常壓室溫等離子體誘變選育丁烯基多殺菌素高產(chǎn)菌株及培養(yǎng)基優(yōu)化

張逍遙，郭 超，王靖楠，劉艷麗，王 超?

（1. 國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京 100037；2. 北京城市學(xué)院 MCMM中心，北京 100083）

儲糧害蟲為害是威脅我國糧食安全的因素之一，害蟲的爆發(fā)不僅會造成糧食損失，它們的排泄物、尸體等還會使糧食發(fā)霉變質(zhì)，甚至產(chǎn)生人體有害的物質(zhì)。因此我國儲糧防治迫切需要新型、綠色、安全和高效的防治技術(shù)。

丁烯基多殺菌素（butenyl-spinosyns）是好氧型菌須糖多孢菌（Saccharopolyspora pogona）的次級代謝產(chǎn)物，由糖苷配基和兩側(cè)糖基（側(cè)鏈糖基一般為鼠李糖基團和福樂糖胺基團）構(gòu)成的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。其與美國陶氏益農(nóng)公司上市的多殺菌素（spinosyns）結(jié)構(gòu)相似且殺蟲機制相同，對多殺菌素難以控制的鱗翅目中煙青蟲、蘋果小卷葉蛾等，鞘翅目中的馬鈴薯甲蟲及半翅目中的蘋果蠹蛾能有效毒殺，是一種具有潛在應(yīng)用價值的新一代多殺菌素類生物殺蟲劑。

郭超[1]等從 162份土壤樣品中，分離得到15 000余株放線菌建立放線菌庫，利用蚊子幼蟲生物測定法篩選產(chǎn)多殺菌素及其結(jié)構(gòu)類似物，獲得1株產(chǎn)丁烯基多殺菌素的菌株，并完成了16 s RNA鑒定、全基因組序列測定、理化誘變等研究工作。但從環(huán)境中篩選得到的野生型菌株存在著生長緩慢、生物量較低、發(fā)酵過程調(diào)控難等缺點，導(dǎo)致菌株性能達不到工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用需求。因此采用適當(dāng)?shù)倪x育手段篩選高產(chǎn)突變株并對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，提高其發(fā)酵能力成為目前研究的重點。

常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種儀以氦氣作為工作氣體，在大氣壓的作用下產(chǎn)生高濃度活性粒子的等離子體射流[2]，使DNA單鏈或者雙鏈發(fā)生斷裂，造成 DNA損傷，進而誘發(fā)細胞啟動應(yīng)急修復(fù)機制，引起微生物突變[3]。ARTP誘變技術(shù)極大程度地加快了微生物誘變育種的進程，在菌種改良及微生物合成能力等方面有廣泛應(yīng)用。田萍萍等[4]對阿維菌素進行 ARTP誘變篩選，結(jié)果證實ARTP技術(shù)能顯著提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。

由于培養(yǎng)基中的碳源對菌絲體生長及次生代謝產(chǎn)物合成有著重要作用。對發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源進行優(yōu)化，是提高丁烯基多殺菌素產(chǎn)量最行之有效的方法。借助響應(yīng)曲面分析方法可通過較少的實驗次數(shù)獲得最優(yōu)工藝參數(shù)，從而有效的確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方。陳爽[5]對發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、可溶性淀粉、糊精和甘露醇復(fù)合搭配后，優(yōu)化后使丁烯基多殺菌素產(chǎn)量提高 52.1%。夏立秋團隊[6]對11種常見碳源進行代謝途徑分析，以5 g/L的甘露糖作為單一碳源添加時，顯著提高了丁烯基多殺菌素產(chǎn)量1.78倍。這可能是因為甘露糖除能產(chǎn)生乙酰-CoA外，還能轉(zhuǎn)化 GDP-D-rhamnose，而鼠李糖正是形成細胞壁和丁烯基多殺菌素的重要前體。

