一株侵染草地貪夜蛾成蟲的球孢白僵菌的分離鑒定

龐繼鑫 溫紹海 杜廣祖 楊航 馬蕓 楊進(jìn)波 付玉飛 張庭發(fā) 易小光 李正躍 陳斌

摘要

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）是一種全球性重大玉米害蟲，于2019年入侵我國(guó)云南。2020年8月，從云南省大理彌渡西莊村玉米田采集被蟲生真菌感染的草地貪夜蛾雌成蟲，經(jīng)在室內(nèi)分離培養(yǎng)，結(jié)合病原菌分生孢子與菌絲等形態(tài)及ITS序列相似性分析，確定感染草地貪夜蛾成蟲的真菌為球孢白僵菌Beauveria bassiana，菌株編號(hào)為SHL2020。經(jīng)生物測(cè)定， 該菌對(duì)草地貪夜蛾雌、雄成蟲均具有較強(qiáng)的侵染致病作用。用該菌1×108個(gè)/mL 分生孢子菌懸液接種處理后第7天時(shí)，草地貪夜蛾雌、雄成蟲累計(jì)死亡率分別為90.0%和86.7%。以上結(jié)果表明，從罹病草地貪夜蛾雌成蟲上分離獲得的球孢白僵菌SHL2020菌株對(duì)草地貪夜蛾雌雄成蟲具有良好的生防潛力，該研究為草地貪夜蛾生物防治提供了理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。

??關(guān)鍵詞

球孢白僵菌;草地貪夜蛾;昆蟲病原真菌;致病力

中圖分類號(hào)：

S476.12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020587

Isolation and identification of an entomopathogenic fungus infecting the adult of Spodoptera frugiperda （J. E. Smith）

PANG Jixin1#，WEN Shaohai1#，DU Guangzu1，YANG Hang2，MA Yun1，YANG Jinbo2，

FU Yufei1，ZHANG Tingfa2，YI Xiaoguang2，LI Zhengyue1*，CHEN Bin1*

（1. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bioresources in Yunnan，

College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University， Kunming650201， China;

2. Yunnan Green Biotechnology Science and Technology Co. Ltd.， Dali675600， China）

Abstract

Spodoptera frugiperda （J. E. Smith） is a global major pest and invaded into Yunnan province in 2019. An infected female adult of S.frugiperda was found in corn planting field in Xizhuang village in Midu county of Dali city， Yunnan province in August 2020， and was identified by combining morphology and ITS sequence analysis. The pathogenicity of the fungus to male and female adult of the S.frugiperda was determined by conidia suspension spray method. The results indicated the fungus was identified to be? Beauveria bassiana， which was named as SHL2020. The fungus was pathogenic to both male and female adults， and the cumulative adjusted mortality was 86.7% and 90.0% at the 7th day after infection when the spore concentration was 1×108 spore/mL.? The above results indicated that B.bassiana SHL2020 fungus isolated from the female adult S.frugiperda has good biocontrol potentiality to the male and female adults of S.frugiperda， which provide the theoretical and material base for the development of the biocontrol method for S.frugiperda.

Key words

Beauveria bassiana;Spodoptera frugiperda;entomopathogenic fungus;pathogenicity

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda （J.E.Smith）， 也稱秋黏蟲，屬于鱗翅目Lepidoptera，夜蛾科Noctuidae， 灰翅夜蛾屬Spodoptera[1]，原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種為害玉米的重大遷飛性害蟲[2- 3]。 該蟲具有寄主范圍寬、適生區(qū)域廣、遷飛能力強(qiáng)、擴(kuò)散速度快和突發(fā)為害重等特點(diǎn)[4]，目前，全球已有100多個(gè)國(guó)家報(bào)道了草地貪夜蛾入侵為害[5]。2019年1月，在我國(guó)云南省普洱市江城縣寶藏鎮(zhèn)首次發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾以來，該蟲在我國(guó)迅速擴(kuò)散，并在玉米種植區(qū)大面積發(fā)生，成為我國(guó)玉米生產(chǎn)的重要潛在危害因素[6 -8]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)主要采用化學(xué)藥劑防治

