青稞真菌毒素檢測分析

連 倩，賈湃湃，肖 明,，崔明明，孫小鳳

（1. 青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室（西寧），青海 西寧 810016）

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于小麥、水稻等農(nóng)產(chǎn)品中[1]。真菌毒素污染是全球性問題，大多數(shù)國家的谷物都受到不同程度的真菌毒素的污染[2]。在歐洲，2006—2007年，意大利的翁布里亞地區(qū)玉米中 DON含量最高達(dá)14.00 mg/kg[3]。奧地利玉米中DON的檢出率高達(dá)95%，其他谷類也有60%，70%的玉米同時也檢出了玉米赤霉烯酮[4]。在我國，2010年12個省份的215份玉米樣品中ZEN檢出率為69.30%[5]。青稞是一種高原特色顯著的健康食物資源[6]，它在青藏高原地區(qū)得到廣泛種植，是藏族人民的基本口糧。青稞質(zhì)量安全不僅與青藏高原地區(qū)的農(nóng)業(yè)發(fā)展息息相關(guān)，還直接影響到人民的身體健康[7]。此外青稞還具有高蛋白質(zhì)、高可溶性纖維、高維生素和低脂肪、低糖的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[8]，因此具有很高的食療價值[9]。因此，它的質(zhì)量安全也受到廣泛的關(guān)注與重視。在所有影響青稞質(zhì)量的安全因子中，真菌毒素是其中的一個主要因素。由于青稞在儲藏過程中時間較長，存儲不當(dāng)將有可能導(dǎo)致青稞發(fā)霉變質(zhì)，產(chǎn)生毒素。迄今發(fā)現(xiàn)超過400種真菌毒素[10]，主要有黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）及伏馬毒素等，這些毒素對人體具有致畸、致癌、致突變、降低免疫力和肝硬化等慢性毒性[11-12]。真菌毒素對糧食的污染不僅對人畜健康造成危害，而且有可能產(chǎn)生食品貿(mào)易糾紛。因此，真菌毒素在糧食中的污染問題受到世界各國和有關(guān)國際組織的高度重視。

本研究利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法，對青稞原糧中13種主要真菌毒素進(jìn)行檢測，以初步探明青稞產(chǎn)品真菌毒素等高風(fēng)險產(chǎn)區(qū)及監(jiān)管重點(diǎn)，為青稞的科學(xué)研究、促進(jìn)生產(chǎn)、有效監(jiān)管提供數(shù)據(jù)支撐，也為我國居民安全消費(fèi)提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

青稞樣品共 299份：分別從青海、四川、甘肅、西藏采集，如表1所示；

表1 樣品信息采集Table 1 Sample information collection 份

13種毒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%），伏馬毒素B1（Fumonisin B1，F(xiàn)B1）、伏馬毒素 B2（Fumonisin B2，F(xiàn)B2）、伏馬毒素 B3（Fumonisin B3，F(xiàn)B3）、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素 G1（Aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFG2）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌稀醇（3-Acetyldeoxynivalenol，3-ADON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌稀醇（15-Acetyldeoxynivalenol、15-ADON）、DON、雪腐鐮刀菌烯醇（Nivaleno，NIV）、ZEN、T-2毒素（T-2 Toxin）：北京美正檢測技術(shù)有限公司；乙腈、甲酸為色譜純：上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

LCMS-8050三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀：島津有限公司；FLBP-200萬能高速粉碎機(jī)：上海菲力博食品機(jī)械有限公司；VORTEX-5渦旋振蕩器：北京海天友誠科技有限公司；H1850R離心機(jī)：長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DC-12氮吹儀：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取1 mg（精確至0.01 mg）13種標(biāo)準(zhǔn)品分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到13種濃度為100 mg/L的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于-20 ℃冰箱中避光保存，備用。實(shí)驗(yàn)中使用的單個標(biāo)準(zhǔn)工作液，均由單個標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋得到，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