目前國內(nèi)外對于丁烯基多殺菌素高產(chǎn)菌株選育和發(fā)酵調(diào)控方面的研究較少，但其結(jié)構(gòu)類似物多殺菌素在菌株誘變選育[7-9]、分子生物學(xué)改造[10-12]、發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[13-15]等方面的研究較為深入，相信借鑒其研究經(jīng)驗對于丁烯基多殺菌素的提產(chǎn)具有重要意義。本文以ASAGF 2-G4作為研究對象，對該菌株進行ARTP和NTG復(fù)合理化誘變選育，篩選出穩(wěn)定遺傳且高產(chǎn)的突變菌株，對其發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化，以期進一步提高丁烯基多殺菌素產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 出發(fā)菌株

ASAGF 2-G4由國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院篩選和保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制和培養(yǎng)方法

（1）固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖4.0，酵母提取物4.0，麥芽提取物10.0，CaCO32.0，瓊脂20.0，pH7.2。（2）搖瓶培養(yǎng)基S2及96孔板種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.0，F(xiàn)M888 30.0，胨化牛奶 5.0，MgSO4·7H2O 2.0，KH2PO40.5，pH7.2。（3）搖瓶及 96孔板發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.0，糊精 20.0，玉米漿干粉 10.0，MgSO4·7H2O 1.0，胨化牛奶10.0，棉籽蛋白20.0，CaCO35.0，NaCl 2.0，pH7.2。以上培養(yǎng)基均在115 ℃，滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑和儀器

棉籽蛋白、玉米漿干粉：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；FM888：安琪酵母股份有限公司；其他試劑：國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備孢子懸液

取培養(yǎng)成熟的新鮮菌種斜面，加入 20 mL 0.02%無菌葡萄糖溶液沖洗斜面，將表面的孢子刮下后置于含15～20顆玻璃珠的無菌三角瓶中，置于恒溫恒濕搖床，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，溫度為28 ℃培養(yǎng)8～12 h，孢子懸液濃度一般控制在約108個/mL。

1.2.2 ARTP誘變

實驗前預(yù)先將一定數(shù)量載片滅菌，置于酒精燈外焰灼燒30 s，冷卻后取10 μL孢子液均勻涂于載片。以氦氣作為等離子體的工作氣體，以ASAGF 2-G4為出發(fā)菌株，在電源功率100 W，照射距離 2 mm，等離子體溫度＜30 ℃，氣流量10 L/min的條件下，分別將孢子懸液處理進行等離子體照射 0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 s。

1.2.3 NTG誘變

配制10 mg/mL的NTG母液。取萌發(fā)好的孢子懸浮液于離心管中，使誘變終濃度為2 mg/mL。將孢子懸液分別處理 10、20、30、40、50、60 min，14 000 r/min離心10 min收集孢子，無菌水重復(fù)洗滌三次。處理后的溶液移入飽和硫代硫酸鈉溶液中。

1.2.4 稀釋涂布

將經(jīng)誘變處理的孢子懸液進行 10-2～10-6稀釋，取100 μL稀釋液涂布于預(yù)先倒置好的平面培養(yǎng)基上，于 30 ℃培養(yǎng)，每日觀察菌落的生長速度和菌落形態(tài)，并拍攝特殊形態(tài)的菌落。

1.2.5 96 孔板高通量發(fā)酵培養(yǎng)

將 96孔板的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基在無菌條件下，使用美國RAININ BenchSmart 96半自動移液系統(tǒng)分裝至96深孔板中，裝液量600 μL。用無菌牙簽挑取生長速度快、形態(tài)特殊的單菌落于96孔板中，蓋上配套的三明治蓋，在恒溫恒濕搖床上設(shè)置240 r/min，30 ℃進行96孔板種子培養(yǎng)，培養(yǎng)65 h后轉(zhuǎn)接二級種子液，培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)接發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)9～10 d。

1.2.6 丁烯基多殺菌素測定法

向96孔板發(fā)酵液中，加入2倍體積甲醇浸提丁烯基多殺菌素，充分振蕩后，4 ℃靜置過夜。以4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL至新的離心管管內(nèi)，以10 000 r/min，離心10 min后進行 HPLC檢測。分析條件為：安捷倫 C18反相柱；流動相為 V乙腈∶V甲醇∶V水=45∶45∶10（含0.05%乙酸銨）；進樣量設(shè)置10 μL；流速設(shè)置1.0 mL/min；檢測波長為244 nm。根據(jù)積分面積，計算產(chǎn)量。

