CEP55和PLK1在卵巢漿液性癌中的表達(dá)及其臨床意義

劉 艷 梁 鋼 李曉蓉 閆文佳 肖 虹

卵巢漿液性癌(ovarian serous carcinoma, OSC)是卵巢癌最常見的組織病理學(xué)類型，75%以上的卵巢漿液性癌患者就診時(shí)已是晚期，5年生存率僅為29%[1, 2]。在WHO女性生殖器腫瘤分類中指出，卵巢漿液性癌的發(fā)生、發(fā)展按照卵巢癌二元論的發(fā)病模型，分為低級(jí)別漿液性癌和高級(jí)別漿液性癌，并認(rèn)為其絕大多數(shù)直接或間接起源于輸卵管傘端上皮[3]。中心體相關(guān)蛋白55(centrosomal protein 55kDa, CEP55)是一種調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂的蛋白，在多種腫瘤中表達(dá)增高，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。PLK1(polo-like kinase 1, PLK1)是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，主要參與中心體復(fù)制、紡錘體組裝和胞質(zhì)分裂等過程。在有絲分裂過程中，PLK1介導(dǎo)CEP55進(jìn)行磷酸化，維持CEP55有序地募集至中間體，確保順利完成胞質(zhì)分裂。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于CEP55和PLK1在卵巢漿液性癌中的研究較少。因此，本研究應(yīng)用免疫組化聯(lián)合Western blot法探討CEP55和PLK1在卵巢漿液性癌組織中的表達(dá)，分析兩者的表達(dá)與患者臨床病理因素的關(guān)系，旨在為卵巢漿液性癌的臨床靶向治療和預(yù)后評(píng)估提供一定的依據(jù)。

資料與方法

1.病例資料：收集山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院2020年1月～2021年8月因盆腔腫物行手術(shù)切除的卵巢漿液性癌組織50例，其中，包括高級(jí)別漿液性癌組織30例和低級(jí)別漿液性癌組織20例，正常對(duì)照組為同一患者的正常輸卵管傘端上皮組織50例，術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)無腫瘤性病變。所有收集的新鮮組織均分為兩部分，一部分制成石蠟組織標(biāo)本，另一部分置于液氮中速凍，置于-80℃冰箱保存。所有組織切片均由2名婦科病理專家診斷完成。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料記錄完整；②術(shù)前均未行放療和化療等抗腫瘤治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他惡性腫瘤的病史；②臨床資料不完整。患者年齡38～70歲，平均年齡為55歲，<55歲者20例，≥55歲者30例，采用國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)的分期系統(tǒng)對(duì)腫瘤進(jìn)行分期，Ⅰ+Ⅱ期16例，Ⅲ+Ⅳ期 34例，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例[4]。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：2022-K024),所有患者知情同意。

2.免疫組織化學(xué)染色：兔抗人CEP55單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，小鼠抗人PLK1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。所選組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛溶液常規(guī)固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。免疫組化染色采用EnVision法，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后，分別置于pH值為9.0的EDTA緩沖液和pH值為6.0檸檬酸鹽緩沖液中120℃ 3min，放入3%過氧化氫溶液中進(jìn)行封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，15min；加入一抗CEP55(1∶300)和PLK1(1∶50)，再置于37℃恒溫箱孵育1h；PBS沖洗3次，每次2min，再加入二抗，37℃恒溫箱孵育20min，PBS沖洗3次，每次2min；滴加DAB顯色劑，鏡檢后自來水沖洗阻斷顯色；最后蘇木精復(fù)染、分化、反藍(lán)、脫水和封片。

3.免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：染色判讀方法是根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的染色百分率兩個(gè)方面進(jìn)行綜合性判斷。CEP55蛋白表達(dá)主要定位在細(xì)胞質(zhì)[5]。按陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的染色百分比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分比0為0分，1%～10% 為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。陽(yáng)性細(xì)胞百分率與染色強(qiáng)度的乘積為最終結(jié)果，≥6分為高表達(dá)，<6分為低表達(dá)。PLK1表達(dá)定位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核[6]。按陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的染色百分比例評(píng)分：0%～10%為0分，11%～25% 為1分，26%～50%為2分， 51%～75%為3分，76%～100%為4分。兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相加為最終結(jié)果，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～6分為陽(yáng)性(++)，>6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)；本研究中，<2分為陰性，≥2分為陽(yáng)性。

