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    視網(wǎng)膜色素變性患者RP1基因突變位點與臨床表型相關(guān)性初探

    2022-02-11 10:13:02崔福玲孟令強馬志國
    國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志 2022年2期
    關(guān)鍵詞:變性表型色素

    崔福玲,孟令強,王 靜,馬志國

    1.山東省濱州市人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,山東濱州,256610; 2.山東省東營市中醫(yī)院檢驗科,山東東營 257000;山東省德州市人民醫(yī)院:3.眼科;4.檢驗科,山東德州 253000

    視網(wǎng)膜色素變性是視網(wǎng)膜變性里最常見的一組以進(jìn)行性光感受器細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素上皮功能喪失為共同表現(xiàn)的致盲性眼病,在臨床表型和潛在的遺傳缺陷方面具有很強的異質(zhì)性[1]。RP發(fā)病率為1/3 500~1/5 000,影響全球約150萬人[2]。近年來視網(wǎng)膜色素變性基因的發(fā)現(xiàn)主要依靠二代測序技術(shù),二代測序技術(shù)能夠并行測序所有已知的相關(guān)基因,從預(yù)選的基因組區(qū)域產(chǎn)生數(shù)百萬個讀數(shù)[3]。有研究發(fā)現(xiàn),所有突變患者發(fā)病年齡均在21歲以下,提示可能沒有必要對50歲以上的患者進(jìn)行常規(guī)篩查[4]。本研究對本院臨床確診為視網(wǎng)膜色素變性的人群進(jìn)行二代測序技術(shù)測序和Sanger驗證,分析總結(jié)視網(wǎng)膜色素變性的視網(wǎng)膜色素變性1基因(RP1基因)突變及其引起的特殊臨床表現(xiàn)特征,為后續(xù)臨床確診和遺傳咨詢等工作提供幫助。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 本研究采用橫斷面研究設(shè)計。將2018年1月至2019年7月在山東省濱州市人民醫(yī)院確診的視網(wǎng)膜色素變性25個家系共86例患者納入本研究。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)夜盲史;(2)視力逐漸下降;(3)典型眼底改變,視盤呈蠟黃色萎縮,視網(wǎng)膜有骨細(xì)胞樣色素沉著,血管變細(xì),視網(wǎng)膜呈青灰色;(4)早期周邊視野呈環(huán)形暗點,晚期視野呈向中心縮窄;(5)病變早期即可出現(xiàn)視網(wǎng)膜電圖(ERG)、眼電圖(EOG)明顯異常。其中,男43例,女43例;年齡9~88歲,平均(49.44±3.67)歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)不能配合完成相關(guān)檢查者;(2)無法判斷發(fā)病原因是遺傳因素引起者;(3)無家系血樣可以進(jìn)行基因驗證者。

    患者和家系成員均通過標(biāo)準(zhǔn)臨床檢查,以明確診斷,并排除其他非遺傳因素引起的眼部疾病。臨床檢查包括病史詢問、物理檢查等。其中,病史詢問包括基礎(chǔ)個人信息(包括性別、年齡、籍貫、民族等),主訴,現(xiàn)病史(初次發(fā)病時間、發(fā)病規(guī)律、就診情況、用藥情況、并發(fā)癥種類和時間等),既往史(全身情況、基因檢測史等),家族遺傳史,手術(shù)和藥物使用史,婚育史等。物理檢查包括視力和矯正視力、非接觸性眼壓、色覺、B超(天津邁達(dá),型號ODM-2200)、視野(卡爾蔡司,型號750i)、眼前節(jié)照相、眼底彩色照相(Topcon,型號TRC NW-300)、光相干斷層掃描(OCT,型號Cirrus HD-OCT 5000)。除此之外,患者還進(jìn)行常規(guī)肘部靜脈采血,采用高通量二代基因測序技術(shù)進(jìn)行基因測序[5]。