采集的青稞樣品，挑出其中的石塊、草根及其他植物殘體，用80目的篩子篩走樣品中殘帶的細(xì)泥沙，使用破壁機(jī)粉碎青稞，得到青稞均勻粉末，裝塑封袋貼標(biāo)簽備用。量取5 mL乙酸，400 mL乙腈，100 mL水，混合配制成提取液。稱取2.00 g樣品于50 mL離心管內(nèi)，加入10 mL提取液，在30 ℃下超聲10 min，期間不斷搖勻三次，渦旋振蕩5 min至充分混勻，在10 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 mL至離心管中，氮吹干后加提取液0.5 mL，混勻，過0.22 μm濾膜于樣品瓶內(nèi)，待上機(jī)。

1.3.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：C18液相色譜柱（2.1 mm×100 mm,1.7 μm），流動相A: 1%乙酸和5 mmol/L 乙酸銨水溶液；流動相 B:甲醇，進(jìn)樣量：2 μL，流速:0.3 mL/min，柱溫：35 ℃。

梯度洗脫程序：0～2 min，10.0% B；3～10.5 min，20%～60% B；13.5～18.0 min，60%～75% B，18.1～22.0 min，95%～10% B。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）；霧化氣：氮?dú)猓?9.999%）；碰撞氣：氮?dú)猓?9.999%）；霧化氣壓力：40 psi；干燥器溫度：350 ℃；干燥器流量：10 L/min；毛細(xì)管電壓：4 000 V。

1.3.4 真菌毒素限量規(guī)定

限量標(biāo)準(zhǔn)參照相關(guān)[13-14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用 Excel、SPSS 23. 0、Origin 2018 等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞真菌毒素各地情況

全部樣品中真菌毒素均未超標(biāo)，僅檢出T-2、ZEN兩種真菌毒素。T-2毒素是由多種真菌，主要是三線鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物之一[15]。它在自然界中存在廣泛，是常見的污染田間作物和庫存谷物的主要毒素，對人、畜危害較大[16-18]。如表2所示，T-2毒素在所有樣品中檢出率為25.75%，在青海樣本中檢出率為49.26%，是甘肅地區(qū)檢出率的3倍；甘肅樣本中檢出T-2毒素檢出率為16.67%；四川樣本中，T-2毒素檢出率為13.89 %，最高含量為68 μg/kg；西藏樣本中未檢出 T-2毒素。研究表明 T-2毒素在變溫、高水分含量且溫度在3～7 ℃條件下最適宜生長[19]。青海地區(qū)樣本主要采集于門源縣，門源氣候濕潤、水量充足且青稞黑穗病發(fā)生普遍，因此檢出 T-2毒素頻率較高。ZEN只有在四川和西藏兩個地區(qū)檢出，檢出率四川地區(qū)為8.33%，最高含量為52 μg/kg；西藏地區(qū)檢出率較低，為3.09%。

表2 各地區(qū)青稞毒素含量Table 2 Content of highland barley toxin in different regions

2.2 各青稞品種毒素情況

北青8號、肚里黃、昆侖14號均檢出T-2毒素。黑青稞中兩種毒素均檢出，但含量均較低，抗逆性較強(qiáng)。T-2在青稞品種中分布情況如表3所示，T-2毒素在七種品種中均有檢出，其中北青8號檢出T-2毒素最多，肚里黃次之，昆侖14號中檢出較多，其中北青8號不抗倒伏，中抗條紋??；肚里黃較抗倒伏，抗病蟲害；昆侖14號抗倒伏性強(qiáng)，中抗條紋病及云紋病。青稞品種的抗倒伏性及抗病蟲害能力影響青稞籽粒毒素的生成。倒伏發(fā)生以后，部分葉片被壓倒或折損，無法獲得足夠的光照，影響葉片光合作用，嚴(yán)重時葉片會變黃甚至腐爛，如果土壤濕度大，倒伏后的植株更易滋生毒素。ZEN在青稞品種中分布情況如表4所示，ZEN毒素僅在藏青2000、當(dāng)?shù)仄贩N及黑青稞三種青稞品種中檢出，ZEN毒素在各品種中檢出率均未超過2.40%。

