京研綠翡翠黃瓜品種純度的SSR 鑒定

孟淑春，徐秀蘋，劉立功，宋順華，張 峰

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京 100097；2.中國科學(xué)院植物研究所系統(tǒng)與進化植物學(xué)國家重點實驗室，北京 100093）

黃瓜（Cucumis sativusL.）是葫蘆科（Cucurbitaceae）黃瓜屬黃瓜亞屬中的一個種，起源于喜馬拉雅山南麓的印度北部、錫金、尼泊爾和中國的云南地區(qū)。黃瓜通常以嫩瓜供食用，在長期的自然選擇、遺傳漂移和人工選育的多重作用下，形成了各具特色的黃瓜栽培類型和品種，并成為全世界主要蔬菜之一，以亞洲栽培最多。中國的收獲面積150 萬hm2，年總產(chǎn)量 2 555 萬 t，居世界首位［1］。由于黃瓜適宜多種保護地栽培，加之保護地設(shè)施條件和栽培技術(shù)的不斷改善和進步，延長了黃瓜的生長期，實現(xiàn)了黃瓜的周年生產(chǎn)和均衡供應(yīng)，明顯地提高了經(jīng)濟效益。人民生活水平的提高加大了對黃瓜品種類型多元化的需求。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展，育種手段多樣化，育種進程不斷加快，黃瓜優(yōu)新品種的數(shù)量也逐步增加。

品種純度檢測越來越受到育種家、種子經(jīng)銷商和種植農(nóng)戶的重視，商品種子純度鑒定已經(jīng)成為種子銷售前確保種子質(zhì)量的關(guān)鍵一環(huán)。傳統(tǒng)的田間種植方法鑒定品種純度，時間長、步驟多，時效性差，受土壤、溫度等因素的影響，果實、莖葉等數(shù)量性狀常常產(chǎn)生不同程度的偏差，受人為因素影響較大，檢測的準確性不穩(wěn)定，直接影響到優(yōu)良品種的示范、推廣和銷售［2］。此外由于鑒定周期長，通常需要一個生長季，當(dāng)年生產(chǎn)的種子往往要到次年才能銷售，容易錯失商機，且不利于新品種選育與示范推廣的高效循環(huán)。分子標記技術(shù)日新月異的發(fā)展為提高品種純度、品種真實性鑒定的準確性、時效性、可重復(fù)性提供了更為便捷的技術(shù)支撐，已經(jīng)在一些主要農(nóng)作物和主要蔬菜上取得良好效果，其中SSR 標記技術(shù)是最為簡便、可靠的鑒定方法之一［3］，廣泛地應(yīng)用于水稻、玉米、棉花、油菜、茄子、大白菜等多種作物上。近年來在黃瓜重要基因定位［4-6］、種質(zhì)資源多樣性分析［7，8］、純度鑒定［9-11］等方面得到廣泛應(yīng)用。

京研綠翡翠是北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心黃瓜開發(fā)課題組最新培育的保護地專用華南型黃瓜新品種。京研綠翡翠為強雌型黃瓜，瓜長17 cm 左右，瓜色綠、有光澤，瘤大較稀，生長勢強，綜合抗病性好，適宜春秋保護地種植。2020 年獲得非主要農(nóng)作物品種登記證書，為保證京研綠翡翠的商品種質(zhì)量，現(xiàn)以京研綠翡翠父本、母本以及F1為材料，利用SSR 分子標記技術(shù)進行黃瓜純度鑒定試驗方法研究，篩選多態(tài)性豐富的SSR 引物，根據(jù)PCR 產(chǎn)物的帶型差異，將特異性譜帶作為SSR 分子標記，進行京研綠翡翠商品種的純度鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

京研綠翡翠黃瓜及其父、母本，為北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心培育品種。

1.2 DNA 提取

將種子置于紙床發(fā)芽，種苗長到2.5 cm 左右，采用 CTAB 法提取種苗基因組 DNA［12］。

1.3 特異性條帶篩選

以京研綠翡翠父本、母本及其商品種的種苗基因組DNA 為模板，采用63 對SSR 引物，引物來源參考文獻［11］和［13］，由生工生物工程（上海）有限公司合成。利用PCR 技術(shù)對重復(fù)序列進行擴增［10］，擴增結(jié)束后，采用2.5%高分辨率瓊脂糖進行電泳。根據(jù)PCR 產(chǎn)物的帶型差異，選擇雜交種既具有父本帶型又具有母本帶型，即父母本互補型的引物，進一步檢測個體。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性條帶的篩選