    1.2樣本采集 將符合要求的患者及家系成員常規(guī)采集肘部靜脈血5 mL,ETDA抗凝,-80 ℃保存。

    1.3提取基因組DNA

    1.3.1DNA提取 QIAGEN試劑盒提取外周血的DNA,Qubit 熒光儀檢測DNA濃度,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

    1.3.2文庫制備 參考華大基因的BGISEQ-500的文庫構(gòu)建指導(dǎo)手冊進(jìn)行。(1)將質(zhì)量合格的DNA樣品通過超聲波高性能樣品處理系統(tǒng)(Covaris)隨機打斷,經(jīng)過片段選擇后得到150~250 bp的片段;(2)隨后進(jìn)行DNA片段末端修復(fù),3′端加上“A”堿基,兩端加上文庫接頭;(3)接頭連接后的文庫進(jìn)行線性擴增(LM-PCR)制備成雜交文庫;(4)雜交文庫與眼科基因芯片(深圳華大生命科學(xué)研究院提供792個基因Panel,其中視網(wǎng)膜色素變性基因78個)進(jìn)行捕獲富集,洗脫未富集的片段后進(jìn)行擴增;(5)擴增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈分離和環(huán)化處理,環(huán)化文庫進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制生成DNA納米球。采用Qubit熒光儀檢測文庫濃度進(jìn)行質(zhì)量控制。

    1.3.3上機測序 質(zhì)量控制合格的文庫采用BGISEQ-500 PE50+10程序上機測序,共檢測792個眼科目標(biāo)基因,其中含有78個視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)基因。

    1.3.4信息分析 (1)從測序儀獲取原始數(shù)據(jù)(FASTQ數(shù)據(jù));(2)過濾:對原始FASTQ數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,去除低質(zhì)量數(shù)據(jù);(3)比對:利用SOAP和BWA軟件,使用hg19參考序列進(jìn)行比對;(4)去重復(fù):基于Picard的去重復(fù)算法,去除重復(fù)序列;(5)變異檢測:基于GATK對數(shù)據(jù)進(jìn)行變異檢測;(6)變異注釋:使用Next GENe5.4.5分析軟件對基因變異與特殊臨床表型的相關(guān)性進(jìn)行分析;使用頻率數(shù)據(jù)庫dbSNP、千人基因組數(shù)據(jù)庫、ESP6500數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫及BGI內(nèi)部數(shù)據(jù)庫進(jìn)行頻率注釋;使用HGVS對變異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)命名;使用OMIM、HGMD等疾病數(shù)據(jù)庫進(jìn)行突變及疾病注釋。

    1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。基因突變以百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1測序結(jié)果 25個家系共86例患者,目標(biāo)序列平均測序深度為107.79,目標(biāo)序列覆蓋率平均99.93%。平均99.98%目標(biāo)序列覆蓋率>10×,平均95.41%的目標(biāo)序列覆蓋率>30×,測序深度和平均覆蓋率均符合檢測要求。

    2.2基因檢出情況 25個家系先證者中,檢測出已知致病性基因突變病例13例;檢出疑似致病性基因突變病例9例;臨床意義未明基因突變有3例;未檢出陰性病例,25個家系均有陽性發(fā)現(xiàn)。8號患者的RP1基因上有2個突變位點,分別為c.2886delA和c.4129delG突變。25號患者的RP1基因上有4個致病突變位點,分別為c.4168_4169insT、c.4196delG、c.4169A>G和c.6353G>A突變。在檢出的基因變異位點中,RP1基因發(fā)現(xiàn)9個未報道致病基因突變位點,見表1。