草地貪夜蛾，在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的25種用于草地貪夜蛾應(yīng)急防控的殺蟲藥劑中，有19種為化學(xué)殺蟲劑[9]。但由于該蟲在進(jìn)入我國(guó)之前長(zhǎng)期的化學(xué)防治已導(dǎo)致其對(duì)多種傳統(tǒng)殺蟲藥劑產(chǎn)生了抗性[10 -11]，而且長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥易傷害非靶標(biāo)生物，破壞生態(tài)平衡，因此化學(xué)防治受到了一定的限制。自該蟲入侵我國(guó)以來，在國(guó)內(nèi)已有很多有關(guān)天敵防治草地貪夜蛾的相關(guān)研究[12 -17]，而對(duì)該蟲具有高毒力的病原真菌的相關(guān)報(bào)道較少。

目前，在昆蟲病原真菌防控草地貪夜蛾方面，鄭亞強(qiáng)等[18]在云南省草地貪夜蛾入侵當(dāng)年最先發(fā)現(xiàn)了田間自然罹病的草地貪夜蛾幼蟲，經(jīng)過室內(nèi)分離鑒定菌株，確定了其為萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi，且該菌對(duì)草地貪夜蛾幼蟲具有高致病性;魏雪菲等[19]調(diào)查發(fā)現(xiàn)萊氏綠僵菌在昆明地區(qū)玉米田草地貪夜蛾幼蟲種群中發(fā)生且流行性強(qiáng)。國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者研究表明金龜子綠僵菌M.anisopliae和球孢白僵菌Beauveria bassiana 對(duì)草地貪夜蛾低齡幼蟲、蛹、卵都具有一定的防治效果[20 -21];雷妍圓等[22]發(fā)現(xiàn)玫煙色蟲草Cordyceps fumosorosea對(duì)草地貪夜蛾幼蟲具有較高

的致病性。已報(bào)道的菌株均是對(duì)草地貪夜蛾卵和低齡幼蟲有侵染致病作用，而關(guān)于草地貪夜蛾成蟲的病原真菌還未見相關(guān)報(bào)道。

白僵菌 Beauveria spp. 是最常見的昆蟲病原真菌之一，在我國(guó)現(xiàn)有的白僵菌中，球孢白僵菌因其廣譜性，是目前被用于研制真菌殺蟲劑最多的蟲生真菌[23]，在田間害蟲生物防治中發(fā)揮了極其重要的作用。自從1956年在我國(guó)首次報(bào)道了利用白僵菌防治甘薯象甲Cylas formicarius Fabricias后[24]，我國(guó)在此方面的研究越來越多，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus Walker、稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel、紅火蟻Solenopsis invicta Buren等害蟲的防治中，并取得了較好的防治效果[25 -27]。

本研究從云南省大理彌渡西莊村玉米田采集的罹病草地貪夜蛾雌成蟲上分離純化獲得1株病原真菌，通過形態(tài)學(xué)和ITS序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，并初步測(cè)定了該菌株對(duì)草地貪夜蛾雌、雄成蟲的致病性，以期為開發(fā)真菌殺蟲劑綠色防控草地貪夜蛾成蟲提供備選菌株和利用昆蟲病原真菌進(jìn)行防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株與蟲源

2019年8月4日，于云南省大理彌渡西莊村玉米田發(fā)現(xiàn)罹病草地貪夜蛾成蟲，25°37′23″N，100°41′19″E，海拔1 700 m。

1.2菌株分離與純化

將罹病的草地貪夜蛾成蟲（圖1a～d）置于滅菌培養(yǎng)皿（d=9 cm）中，在（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，待其分生孢子在蟲體表面明顯生長(zhǎng)后，在消毒滅菌的超凈工作臺(tái)中利用接種環(huán)從感病成蟲蟲體表面輕輕挑取少量孢子，采用抖動(dòng)法將其接種于薩氏培養(yǎng)基SDAY（葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏粉10 g，瓊脂20 g，pH自然）[28]上，于（25±1）℃，相對(duì)濕度（70±1）%，L∥D=14 h∥10 h的恒溫恒濕光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[29]。培養(yǎng)5 d后，挑取無污染的菌絲或孢子接種至新的培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至平板上長(zhǎng)出的菌落形態(tài)特征一致，將該菌株編號(hào)為SHL2020。待純化培養(yǎng)的菌株充分產(chǎn)孢后，在4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3菌株培養(yǎng)形態(tài)觀察

