間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡在腎臟纖維化治療中的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展

楊清梅，潘博，劉鳳，劉曉惠

1 川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，四川南充 637000；2 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，四川南充 637000

腎臟纖維化（RF）是各種腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎?。‥SRD）最后共同的病理表現(xiàn)，其典型標(biāo)志為腎小球與間質(zhì)區(qū)域中過(guò)多細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積聚［1］。根據(jù)組織學(xué)結(jié)構(gòu)，RF可分為腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化（RIF）、動(dòng)脈硬化和血管周圍纖維化［2］。RF的主要病理特征包括炎細(xì)胞的浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞的活化和擴(kuò)張、ECM的沉積、腎小管損傷以及微血管稀疏［3］。目前ESRD的治療方式主要為腎臟替代治療（血液透析、腹膜透析、腎移植），但各腎臟替代治療方式均存在一定的不足。例如：血液透析及腹膜透析并不能完全替代腎臟功能，且并發(fā)癥多，患者整體生活質(zhì)量較差；腎移植因供體稀缺、費(fèi)用昂貴、免疫排斥等問(wèn)題致其應(yīng)用也受到一定限制。所以，在早期積極尋找抗RF的措施顯得尤為重要，但目前全世界針對(duì)RF缺乏有效、可靠的治療方式。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一類存在于骨髓、脂肪、胎盤(pán)、牙髓、臍帶等多種組織，且具有自我更新、多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在促進(jìn)血管生成、抗炎、抗凋亡、抗纖維化以及免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用［4］。目前大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，MSCs治療可減輕RF［5-7］。但基于MSCs的療法有一定的風(fēng)險(xiǎn)，比如致癌性、細(xì)胞排斥以及病毒污染等，這些細(xì)胞移植的安全性問(wèn)題尚未解決，限制了其在臨床上的應(yīng)用［8］。近年，BORGER等［9］研究發(fā)現(xiàn)MSCs可通過(guò)以細(xì)胞外囊泡（EVs）介導(dǎo)的旁分泌作用發(fā)揮其治療作用。與MSCs相比，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的EVs（MSC-EVs）具有低免疫原性、易保存、可人工修飾、無(wú)致癌性等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)［10］。故MSC-EVs治療有望替代MSCs成為新的抗RF措施?，F(xiàn)對(duì)MSC-EVs在RF中的治療作用及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 EVs與MSC-EVs概述

EVs是一種可由各種細(xì)胞釋放的脂質(zhì)膜囊泡，可通過(guò)含有的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、microRNA等成分進(jìn)行細(xì)胞間信號(hào)傳遞，進(jìn)而調(diào)控受體細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等［11］。由于產(chǎn)生機(jī)制、直徑大小等不同，EVs可分為外泌體、微囊泡（MVs）和凋亡小體［12］。外泌體的直徑為30～150 nm，由多泡體與質(zhì)膜融合后分泌到細(xì)胞外形成［13］。MVs則通過(guò)細(xì)胞膜以出芽的方式釋放到細(xì)胞外，直徑為100～1 000 nm［14］。MSC-EVs表達(dá)其親本MSCs的特征，包括表面標(biāo)志物CD44、CD73、CD90和CD105，以及特定的EVs表面標(biāo)志物，如CD9、CD63和CD81；重要的是，MSC-EVs包含大量mRNA、microRNA和蛋白質(zhì)，它們通過(guò)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞中的幾種細(xì)胞途徑來(lái)介導(dǎo)MSCs的旁分泌作用［15］。已有研究證實(shí)MSC-EVs具有獨(dú)特的生物學(xué)修復(fù)作用［16］。

2 MSC-EVs對(duì)RF的治療作用

目前，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSC-EVs對(duì)RF具有明顯的治療效果，這些研究使用了不同腎臟損傷模型以及不同組織來(lái)源的MSC-EVs，表明MSC-EVs不僅可預(yù)防急性腎損傷（AKI）后纖維化病變的形成，還可延緩慢性腎臟?。–KD）中RF的進(jìn)展。