1.2.7 丁烯基多殺菌素產(chǎn)量性狀遺傳穩(wěn)定性實驗

將獲得的高產(chǎn)菌株連續(xù)劃斜面試管進行搖瓶驗證，轉(zhuǎn)接3～4次，利用HPLC測丁烯基多殺菌素發(fā)酵產(chǎn)量，轉(zhuǎn)接幾代后產(chǎn)量變化幅度不大的則認(rèn)為遺傳穩(wěn)定性較好。

1.2.8 Plackett-Burman實驗設(shè)計

設(shè)計 PB實驗，從發(fā)酵培養(yǎng)基中快速篩選出顯著因素，篩選設(shè)計了影響因素主要是葡萄糖、糊精、棉籽蛋白、玉米漿干粉、MgSO4、胨化牛奶、NaCl和CaCO3，考察影響丁烯基多殺菌素含量的主導(dǎo)因素及交互作用，篩選出主要因素。Plackett-Burman實驗各因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman實驗因素水平Table 1 The factors and level of the Plackett-Burman design g/L

1.2.9 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化

根據(jù)Plackett-Burman實驗所得的回歸方程系數(shù)與篩選到的影響顯著因素，確定響應(yīng)面設(shè)計的考察因素與中心點。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Origin 8.0、SPSS 22.0、Excel等軟件進行分析。在系統(tǒng)誤差允許存在的情況下，當(dāng)突變菌株丁烯基多殺菌素產(chǎn)量與出發(fā)菌株產(chǎn)量的比值不低于110%時，則菌株表現(xiàn)為正突變；當(dāng)比值不高于90%時，則菌株表現(xiàn)為負(fù)突變；當(dāng)比值介于兩者之間時，則表示菌株未突變。

突變率=正突變率+負(fù)突變率；致死率（%）=（未經(jīng)誘變的總單菌落數(shù)-誘變后的總單菌落數(shù)）/未經(jīng)誘變的總菌落數(shù)×100%；丁烯基多殺菌素產(chǎn)量（μg/mL）=（組分 A+組分 D）/8065.4032×稀釋倍數(shù)；丁烯基多殺菌素相對產(chǎn)量=平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP與NTG復(fù)合誘變對ASAGF 2-G4的作用

2.1.1 ARTP誘變時間對ASAGF 2-G4的影響

由圖1可知，隨著等離子體照射時間的不斷延長，致死率逐漸增加，且致死效果非常顯著，ARTP處理90 s時，致死率已達到98%以上。對2-G4的突變率進行分析發(fā)現(xiàn)（如圖2），整體的正突變率趨勢為逐漸升高，而負(fù)突變率則是隨著誘變時間的延長不斷減小，在 300 s等離子體照射劑量下，篩選到的正突變菌株最多，當(dāng)誘變時間高于20 min時沒有正突變菌株出現(xiàn)。

圖1 ARTP對菌株2-G4誘變的致死率曲線Fig. 1 The lethal rate of different time by ARTP on strain 2-G4

圖2 不同劑量ARTP對2-G4突變率的影響Fig. 2 Mutation rate of 2-G4 when the strain was treated by ARTP radiation in different time

2.1.2 ARTP與NTG復(fù)合誘變對2-G4的影響

由圖3可知，ARTP和NTG復(fù)合誘變對2-G4的致死效應(yīng)明顯，當(dāng)2 mg/mL的NTG處理10 min時2-G4的致死率已高達98%。對2-G4的突變率進行分析發(fā)現(xiàn)（如圖4），在10 min和20 min誘變時間下，篩選到的正突變菌株較多。

圖3 ARTP與NTG復(fù)合誘變對菌株2-G4的致死率曲線Fig. 3 The lethal rate of different time by ARTP and NTG compound on strain 2-G4

