhì)識(shí)別過(guò)程的第一步，氣味結(jié)合蛋白OBPs 參與識(shí)別轉(zhuǎn)移疏水性的氣味物質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的嗅覺(jué)行為反應(yīng)[17]。

2.2 化學(xué)感受蛋白

昆蟲化學(xué)感受蛋白（CSPs）是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一類低分子量酸性可溶性蛋白，廣泛分布于昆蟲觸角、跗節(jié)等各種化學(xué)感受器中，其主要功能是識(shí)別結(jié)合運(yùn)輸非揮發(fā)性分子。

Danty 于1998 年在意大利蜜蜂觸角中發(fā)現(xiàn)了CSP基 因，命名為ASP3，ASP3含3個(gè)亞型-ASP3a、ASP3b 和ASP3c，其中ASP3a 和ASP3c 在工蜂和雄蜂的觸角中都有發(fā)現(xiàn)，而ASP3c 只存在于雄蜂觸角中[21]。2006 年Foret 在意大利蜜蜂中鑒定出6 個(gè)CSP 基因，并將它們命名為CSP1-6，其中的CSP1、CSP2 即分別為ASP3b 和ASP3c 基因[24]。CSP1、CSP2、CSP4 在意大利蜜蜂和中華蜜蜂觸角中都表達(dá)，Am-CSP4 只在觸角中表達(dá)；Ac-CSP3 在蜜蜂翅中的表達(dá)量最高，而Am-CSP3 在觸角中表達(dá)豐富。CSP5 和CSP6 都在意大利蜜蜂卵和卵巢中表達(dá)，但CSP6 也在其幼蟲期、蛹期和成蜂頭中表達(dá)。而在中華蜜蜂中，CSP5 在各個(gè)發(fā)育期都表達(dá)且表達(dá)量較為穩(wěn)定，CSP6 只在蛹期表達(dá)[27-30]。

利用蒽甲酸類脂肪酸ASA 作為熒光探針，結(jié)果表明ASP3c 與大量脂肪酸及其衍生酯類特異結(jié)合，不能與普通氣味分子及其他信息素結(jié)合，序列分析表明，CSPs 在節(jié)肢動(dòng)物中是較保守的基因家族，廣泛的表達(dá)于各感覺(jué)器官中，是具有多種功能的蛋白質(zhì)，在化學(xué)感受信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18]。

2.3 氣味受體蛋白

嗅覺(jué)的識(shí)別和傳導(dǎo)從氣味分子與嗅覺(jué)神經(jīng)元樹突膜上的氣味受體（ORs）的相互作用開始，其主要功能是與氣味分子結(jié)合后改變細(xì)胞膜上的離子通道產(chǎn)生動(dòng)作電位。昆蟲的ORs 一般分為兩類：一類是典型嗅覺(jué)受體，這些ORs 基因高度變異同源性低；另一類其基因在不同昆蟲間較為保守，同源性可高達(dá)70%以上，是傳統(tǒng)嗅覺(jué)受體（olfactory receptor coreceptor family，Orco；在果蠅中被命名為Or83b）[16]。

2003 年，Krieger 等利用PCR 方法從西方蜜蜂中擴(kuò)增出第一個(gè)氣味受體基因AmeLR2，其在大多數(shù)觸角感覺(jué)神經(jīng)中表達(dá)[31]。2006 年，Robertson 和Wanner利用生物信息學(xué)方法，從西方蜜蜂全基因組中共鑒定出170 個(gè)ORs 基因，其中有7 個(gè)假基因。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，將這170 個(gè)ORs 分為5 個(gè)亞家族，其中有4 個(gè)小的亞家族和1 個(gè)大的亞家族（包含157 個(gè)ORs），在這個(gè)大的亞家族中，多數(shù)ORs 都是串聯(lián)排列的，并經(jīng)過(guò)聚類分析找到了西方蜜蜂的Or83b 家族成員，定名為AmOr2[32]。采用RT-PCR 技術(shù)對(duì)任意選擇的10 個(gè)ORs 基因在意大利蜜蜂中的組織特異性表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，有7 個(gè)ORs 基因在蜜蜂的觸角中高度表達(dá)。與其他昆蟲相比，蜜蜂擁有數(shù)量較多的氣味受體，這個(gè)龐大的氣味受體家族可能與它們之間的社會(huì)交流和覓食行為有關(guān)[18]。Wanner 等研究表明，Or10、Or11、Or18 和Or170 這4 個(gè)基因在西方蜜蜂雄蜂中高表達(dá)，通過(guò)電生理學(xué)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雄蜂的Or11 僅是對(duì)9-氧代-癸烯酸（9-ODA）反應(yīng)敏感的氣味受體[33]。氣味受體家族在蜜蜂基因組中是最有代表性的例子，通過(guò)描述該物種的進(jìn)化地位和性別特定基因的表達(dá)，為研究蜜蜂對(duì)信息素、親屬間的識(shí)別信號(hào)、多種花的氣味檢測(cè)提供了條件[34]。