2.1 MSC-EVs在AKI模型中對(duì)RF的治療作用 AKI是一種常見(jiàn)的臨床綜合征，其病因分為腎前性、腎性和腎后性三大類，眾所周知，AKI期間的不充分或異常修復(fù)會(huì)導(dǎo)致纖維化病變形成，最終進(jìn)入ESRD。BRUNO等［17］發(fā)現(xiàn)，靜脈注射人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的MVs（BMSC-MVs）可恢復(fù)甘油誘導(dǎo)的AKI小鼠的腎臟功能與形態(tài)，并且其效果與BMSCs相似。這是MSC-EVs保護(hù)腎臟的第一個(gè)研究證據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，在單側(cè)急性缺血再灌注（IR）腎損傷大鼠模型中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的MVs（HucMSC-MVs）具有抗腎小管上皮細(xì)胞損傷并促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，可以明顯改善受損腎臟后期的纖維化程度，并保護(hù)腎臟功能［18-19］。LIN等［20］向IR腎損傷大鼠單次靜脈注射同種異體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體（ADMSC-exo），發(fā)現(xiàn)其可改善RF，與ADMSCs和ADMSC-exo聯(lián)合治療相比，其在抗纖維化上呈現(xiàn)出相同的作用。在另一項(xiàng)研究中，CHEN等［21］向IR所致AKI的大鼠靜脈注射人類沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞（hWJMSCs）來(lái)源的MVs（hWJMSC-MVs），同樣發(fā)現(xiàn)hWJMSC-MVs可改善大鼠RF。HE等［22］建立了單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)靜脈注射同種異體BMSC-MVs對(duì)UUO所致RF有一定修復(fù)作用，并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MVs發(fā)揮修復(fù)作用的關(guān)鍵可能歸結(jié)于其中包括的某類特定microRNA。胡玉燕等［23］研究表明，在UUO大鼠模型中，單次靜脈注射人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體（HucMSC-exo）可減少膠原沉積，改善腎臟結(jié)構(gòu)，延緩RF進(jìn)展。LIU等［24］也以UUO小鼠為研究模型，發(fā)現(xiàn)多能干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌的外泌體（PSC-MSC-exo）能夠有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)腎功能，減緩腎纖維化，并且外泌體水平越高，對(duì)腎臟保護(hù)作用越好。

2.2 MSC-EVs在CKD模型中對(duì)RF的治療作用 CKD是指由各種原因引起的腎臟結(jié)構(gòu)、功能障礙且病史大于3個(gè)月的臨床綜合征。RF是CKD的重要病理改變，控制RF進(jìn)程對(duì)提高CKD患者生活質(zhì)量非常重要。GATTI等［25］證明，人BMSC-MVs可改善甘油誘導(dǎo)AKI小鼠模型的腎臟功能及形態(tài)，隨后，他們將人BMSC-MVs的作用擴(kuò)展到IR損傷后的CKD模型，發(fā)現(xiàn)與未處理的大鼠相比，接受MVs處理的大鼠腎臟顯示出較少的纖維化，進(jìn)而表明MVs治療還可保護(hù)腎臟免受慢性損傷。LIU等［26］將HucMSC-exo通過(guò)左腎動(dòng)脈注射到UUO大鼠中，組織學(xué)形態(tài)顯示該組大鼠RIF面積明顯低于UUO組，表明HucMSC-exo可改善CKD中UUO引起的RIF進(jìn)展。EIRIN等［27］建立了一種新的代謝綜合征和腎動(dòng)脈狹窄豬模型，發(fā)現(xiàn)單次腎內(nèi)遞送自體ADMSC-exo可減輕腎髓質(zhì)氧化、腎臟炎癥，從而緩解RF，最終改善腎功能。EBRAHIM等［28］在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病（DN）大鼠中每天靜脈注射2次同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體（BMSC-exo），持續(xù)4周后進(jìn)行組織學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)腎小球毛細(xì)血管、腎小體和腎小管周圍的膠原纖維數(shù)量減少，表明多次注射外泌體表現(xiàn)出有效的抗纖維化作用。同樣，在DN小鼠模型中，GRANGE等［16］研究發(fā)現(xiàn)人骨髓MSCs和人肝干細(xì)胞樣細(xì)胞脫落的EVs的多次靜脈施用均可預(yù)防和逆轉(zhuǎn)腎小球與間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。有趣的是，在注射成纖維細(xì)胞來(lái)源的EVs后他們沒(méi)有觀察到RF的改變，這體現(xiàn)了MSC-EVs抗纖維化的特異性。KHOLIA等［29］多次靜脈注射人BMSC-EVs對(duì)馬兜鈴酸腎病模型小鼠進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠體質(zhì)量減輕未見(jiàn)明顯恢復(fù)，但小鼠血肌酐及血尿素氮降低，腎小管壞死和RIF明顯減少。FERGUSON等［30］以誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化性腎血管疾病豬為研究模型，發(fā)現(xiàn)與腎臟血運(yùn)重建相比，單次腎內(nèi)遞送自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的EVs（ADMSC-EVs）可以更好地保護(hù)狹窄的腎臟微血管系統(tǒng)并減輕腎損傷和纖維化。