    表1 視網(wǎng)膜色素變性家系基因檢測中發(fā)現(xiàn)未報道的RP1基因位點突變

    2.3臨床觀察 8號病例:眼視盤界清色蠟黃,血管纖細(xì),視網(wǎng)膜萎縮,呈青灰色,后極黃斑旁及赤道部少量骨細(xì)胞樣色素析出,眼底照相提示,色素散在分布,未附著于血管旁。自發(fā)熒光照相提示,視網(wǎng)膜色素背景熒光變淡,左眼黃斑旁機化瘢痕處點狀強熒光。視野檢查提示,雙眼視野呈不規(guī)則片狀,左眼中央?yún)^(qū)視野尚存。見圖1。25號病例:眼底照相顯示,雙眼視盤界清色淡,血管極細(xì),黃斑中心凹處色暗,除后極黃斑區(qū)外,其余視網(wǎng)膜呈青灰色,未見明顯骨細(xì)胞樣色素沉著。自發(fā)熒光照相提示,眼底色素背景熒光極低或消失,呈斑駁樣。雙眼視野檢查提示,視野呈管狀,周邊視野完全喪失。OCT提示雙眼黃斑中心凹處極度萎縮,厚度僅為右眼37 μm,左眼31 μm。橢圓體帶嚴(yán)重萎縮,未見明顯反射,視網(wǎng)膜厚度中度萎縮。見圖2。

    注:A、B為眼底照相,C、D為自發(fā)熒光照相,E、F為視野檢查;A、C、E示右眼,B、D、F示左眼。

    注:A、B為眼底照相,C、D為自發(fā)熒光照相,E、F為視野檢查,G、H為OCT檢查;A、C、E、G示右眼,B、D、F、H示左眼。

    3 討 論

    RP1基因于1999年首次被鑒定,它由4個外顯子組成,編碼2 156個氨基酸[6]。RP1基因編碼一種光感受器特異性微管相關(guān)蛋白,定位于連接纖毛處,可能參與光感受器內(nèi)外段之間的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運或纖毛結(jié)構(gòu)的維持,在視桿和視錐光感受器外段的結(jié)構(gòu)中起重要作用[7]。

    視網(wǎng)膜色素變性包括一組以視桿狀細(xì)胞為特征的異質(zhì)性遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良,其特征是視錐細(xì)胞變性之前的視桿細(xì)胞變性。視網(wǎng)膜色素變性的遺傳可以是常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖隱性遺傳或單純型。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大約80個致病基因與視網(wǎng)膜色素變性相關(guān),其中58個與常染色體隱性遺傳形式有關(guān)。RP1基因是與視網(wǎng)膜色素變性關(guān)聯(lián)的80多個基因之一,在常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜色素變性和常染色體隱性遺傳視網(wǎng)膜色素變性的病例中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)基因的突變,除了RP1基因,還有bestrophin 1(BEST1)、神經(jīng)視網(wǎng)膜亮氨酸拉鏈、核受體亞家族2 E組成員3(NR2E3)、視紫紅質(zhì)(RHO)、視網(wǎng)膜色素上皮基因(RPE65)[8]。RP1基因相關(guān)的常染色體隱性遺傳視網(wǎng)膜色素變性患者通常比RP1基因相關(guān)的常染色體顯性遺傳視網(wǎng)膜色素變性患者有更嚴(yán)重的視力損害[9]。