2.4 感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白

感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白（SNMPs）是富集于完全變態(tài)昆蟲觸角中的重要嗅覺(jué)功能蛋白，分為SNMP1 和SNMP2 兩個(gè)亞族[35]，最早在鱗翅目昆蟲的嗅覺(jué)受體神經(jīng)中發(fā)現(xiàn)SNMPs，研究表明這類蛋白可能在識(shí)別氣味分子上具有重要作用。Nichols 等研究發(fā)現(xiàn)，西方蜜蜂中有8 個(gè)CD36 同源的候選基因[36]。胡穎穎等于2013 年克隆表達(dá)出中華蜜蜂神經(jīng)元膜蛋白AccSNMP1編碼區(qū)，該基因1563bp 編碼520 個(gè)氨基酸，并且AccSNMP1 在各個(gè)部位都表達(dá)，但在觸角中表達(dá)最為豐富[37]。

目前，SNMP 在氣味識(shí)別中的生化作用機(jī)理還處于假說(shuō)階段，根據(jù)前人的研究，可推斷出SNMP 的作用大體上有四種，分別是：（1）SNMP 可能是氣味分子或OBP-氣體分子復(fù)合物的受體；（2）參與氣味分子從OBP-氣體分子復(fù)合物上釋放；（3）SNMP 可能以SNMP-OR 復(fù)合體的形式參與氣味識(shí)別；（4）SNMP 將氣味分子或OBP-氣體復(fù)合物傳遞至神經(jīng)元細(xì)胞中。這些作用都表明感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白在昆蟲嗅覺(jué)感受中起到很重要的作用[34]。

2.5 氣味降解酶

信號(hào)失活在所有化學(xué)機(jī)制中都具有重要意義，在嗅覺(jué)中也不例外[35]。氣味降解酶（ODEs）能使信號(hào)迅速失活，這對(duì)昆蟲嗅覺(jué)具有重要作用，因?yàn)镺DEs能避免持續(xù)信號(hào)刺激和保證后續(xù)嗅覺(jué)感知的傳遞。ODEs 主要包含酯酶（EST）、細(xì)胞色素P450 氧化酶（P450）、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶（GST）和醛氧化酶（AOX），并且這些酶中很多都具有解毒功能[16]。目前對(duì)氣味分子失活機(jī)制的研究存在2 種觀點(diǎn)，一種觀點(diǎn)認(rèn)為是氣味降解酶（ODEs）使氣味分子失活，另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為氣味分子先通過(guò)OBP 失活，而后被ODEs 降解[35]。

3 嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制

蜜蜂具有高度特化和靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)，來(lái)識(shí)別環(huán)境中不同的氣味信號(hào)，當(dāng)氣味分子與嗅覺(jué)系統(tǒng)中的受體結(jié)合后，產(chǎn)生一系列的行為反應(yīng)，這一識(shí)別過(guò)程及反應(yīng)可以使蜜蜂更好地尋找蜜源、交配以及尋找繁殖場(chǎng)所和躲避外界環(huán)境的傷害等。