圖4 不同時間ARTP對2-G4突變率的影響Fig. 4 Mutation rate of 2-G4 when the strain was treated by ARTP and NTG compound radiation in different time

2.1.3 高產(chǎn)突變株代謝曲線的考察

本研究以2-G4為出發(fā)菌株進行ARTP和NTG復(fù)合誘變，挑取870余單菌落進行發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)過搖瓶初篩和復(fù)篩，丁烯基多殺菌素高產(chǎn)菌株編號及產(chǎn)量如表2所示。突變株在傳代中可能出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，因此，對5株高產(chǎn)菌株進行了遺傳穩(wěn)定性驗證，如圖5所示。突變菌株2-A9經(jīng)過3次轉(zhuǎn)接傳代后，丁烯基多殺菌素相對產(chǎn)量分別降低了 10.03%、8.05%，第 4次轉(zhuǎn)接產(chǎn)量較第 3次提高了0.68%；與轉(zhuǎn)接1次相比，突變株5-H12轉(zhuǎn)接 2、3、4次分別降低了 35.29%、30.43%、12.51%，產(chǎn)量變化幅度較大，表明其遺傳穩(wěn)定性較差。其余菌株與 2-A9菌株相比產(chǎn)量較低。ASAGF 2-G4菌株經(jīng)ARTP誘變處理60 s后篩選出 1株發(fā)酵產(chǎn)量較高，且穩(wěn)定遺傳的突變菌株2-A9，比出發(fā)菌株提高30.92%。

圖5 突變株的遺傳穩(wěn)定性驗證Fig. 5 The genetic stability of mutants

表2 高產(chǎn)突變株的丁烯基多殺菌素產(chǎn)量Table 2 The butenyl-spinosyns production of the high yield mutant strain by shake flask culture %

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化對ASAGF 2-G4的作用

2.2.1 Plackett-Burman實驗設(shè)計

利用Design-Expert軟件進行優(yōu)化處理，結(jié)果如表3和表4所示。模型F值為12.608 8，模型極顯著（P＜0.01）表明該模型具有重要意義，R2Adj=0.885 573，說明該實驗數(shù)據(jù)較好的用于模型解釋。產(chǎn)量影響因素依次為A＞D＞C＞B＞F＞E＞H＞G，其中A、D對產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01），B、C對產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05），胨化牛奶對產(chǎn)量的影響接近顯著水平。獲得一次多元線性編碼方程：21.35-1.65A+0.75B+1.04C+1.20D-0.40E-0.63F-0.07G-0.32H。

表3 Plackett Burman實驗設(shè)計結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experiment design and response values

表4 Plackett-Burman實驗設(shè)計方差分析Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman design

因此，選取葡萄糖、糊精、棉籽蛋白和玉米漿干粉4個因素進行響應(yīng)面設(shè)計。

2.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

2.2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化及分析 根據(jù)生成的3D圖，如圖6所示，其最佳濃度分別為：葡萄糖60 g/L、糊精 25 g/L、棉籽蛋白 25 g/L和玉米漿干粉12.5 g/L，預(yù)測得到丁烯基多殺菌素達最高值。

圖6 葡萄糖、糊精、玉米漿干粉、棉籽蛋白濃度交互作用對丁烯基多殺菌素產(chǎn)量影響的響應(yīng)面Fig. 6 Response surface plots of effects of interaction between of glucose、dextrin、corn steed solids and cottonseed protein content on the yield of butenyl-spinosyns

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

2.2.2.2 優(yōu)化培養(yǎng)基的驗證 為了確定實驗結(jié)果的可靠性，對上述優(yōu)化培養(yǎng)基進行重復(fù)實驗驗證，最終丁烯基多殺菌素平均產(chǎn)量與預(yù)測值接近，表明模型是可行有效的。