表3 T-2在青稞品種中分布情況Table 3 T-2 distribution of highland barley varieties 份

表4 ZEN在青稞品種中分布情況Table 4 Distribution of ZEN in highland barley varieties 份

2.3 毒素在不同貯存條件中檢出情況

兩種毒素在不同貯存條件下檢出情況如表5所示，兩種毒素在農(nóng)戶貯存中均有檢出，并且檢出率在農(nóng)戶貯存條件下均高于在農(nóng)場貯存條件下。T-2毒素在農(nóng)戶中檢出率達(dá)33.16%，是在農(nóng)場貯存中檢出率的3.71倍；ZEN僅在農(nóng)戶貯存中檢出。統(tǒng)計分析顯示，T-2、ZEN在不同貯存條件下的檢出率具有顯著性差異（P＜0.05）。農(nóng)場貯存青稞選擇聯(lián)合收割機(jī)統(tǒng)一收割，收割時間短，避免突遇陰雨天氣，而使成熟糧含水率增加。選擇糧倉儲存，溫度控制在10～15 ℃，相對濕度控制在65%以內(nèi)，且通風(fēng)條件較好；而青稞農(nóng)戶貯存一般為人工收割，碾場脫粒，庭院晾曬，土樓庫存。中間籽粒暴露環(huán)節(jié)多，尤其庫房多年使用終年沒有陽光，相對陰潮，溫濕度得不到很好的控制，容易滋生真菌。

表5 兩種毒素在不同貯存條件下檢出情況Table 5 Detection of three toxins under different storage conditions

2.4 毒素在不同收獲方式下檢出情況

兩種毒素在不同收獲方式下檢出情況如表6所示，T-2在機(jī)械收獲條件下檢出率為 42.95%，ZEN僅在人工收獲方式下檢出，檢出率為3.50%。統(tǒng)計分析顯示，T-2、ZEN檢出率在不同收獲方式下具有顯著性差異（P＜0.05）。

表6 兩種毒素在不同收獲方式下檢出情況Table 6 Detection of three toxins under different harvest methods

3 結(jié)論

本研究在前期調(diào)研的基礎(chǔ)上，選取四川、青海、西藏和甘肅4 個青稞種植省份作為采樣點(diǎn)，采集了299份并分析13種真菌毒素的污染情況。結(jié)果顯示，T-2、ZEN在全部樣品中的檢出率分別為 25.75%、2.00%，但均未超標(biāo)，由此說明 T-2毒素是主要污染物，且兩種毒素污染水平較低。青海主要受T-2毒素污染，檢出率為49.26%，高于其他 3個省份。總體來看，4個省份青稞受真菌毒素污染水平較低。真菌毒素產(chǎn)生受多種因素影響，本研究分析了不同地域、不同品種、不同貯存條件及不同收獲方式對真菌毒素產(chǎn)生的影響，研究顯示不同地域，由于氣候條件不一，水量充足且溫濕度較高的地區(qū)受毒素污染嚴(yán)重；抗倒伏、抗病蟲害的品種不易受毒素污染；農(nóng)戶貯存條件下，由于儲藏條件不科學(xué)，儲藏室陰暗潮濕，毒素檢出較多；機(jī)械收獲對青稞籽粒造成的損傷高于人工收獲，因此 T-2毒素檢出較高。為減輕毒素污染，應(yīng)采取合理的措施進(jìn)行防控，可選擇抗性強(qiáng)青稞品種，合理灌溉，控制濕度，植株成熟后盡快收獲并晾曬，盡量在通風(fēng)良好的條件下儲存。在后續(xù)研究中，還可繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，監(jiān)測其他影響因素，如氣候條件、土壤類型、溫濕度等。目前糧食真菌毒素已引起廣泛關(guān)注，國家有關(guān)部門對此高度重視，采取有效措施，妥善處理被真菌毒素污染的超標(biāo)糧食，確保不用做食用用途，保障廣大人民群眾“舌尖上的安全”。