將分離純化后的SHL2020菌株分別接種于SDAY和PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L）中間，于（25±1）℃，相對(duì)濕度（70±1）%，L∥D=14 h∥10 h光照培養(yǎng)箱（寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號(hào)ZRY380）中培養(yǎng)。在接菌后第3、7和14天時(shí)，分別測(cè)量不同培養(yǎng)基上菌落的直徑并觀察菌落的形態(tài)特征[18]。采用光學(xué)顯微鏡（Leica， 750）觀察菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)等顯微結(jié)構(gòu)。

1.4菌株分子生物學(xué)鑒定

采用李煥宇等[30]改良的CTAB法，以菌株SHL2020基因組DNA為模板，采用真菌通用引 物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′） 和 ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）進(jìn)行菌株ITS序列PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中上下游引物ITS1和ITS4各1 μL，模板DNA 1～2 μL，PCR MasterMix 12.5 μL，最后ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min;94℃變性1 min， 55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min， 35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5系統(tǒng)發(fā)育分析

將該目的菌株的ITS序列結(jié)果提交至NCBI網(wǎng)站 （https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），通過BLAST比對(duì)后，篩選并下載與目的菌株具有較高同源性的序列， 再使用MEGA 7.0軟件， 通過鄰接法（neighborjoining method， NJ），運(yùn)行1 000次bootstrap驗(yàn)證， 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[31]。

1.6菌株對(duì)草地貪夜蛾成蟲的侵染情況

利用無菌解剖刀刮取SHL2020菌株分生孢子，以滅菌0.05%吐溫 80 （北京索來寶生物有限公司）溶液配制1×108個(gè)/mL 的孢子懸浮液，以滅菌0.05%吐溫 80溶液作為對(duì)照。 挑選羽化2日齡草貪夜蛾雌、雄成蟲，采用噴霧法進(jìn)行接種[18]，接種后將雌、雄成蟲分別放置到自制的保鮮膜養(yǎng)蟲籠中（20 cm× 20 cm×20 cm），于（25±1）℃，相對(duì)濕度（70±1）%，L∥D=16 h∥8 h的光照培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。 雌成蟲和雄成蟲每處理10頭，3次重復(fù)。每天定時(shí)觀察成蟲感染死亡情況及感染蟲體的外部特征，用滅菌鑷子輕輕觸碰接種處理后的成蟲，無振翅與活動(dòng)跡象的則認(rèn)為該蟲已經(jīng)死亡。 發(fā)現(xiàn)有死亡蟲體時(shí)，將其置于底部墊有滅菌濾紙的滅菌培養(yǎng)皿（d=9 cm）中，蓋上皿蓋，置于（25±1）℃，相對(duì)濕度（70±1）%，L∥D=16 h∥8 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察蟲體表面菌絲或分生孢子生長(zhǎng)情況，并鏡檢分生孢子及菌絲形態(tài)。

1.7數(shù)據(jù)分析

利用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理后，再使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理分析，統(tǒng)計(jì)處理雌、雄成蟲的累計(jì)死亡率和累計(jì)校正死亡率[32]，并采用Tukey方法計(jì)算不同時(shí)間雌雄成蟲累計(jì)死亡率的顯著性差異。

累計(jì)死亡率= 死蟲數(shù) 供試蟲數(shù) ×100%;

累計(jì)校正死亡率=（處理組死亡率 對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1菌株形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定

對(duì)已分離純化培養(yǎng)的菌株形態(tài)特征進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后第3天時(shí)菌落平展，白色絨毛狀，菌落邊緣整齊，呈放射狀生長(zhǎng);接種后第6天，菌落開始產(chǎn)孢，略變?yōu)榈S色，菌落中間略凸起，孢子層長(zhǎng)勢(shì)均勻，菌落背面淡黃色;在SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)至7 d時(shí)，菌落直徑22.57 mm（圖1e～h）。在光學(xué)顯微鏡下菌絲無色，分生孢子透明、光滑，球形或近球形，直徑在2.3～2.9 μm，分生孢子梗著生于營(yíng)養(yǎng)菌絲，光滑呈穗狀（圖1i～k）。

PCR擴(kuò)增目的菌株SHL2020的ITS 序列，測(cè)序結(jié)果顯示該菌株擴(kuò)增片段為542 bp，將該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)SHL2020菌株的ITS序列與已報(bào)道的多個(gè)球孢白僵菌菌株對(duì)應(yīng)序列的相似性均達(dá)到97%以上。從中選取相關(guān)序列，使用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。發(fā)現(xiàn)SHL2020菌株與 Beauveria bassiana BbH51（MK952353.1）處于一個(gè)分支，親緣關(guān)系最為接近，同源性最高。結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS序列相似性分析，最終確定該菌株為球孢白僵菌，菌株編號(hào)SHL2020。