    本研究納入的25個家系,全部找到已知或疑似致病突變或臨床意義未明的突變,同時,發(fā)現(xiàn)RP1基因有9個未報道的新突變。

    特別值得注意的是,本研究中患者編號為8號和25號家系的致病突變基因是RP1基因,均指向RP1基因型視網(wǎng)膜色素變性。8號患者RP1基因的c.2886delA和c.4129delG突變?yōu)槿笔б拼a突變,屬于烈性突變,該突變極可能引起編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生改變而致病。25號患者RP1基因上有4個致病突變位點,c.4168_4169insT和c.4196delG突變?yōu)椴迦牒腿笔б拼a突變,屬于烈性突變,而c.4169A>G和c.6353G>A突變?yōu)殄e義突變。經(jīng)過家系共分離檢測確認(rèn),筆者發(fā)現(xiàn)c.4168_4169insT和c.4169A>G突變位于DNA單鏈,而c.4196delG和c.6353G>A突變位于另一條鏈。在臨床表現(xiàn)上,筆者也能看到,25號患者的眼底病變程度遠(yuǎn)比8號患者嚴(yán)重,25號患者黃斑萎縮嚴(yán)重,中心凹處視錐細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失,自發(fā)熒光照相顯示色素上皮背景熒光幾乎消失,動脈血管萎縮尤其明顯。25號患者臨床表現(xiàn)出全色盲,考慮與黃斑的發(fā)育異常有關(guān)。因為與色盲有關(guān)的基因如CNGA3與CNGB3等均沒有發(fā)現(xiàn)異常,而該患者的黃斑發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重萎縮,視錐細(xì)胞的發(fā)育缺失,從而導(dǎo)致色覺缺失。而8號患者無色盲,自發(fā)熒光照相顯示仍有少量色素上皮背景熒光,動脈血管萎縮不明顯。綜合以上表現(xiàn)筆者認(rèn)為,RP1基因的多發(fā)位點突變導(dǎo)致的視網(wǎng)膜色素變性癥狀更顯著,危害更嚴(yán)重,這在國內(nèi)其他同類研究中鮮見報道。

    已有研究顯示,RP1基因的突變可導(dǎo)致不同的臨床表型,可以將這些表型根據(jù)臨床發(fā)現(xiàn)、遺傳模式、發(fā)病年齡和病程在臨床上相互區(qū)分[10]?;蚍治鍪寡芯空吣軌蜻M(jìn)行有針對性的診斷測試,并確定基因治療的治療方法[11]。隨著基因治療等新型治療手段的出現(xiàn),識別與RP1基因突變相關(guān)的整個臨床表型,對于幫助選擇合適的患者及評估所提供治療的效果至關(guān)重要。

    視網(wǎng)膜色素變性的高發(fā)突變基因和突變位點具有異質(zhì)性,本研究新發(fā)現(xiàn)的RP1基因變異位點具有特殊臨床表型。但是HUCKFELDT等[12]的研究發(fā)現(xiàn),盡管RP1基因型相同,但臨床診斷包括黃斑營養(yǎng)不良(MD)、椎桿營養(yǎng)不良(CRD)和視網(wǎng)膜色素變性;VERBAKEL等[10]的研究也顯示,RP1基因的突變可導(dǎo)致不同的臨床表型,具體表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素變性、常染色體隱性遺傳MD或常染色體隱性遺傳CRD,取決于殘留的視網(wǎng)膜細(xì)胞的數(shù)目和生理功能等情況。

    RP1基因是與RP關(guān)聯(lián)的80多個基因之一,MIZOBUCHI等[13]的研究表明,RP1基因變異類型/位置和臨床表型之間存在基因型-臨床表型相關(guān)性。RIERA等[14]的研究描述了由RP1基因突變引起的黃斑營養(yǎng)不良表型,并在該基因中建立了新的基因型-表型相關(guān)性。本研究所發(fā)現(xiàn)這9個RP1基因突變位點,與視網(wǎng)膜色素變性之間及這些相關(guān)病例所表現(xiàn)出來的特殊臨床表型之間,是否存在必然的聯(lián)系,還需要通過動物實驗、基因敲除、基因修復(fù)等進(jìn)一步的研究來驗證。

    近年來二代高通量基因測序技術(shù)發(fā)展迅速,可利用特制探針或基因擴增,對特定的蛋白編碼區(qū)域DNA或某段特定序列進(jìn)行目標(biāo)捕獲并富集,進(jìn)行高通量測序。該技術(shù)具有效率高、費用低、時間短等優(yōu)點,為大量表型復(fù)雜的視網(wǎng)膜色素變性家系研究提供了技術(shù)支持,是遺傳性視網(wǎng)膜色素變性疾病的有效檢測手段,有助于研究者發(fā)現(xiàn)新發(fā)位點突變,并且臨床上可以輔助診斷視網(wǎng)膜色素變性類型,提高該類疾病臨床診治能力。此外,對于臨床RP1基因治療,必須全面了解疾病的自然病程,特別是要了解不同的表型,才能較好地評估治療效果。

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