昆蟲嗅覺(jué)系統(tǒng)機(jī)制有兩種假說(shuō)：其一是氣味分子與感受蛋白結(jié)合后被運(yùn)輸?shù)叫嵊X(jué)神經(jīng)元的樹突上，因氣味分子帶有負(fù)電荷氣味分子的積累，使得嗅覺(jué)神經(jīng)元樹突周圍的pH 發(fā)生變化，從而導(dǎo)致氣味分子與感受蛋白分離后與嗅覺(jué)受體結(jié)合產(chǎn)生動(dòng)作電位；其二是氣味分子與感受蛋白結(jié)合后，與感受神經(jīng)元膜蛋白（SNMP）相互作用激發(fā)OR，OR 與G-蛋白偶聯(lián)后，由效應(yīng)器激發(fā)第二信使，隨著第二信使的增加激活離子通道，最后氣味被氣味降解酶降解[16]。

Sato 等和Wicher 等在2008 年同時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的嗅覺(jué)形成模型，他們認(rèn)為，在Ors-Or83b 二聚體形成后會(huì)產(chǎn)生一個(gè)配體門離子通道，只有在該配體門離子通道存在時(shí)分子信號(hào)才能傳遞，而且他們都認(rèn)為通過(guò)打開配體門離子通道，直接產(chǎn)生動(dòng)作電位是昆蟲獨(dú)特的對(duì)外界環(huán)境作出反應(yīng)的基礎(chǔ)，這表明昆蟲具有與其他物種完全不同的信號(hào)傳導(dǎo)方式，昆蟲獨(dú)特的信號(hào)傳導(dǎo)方式將有利于它們更好地識(shí)別化學(xué)信息，從而適應(yīng)多變的外界環(huán)境，對(duì)其生存有重大意義[38,39]。

4 展望

嗅覺(jué)對(duì)蜜蜂信息交流具有重要作用，由于其復(fù)雜性，目前的研究結(jié)果都尚未完整的闡述清楚蜜蜂的嗅覺(jué)系統(tǒng)是如何調(diào)控蜜蜂的各種行為。雖然對(duì)化學(xué)感受器、信息素物質(zhì)篩選與合成以及對(duì)OBPs、CSPs、ORs、ODEs、SNMPs 等嗅覺(jué)相關(guān)蛋白進(jìn)行了深入研究，但仍缺乏關(guān)于信息素物質(zhì)對(duì)昆蟲嗅覺(jué)相關(guān)蛋白的作用、嗅覺(jué)相關(guān)蛋白之間、嗅覺(jué)相關(guān)蛋白與氣味物質(zhì)間的相互作用以及昆蟲嗅覺(jué)的感受途徑等方面的綜合性研究。

可以用RNA-Seq 技術(shù)研究不同行為表現(xiàn)下蜜蜂觸角幾乎所有基因的表達(dá)情況；可以利用信息素成分或氣味分子與OBP 或者CSP 是如何結(jié)合與釋放的，以及它們與受體結(jié)合后是怎樣產(chǎn)生電信號(hào)的，以及用信息素成分或氣味分子刺激蜜蜂，分析嗅覺(jué)候選基因的表達(dá)是否受到影響；也可以利用western blot 和免疫熒光等技術(shù)，對(duì)嗅覺(jué)相關(guān)基因進(jìn)行定位，以及研究它們之間是否存在互作關(guān)系，逐步探明蜜蜂嗅覺(jué)機(jī)制與行為發(fā)育的關(guān)系。蜜蜂觸角上分布著成千上萬(wàn)個(gè)感覺(jué)器，能感受環(huán)境中各種揮發(fā)性氣味分子，賦予蜜蜂靈敏的嗅覺(jué)，而且蜜蜂可以通過(guò)學(xué)習(xí)識(shí)別新的氣味，具有可塑性[16]。因此研究蜜蜂的嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制，不僅有助于了解蜜蜂是怎樣感受和識(shí)別環(huán)境中的氣味物質(zhì)并產(chǎn)生相應(yīng)的行為反應(yīng)的，而且蜜蜂作為一種模式生物，還有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。