4.Western blot法：使用細(xì)胞裂解液提取30例高級(jí)別漿液性癌、20例低級(jí)別漿液性癌和50例正常輸卵管傘端上皮的新鮮組織中的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；將每對(duì)蛋白樣本進(jìn)行等量上樣，在SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳和轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再經(jīng)5%脫脂奶室溫封閉1h，并加入一抗CEP55(1∶5000)和PLK1(1∶500)進(jìn)行4℃搖床過夜孵育，次日回收一抗，洗滌后加入二抗在室溫孵育1h，顯影后用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行觀察。最后，通過計(jì)算CEP55和PLK1蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值及灰度值比值來分析CEP55和PLK1蛋白的表達(dá)水平。CEP55的相對(duì)分子質(zhì)量為55kDa，PLK1的相對(duì)分子質(zhì)量為68kDa，內(nèi)參GAPDH的相對(duì)分子質(zhì)量為36kDa。

結(jié) 果

1.免疫組化法檢測(cè)CEP55和PLK1蛋白的表達(dá)： CEP55蛋白在卵巢漿液性癌組織中高表達(dá)率為60%(30/50)，其中，高級(jí)別漿液性癌中高表達(dá)率為80%(24/30)，低級(jí)別漿液性癌中高表達(dá)率為30%(6/20)；在正常輸卵管傘端上皮組織中高表達(dá)率為14%(7/50)。CEP55在卵巢漿液性癌組織中的蛋白表達(dá)高于正常輸卵管傘端上皮組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.694，P<0.001，圖1)。PLK1蛋白在卵巢漿液性癌組織中陽(yáng)性率為64%(32/50)，其中，高級(jí)別漿液性癌中陽(yáng)性率為90%(27/30)，低級(jí)別漿液性癌中陽(yáng)性率為25%(5/20)；在正常輸卵管傘端上皮組織中陽(yáng)性率為10%(5/50)。PLK1在卵巢漿液性癌組織中的蛋白表達(dá)高于正常輸卵管傘端上皮組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.274，P<0.001，圖2)。

圖1 免疫組化檢測(cè)CEP55在3種組織中的表達(dá)(EnVision，×200)A.正常輸卵管傘端上皮；B.低級(jí)別漿液性癌；C.高級(jí)別漿液性癌

圖2 免疫組化檢測(cè)PLK1在3種組織中的表達(dá)(EnVision，×200)A.正常輸卵管傘端上皮；B.低級(jí)別漿液性癌；C.高級(jí)別漿液性癌

2.Western blot法檢測(cè)CEP55和PLK1的蛋白表達(dá)： CEP55蛋白在卵巢漿液性癌組織中的相對(duì)表達(dá)量(1.043±0.162)高于正常輸卵管傘端上皮組織(0.457±0.061)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.803，P<0.05)。其中，CEP55蛋白在高級(jí)別漿液性癌組織中的相對(duì)表達(dá)量(1.500±0.150)高于低級(jí)別漿液性癌組織(0.587±0.087)和正常輸卵管傘端上皮組織(0.457±0.061)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.662，P<0.001)。CEP55蛋白在低級(jí)別漿液性癌和正常輸卵管傘端上皮組織中的相對(duì)表達(dá)量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3中A、B)。PLK1蛋白在卵巢漿液性癌組織中的相對(duì)表達(dá)量(0.648±0.073)高于正常輸卵管傘端上皮組織(0.177±0.022)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.869，P<0.05)。其中，PLK1蛋白在高級(jí)別漿液性癌組織中的相對(duì)表達(dá)量(1.046±0.166)高于低級(jí)別漿液性癌組織(0.251±0.080)和正常輸卵管傘端上皮組織(0.177±0.022)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.601，P<0.001)。低級(jí)別漿液性癌和正常輸卵管傘端上皮組織的PLK1蛋白的相對(duì)表達(dá)量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3中A、C)。