應(yīng)用63 對SSR 引物對黃瓜新品種京研綠翡翠父本、母本和F1的基因組DNA 進行PCR 擴增，通過對其SSR 帶型進行篩選分析，每對引物擴增的位點為1～3 個，大小介于150～350 bp，大部分位點集中在200～300 bp。擴增產(chǎn)物電泳檢測顯示16 對引物在親本和F1之間具有多態(tài)性，雜交種后代兼具父本和母本的帶型特征，表現(xiàn)出共顯性分離，具有互補性，可以用來鑒定雜交種的純度。這16 對引物擴增得到的特異性片段構(gòu)成了京研綠翡翠的SSR 指紋圖譜。其中10 對引物擴增的多態(tài)性片段亮度相近，共顯性片段清晰、片段長度差大于10 bp，易于辨識，分別 是 SSR03070、SSR05748、SSR02771、SSR06210、SSR03820、SSR11043、SSR22706、SSR07100、SSR 15955、SSR19918（表 1、圖 1 至圖 4）。另外 6 對引物SSR00262、SSR07131、SSR02309、SSR01012、SSR 31399、SSR03917，能夠擴增出穩(wěn)定條帶，但是多態(tài)性片段長度差小于10 bp，電泳距離較短的時候不容易區(qū)分。

表1 多態(tài)性豐富的SSR 引物序列

圖1 京研綠翡翠特異性標記SSR03070 和SSR05748

圖2 京研綠翡翠特異性標記SSR02771、SSR06210、SSR03820

圖3 京研綠翡翠特異性標記SSR11043、SSR22706、SSR07100

圖4 京研綠翡翠特異性標記SSR15955 和SSR19918

2.2 SSR 純度鑒定

隨機選取400 粒京研綠翡翠黃瓜種子，從10 對產(chǎn)生特異性分子標記的SSR 引物中篩選出譜帶最清晰的引物SSR05748 對其進行SSR 純度鑒定（圖5），結(jié)果表明，SSR 分子標記方法與田間鑒定方法的結(jié)果一致。

圖5 特異性標記SSR05748 在京研綠翡翠父母本及其雜交F1中的擴增效果

3 小結(jié)與討論

品種純度是種子質(zhì)量的重要指標，是種子質(zhì)量評價和劃分等級的重要依據(jù)［14］。品種純度是種子的生命，品種純度鑒定是種子生產(chǎn)銷售工作中不可缺少的重要步驟，種子純度如果出現(xiàn)問題，給農(nóng)民造成的直接損失可達種子價值的100 倍以上。每年新采收的種子在出售之前，都需要進行純度檢測，以確保種子的遺傳質(zhì)量［15］。通過比對400 粒京研綠翡翠種子的田間種植鑒定和實驗室SSR 分子標記檢測，發(fā)現(xiàn)分子標記與田間種植在對種子進行純度鑒定時的結(jié)果高度吻合，在統(tǒng)計上未顯示明顯的差異，采用SSR 分子標記技術(shù)替代田間種植純度鑒定，不僅能夠避免田間鑒定程序多、用時長、對環(huán)境條件要求高等缺點［2，9］，又大大提高了時效性，從而確保優(yōu)良品種能夠及時投放市場。

本研究中發(fā)現(xiàn)的16對SSR標記在京研綠翡翠父本、母本、F1的PCR擴增圖譜中呈共顯性，構(gòu)成了京研綠翡翠親本和F1的指紋圖譜。核心引物SSR03070、SSR05748、SSR02771、SSR06210、SSR03820、SSR 11043、SSR22706、SSR07100、SSR15955、SSR19918擴增出的條帶清晰、穩(wěn)定，多態(tài)性片段大小差距大于10 bp，易于識別，SSR 分子標記純度鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果吻合，為京研綠翡翠品種純度、品種真實性鑒定提供了簡便、快速、準確的鑒定方法，完全可以替代田間種植鑒定以避免資源浪費、節(jié)約土地和人力。京研綠翡翠指紋圖譜不僅可以為該品種的審定、保護和親本提純提供技術(shù)支持，還可以用于該品種種子的快速純度鑒定和品種真實性檢測，并為其相關(guān)形態(tài)學(xué)性狀和表型特征的基因定位、遺傳圖譜繪制分析提供基礎(chǔ)信息，為同類型保護地專用華南型黃瓜品種純度鑒定和真實性檢測提供備選標記。

SSR 分布于黃瓜整個基因組的不同位置上，不同品種每個位點上重復(fù)單位的數(shù)目及序列可能不同，因而形成片段長度多態(tài)性［16］。采用SSR 分子標記技術(shù)鑒定黃瓜雜交種純度時，揭示的是黃瓜基因組DNA 序列的多態(tài)性，因此SSR 引物選用的越多，鑒定結(jié)果的可靠性越高，但相應(yīng)的成本也越高［2，17］。在實際制種生產(chǎn)中，黃瓜雜交種的混雜主要來源于制種過程中的母本自交及非父本花粉的雜交，所以黃瓜雜交種的純度鑒定主要在于鑒別是否同時含有雙親血緣（條帶），因此選用1 對共顯性SSR 引物就可以達到鑒別雜種或者親本的目的，從而達到節(jié)省人力物力、省時高效的目的。