2.2室內(nèi)致病性測(cè)定

致病性測(cè)定結(jié)果表明，草地貪夜蛾雌、雄成蟲都可被分離培養(yǎng)的SHL2020菌株感染（圖1a～d）。用1×108個(gè)/mL的孢子懸浮液接種，處理后第3天供試雌、雄成蟲開始出現(xiàn)死亡。接菌后第3天，草地貪夜蛾雌成蟲累計(jì)死亡率為（18.8±2.3）%，顯著高于雄成蟲的（2.6±2.0）%;接菌后第6天，雌成蟲累計(jì)死亡率為（89.6±0.5）%，略高于雄成蟲（85.8±0.9）%（圖3）。通過比較處理后不同時(shí)間雌雄成蟲累計(jì)死亡率，發(fā)現(xiàn)除第3天雌雄成蟲之間累計(jì)死亡率存在極顯著差異（F=9.80，P<0.01）外，其余時(shí)間，雌雄成蟲累計(jì)死亡率都無顯著差異（表1）。

接種后第3天，供試成蟲開始出現(xiàn)死亡。感染后菌絲最先從死亡成蟲的頭部長(zhǎng)出;在（25±1）℃，相對(duì)濕度（70±1）%，L∥D=16 h∥8 h的光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)2 d后，死亡蟲體的胸部和足部開始有菌絲長(zhǎng)出，第5天時(shí)成蟲胸部和腹部整個(gè)長(zhǎng)滿菌絲，而翅部?jī)H在翅脈有少量菌絲長(zhǎng)出。

3討論

蟲生真菌生長(zhǎng)繁殖快、易生產(chǎn)，能侵染多種昆蟲，且害蟲不易產(chǎn)生抗性，在防治農(nóng)林害蟲方面具有明顯優(yōu)勢(shì)[33]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外關(guān)于球孢白僵菌防治草地貪夜蛾已有許多相關(guān)的研究報(bào)道[18，20 21，29， 34 -36]，但目前已有的研究中多為球孢白僵菌感染草地貪夜蛾卵或者幼蟲，有關(guān)該菌侵染成蟲的研究還鮮有報(bào)道。本研究從罹病草地貪夜蛾成蟲中分離獲得1株病原真菌SHL2020，通過形態(tài)學(xué)以及ITS序列比對(duì)分析，將該菌株鑒定為球孢白僵菌。通過初步毒性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該菌株與彭國(guó)雄等[21]所用的JU435菌株相比，對(duì)草地貪夜蛾成蟲具有更強(qiáng)的侵染致病作用。SHL2020的發(fā)現(xiàn)，不僅豐富了云南本地草地貪夜蛾病原真菌資源，也為草地貪夜蛾生物防治提供了生防潛力菌株。

自2019年1月草地貪夜蛾入侵我國(guó)以來，在云南已發(fā)現(xiàn)侵染其幼蟲且流行性較強(qiáng)的昆蟲病原真菌萊氏綠僵菌[18]，但未發(fā)現(xiàn)有自然感染草地貪夜蛾幼蟲的球孢白僵菌。本研究發(fā)現(xiàn)了對(duì)成蟲有較強(qiáng)侵染作用的球孢白僵菌，其是否對(duì)草地貪夜蛾幼蟲有侵染致病作用尚需進(jìn)一步研究。此外，蟲生真菌的發(fā)生和對(duì)害蟲的侵染受濕度和溫度等環(huán)境條件的影響[18]，本研究發(fā)現(xiàn)的球孢白僵菌SHL2020在室內(nèi)條件下對(duì)草地貪夜蛾雌、雄成蟲均具有較強(qiáng)致病力，但其在田間自然條件下對(duì)草地貪夜蛾成蟲的侵染致病作用，還有待研究。

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收稿日期：2020 -11- 04修訂日期：2021- 01 -07

基金項(xiàng)目：

云南省重點(diǎn)領(lǐng)域科技計(jì)劃（202001BB050002）; 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFD0300105）

* 通信作者

Email：李正躍：kmlizhengyue@163.com;陳斌：chbins@163. com