圖3 Western blot法檢測(cè)CEP55和PLK1在3種組織中的蛋白表達(dá)量A.Western blot 法結(jié)果圖(1.正常輸卵管傘端上皮；2.低級(jí)別漿液性癌；3.高級(jí)別漿液性癌)；B.CEP55相對(duì)表達(dá)量；C.PLK1相對(duì)表達(dá)量。*P<0.001

3.CEP55和PLK1表達(dá)與卵巢漿液性癌患者的臨床病理特征的關(guān)系：CEP55的表達(dá)與患者的臨床病理資料的分析結(jié)果顯示，CEP55蛋白表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)(χ2=12.500，P<0.001)、FIGO分期(χ2=7.414，P=0.006)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.975，P=0.026)有關(guān)，與患者的年齡(χ2=0.347，P=0.556)無關(guān)。PLK1的表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PLK1蛋白表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)(χ2=22.005，P<0.001)相關(guān)，但與患者的年齡(χ2=0.521，P=0.470)、FIGO分期(χ2=0.230，P=0.631)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=1.576，P=0.209)無關(guān)(表1)。應(yīng)用Spearman分析CEP55和PLK1蛋白在卵巢漿液性癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，在卵巢漿液性癌組織中CEP55和PLK1的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.408，P<0.05)。

表1 CEP55和PLK1在卵巢漿液性癌中表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

討 論

CEP55是由Fabbro等[7]在2005年發(fā)現(xiàn)的一種EST FLJ10540編碼的中心體相關(guān)蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為55kDa，主要定位于人類染色體10q23.33。CEP55長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是胞質(zhì)分裂進(jìn)行脫落的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)兩個(gè)子細(xì)胞的分離[8]。研究發(fā)現(xiàn)，CEP55過表達(dá)會(huì)引起胞質(zhì)分裂紊亂，導(dǎo)致染色體錯(cuò)誤分離和基因組不穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行腫瘤性增殖，提示CEP55過表達(dá)可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的早期事件[9]。有研究表明，CEP55通過參與PI3K/Akt通路、JAK2/STAT3 通路和Akt/FoxM1通路等多種信號(hào)通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[10～14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CEP55在結(jié)直腸癌、食管、腎和卵巢癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，高表達(dá)率的波動(dòng)范圍為40%～65%[5, 12, 15, 16]。本研究結(jié)果顯示，CEP55在卵巢漿液性癌中的蛋白表達(dá)與正常輸卵管傘端上皮組織比較顯著增高，CEP55高表達(dá)率為60%，提示CEP55蛋白表達(dá)與卵巢漿液性癌的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CEP55的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，即CEP55在高級(jí)別漿液性癌中的高表達(dá)率顯著高于低級(jí)別漿液性癌，CEP55表達(dá)率越高，患者的FIGO分期越晚且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這一結(jié)果與既往研究報(bào)道相一致，意味著CEP55高表達(dá)的卵巢漿液性癌患者的預(yù)后較差。

PLK1是一種保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，由一個(gè)N端的激酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端的Polo-box結(jié)構(gòu)域組成[17]。PLK1作為有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)CDK1/Cyclin B復(fù)合物的活性來驅(qū)動(dòng)細(xì)胞從G2期過渡到M期，參與調(diào)控細(xì)胞周期。PLK1表達(dá)上調(diào)會(huì)破壞G2/M檢查點(diǎn)，引起細(xì)胞進(jìn)行異常分裂和增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[17]。近期研究表明，PLK1在卵巢癌和淋巴瘤等惡性腫瘤中表達(dá)增高[18, 19]。在卵巢癌研究中，PLK1的陽(yáng)性率波動(dòng)范圍較大，為38.0%～80.8%，且PLK1過表達(dá)是卵巢癌預(yù)后不良的影響因素[6, 18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢漿液性癌中，PLK1的陽(yáng)性率為64%，相對(duì)于正常輸卵管傘端上皮組織顯著增高，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相一致。PLK1的表達(dá)在低級(jí)別漿液性癌中的陽(yáng)性率要低于高級(jí)別漿液性癌，這可能預(yù)示著PLK1陽(yáng)性率越高的卵巢漿液性癌患者的惡性程度越高；但與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，這可能與樣本量較小有關(guān)，今后還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