3 討論

從環(huán)境中篩選得到的野生型菌株因目標(biāo)物合成能力較差，達不到工業(yè)化生產(chǎn)需求。雖然有關(guān)須糖多孢菌的全基因組序列已完成解析，但丁烯基多殺菌素生物合成途徑復(fù)雜且調(diào)控機制的研究較少，使得工程菌株的改造困難。通過常規(guī)誘變技術(shù)包括紫外（UV）誘變、NTG誘變、60Co-γ誘變、ARTP誘變等能夠獲得性能大幅提高的突變菌株。因此本研究采用ARTP和NTG復(fù)合誘變，并結(jié)合96孔板培養(yǎng)進行了初篩和搖瓶復(fù)篩，獲得了產(chǎn)量較高且遺傳穩(wěn)定的 1株突變菌株 2-A9（ARTP誘變時間60 s），較出發(fā)菌株提高30.92%。但常規(guī)的理化誘變技術(shù)存在著工作量大、篩選周期長等缺點，限制了其的應(yīng)用。

種子是微生物發(fā)酵生產(chǎn)至關(guān)重要的一步，良好的培養(yǎng)條件是獲得高產(chǎn)種子的關(guān)鍵。目前對于發(fā)酵條件優(yōu)化最好的方式就是采用數(shù)理統(tǒng)計法，對發(fā)酵過程建立數(shù)學(xué)模型，通過適時調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)，實現(xiàn)對發(fā)酵過程的優(yōu)化控制。目前常用方法包括：單因素實驗法、響應(yīng)面分析法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模法等，徐瑤[16]在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行了Plackett-Burman，利用最陡爬坡及中心響應(yīng)面方法最終確定了各個組分的最佳濃度，使得較原始培養(yǎng)基產(chǎn)量提高了17.44%。本研究首先通過Plackett-Burman實驗設(shè)計，分析了發(fā)酵培養(yǎng)基中影響顯著的因素，結(jié)果表明葡萄糖、糊精、棉籽蛋白和玉米漿干粉為影響丁烯基多殺菌素發(fā)酵的顯著因素，并利用響應(yīng)面實驗設(shè)計，以較少實驗次數(shù)的 3D圖形更直觀清楚地獲得發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配比為（g/L）：葡萄糖 60.0、糊精 25.0、棉籽蛋白25.0、玉米漿干粉12.5、胨化牛奶10.0、MgSO41.0、NaCl 2.0和CaCO35.0。使得丁烯基多殺菌素產(chǎn)量得到提升。

碳源是培養(yǎng)基的重要組成部分，對菌絲體生長及次生代謝產(chǎn)物的生物合成有著重要作用，并且碳源是構(gòu)成菌體碳架材料與形成含氮產(chǎn)物的重要來源，發(fā)酵過程中對碳源的利用也會影響菌株對氮源的消耗。對發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源進行優(yōu)化，是提高丁烯基多殺菌素產(chǎn)量最行之有效的方法。此外，適宜的外界環(huán)境也在一定程度上幫助次級代謝產(chǎn)物合成的提高。余龍江等[17]將 10天的發(fā)酵培養(yǎng)期按發(fā)酵特點不同分為四個階段，分別采用不同濃度的溶氧量，使得同為好氧菌的刺糖多孢菌的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量達180 mg/L。發(fā)酵液的pH也在一定程度上影響微生物的生長與代謝。因此，陳紀(jì)龍[18]和Li[19]等提出兩階段pH調(diào)控手段，使得發(fā)酵體系中的葡萄糖利用率增加且達到提產(chǎn)目的。植物油水解后會生成甘油以及短鏈脂肪酸，添加入培養(yǎng)基后不但可以緩解葡萄糖阻遏，還能夠補充抗生素合成的前體物質(zhì)，也可作為消泡劑。Huang等[20]在搖瓶中加入草莓籽油和山茶油，使多殺菌素產(chǎn)量提高了80%以上。張瀚等[21]在發(fā)酵0 h添加15 g/L的山茶油使菌株多殺菌素產(chǎn)量顯著提升。

丁烯基多殺菌素生物合成受到多種因素影響，相信隨著未來研究者們的深入研究，丁烯基多殺菌素產(chǎn)生菌的合成能力可進一步提高。