在有絲分裂期間，PLK1是CEP55的正向調(diào)節(jié)因子，通過介導(dǎo)CEP55在殘基S436上進(jìn)行磷酸化，促進(jìn)CEP55按照一定的時(shí)空順序募集至中間體，維持細(xì)胞正常進(jìn)行胞質(zhì)分裂和脫落過程[10]。Bastos等[20]研究報(bào)道，PLK1 降解過快會(huì)使CEP55 過早募集至中間體，引起胞質(zhì)分裂失敗，導(dǎo)致非整倍體細(xì)胞形成和染色體不穩(wěn)定，最終抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。另外有研究發(fā)現(xiàn)PLK1、p53和CEP55存在著p53-PLK1-CEP55的反饋調(diào)節(jié)軸，PLK1作為p53的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，p53能結(jié)合PLK1啟動(dòng)子來抑制PLK1的轉(zhuǎn)錄活性，從而進(jìn)一步抑制CEP55的蛋白表達(dá)，當(dāng)TP53基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)使p53轉(zhuǎn)錄的抑制功能喪失，引起PLK1和CEP55蛋白表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期異常進(jìn)行，促使腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)[21]。本研究證實(shí)了CEP55和PLK1在卵巢漿液性癌中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.408，P<0.05)，筆者推測(cè)CEP55和PLK1在卵巢漿液性癌的進(jìn)展中發(fā)揮協(xié)同作用。此外，免疫組化聯(lián)合Western blot法共同檢測(cè)出PLK1和CEP55在高級(jí)別漿液性癌中的蛋白表達(dá)水平高于低級(jí)別漿液性癌，這可能與高級(jí)別漿液性癌常發(fā)生TP53突變有關(guān)，具體分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

近年來，PLK1抑制劑在許多腫瘤模型中取得了顯著的抗腫瘤活性，主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在G2/M期發(fā)生有絲分裂停滯，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而改善患者的預(yù)后[22]。Raab等[23]研究表明，PLK1抑制劑Volasertib聯(lián)合紫杉醇會(huì)導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞的有絲分裂停滯，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和核內(nèi)復(fù)制，誘導(dǎo)其發(fā)生死亡。目前，Volasertib已被用于急性髓性白血病患者的臨床研究階段，Zeidan等[24]將Volasertib聯(lián)合地西他濱藥物用于治療23例復(fù)發(fā)性或難治性的急性髓性白血病患者的臨床一期研究中，結(jié)果顯示患者未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。因此Volasertib有可能成為卵巢漿液性癌患者的靶向治療藥物。除此之外，有研究報(bào)道，CEP55過表達(dá)可以保護(hù)退出有絲分裂停滯的非整倍體細(xì)胞，避免腫瘤細(xì)胞死亡，導(dǎo)致抗有絲分裂藥物產(chǎn)生耐藥性[25]。然而，使用MEK1/2抑制劑來降低CEP55過表達(dá)對(duì)非整倍體細(xì)胞的保護(hù)作用后，可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗有絲分裂PLK1抑制劑的敏感度，進(jìn)而有效地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡[26]。在本研究中，CEP55在卵巢漿液性癌組織中過表達(dá)，與影響預(yù)后的臨床病理因素有關(guān)，因此，CEP55有望成為卵巢漿液性癌患者治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。

綜上所述，PLK1和CEP55在低級(jí)別漿液性癌與正常輸卵管傘端上皮組織中的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩者均有略增高的趨勢(shì)，這可能與樣本量較小有關(guān)，日后還會(huì)收集更多的臨床數(shù)據(jù)來進(jìn)一步分析。此外，從CEP55和PLK1的蛋白表達(dá)及兩者的表達(dá)與卵巢漿液性癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性上來說，兩者在卵巢漿液性癌的表達(dá)顯著高于正常輸卵管傘端上皮組織，并且兩者的過表達(dá)與較差的生物學(xué)行為相關(guān)，這預(yù)示著卵巢漿液性癌患者的預(yù)后較差。因此，CEP55和PLK1可能協(xié)同參與卵巢漿液性癌的發(fā)生、發(fā)展，未來有望成為卵巢漿液性癌潛在的治療靶點(diǎn)，但還需開展更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究予以證實(shí)。