3 MSC-EVs治療RF的相關(guān)機(jī)制

3.1 下調(diào)促纖維化因子 RF的特點(diǎn)是ECM的不平衡沉積和降解，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）作為促纖維化因子通過(guò)經(jīng)典（基于Smad）和非經(jīng)典信號(hào)通路在其起關(guān)鍵作用。LI等［31］第一個(gè)提供了臍帶MSCs旁分泌的抗纖維化作用可能主要?dú)w因于外泌體的證據(jù)，并進(jìn)一步證實(shí)，外泌體通過(guò)下調(diào)TGF-β1，抑制由TGF-β1/Smad2/3信號(hào)通路觸發(fā)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和由PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)MMPs的表達(dá)來(lái)抑制ECM蛋白的過(guò)度沉積，從而改善DN中的RF。CHEN等［21］研究表明，hWJMSC-MVs可改善大鼠RF，這主要是通過(guò)下調(diào)促纖維化因子TGF-β1水平，上調(diào)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白依賴性蛋白激酶（CDK1）、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（CyclinB1），進(jìn)而降低腎小管上皮細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），減少G2/M期的細(xì)胞阻滯來(lái)實(shí)現(xiàn)的，并且體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些作用通過(guò)Erk1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。LIU等［32］建立了5/6次全腎切開(kāi)術(shù)大鼠模型和TGF-β1誘導(dǎo)的人腎近端腎小管上皮細(xì)胞（HRPTEpiCs）模擬RF以研究人BMSC-exo治療RF的作用與機(jī)制，其結(jié)果證實(shí)BMSCexo可能通過(guò)調(diào)節(jié)Smurf/Smad7軸在一定程度上對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的RF具有抑制作用。Sirtuin 6（SIRT6）是一種保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白脫乙酰酶，被認(rèn)為可有效逆轉(zhuǎn)許多器官中的纖維化過(guò)程。β-catenin被認(rèn)為是RF過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。LIU等［24］研究證明PSC-MSC-exo對(duì)RF的保護(hù)作用是通過(guò)上調(diào)SIRT6，從而下調(diào)β-catenin的表達(dá)，進(jìn)一步降低β-catenin下游產(chǎn)物如Col1-A1、α-SMA等促纖維化因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Sox9是一種轉(zhuǎn)錄因子，在包括腎臟在內(nèi)的多種組織和器官的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。ZHU等［33］研究表明人脂肪MSCs通過(guò)外泌體激活Sox9，進(jìn)而阻止TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為促纖維化表型，最終延緩單側(cè)IR小鼠的RF。EBRAHIM等［28］研究證實(shí)，BMSC-exo可通過(guò)阻斷雷帕霉素的機(jī)制靶點(diǎn)（mTOR）途徑來(lái)降低腎臟中 的TGF-β1，進(jìn)而 阻 止DN大鼠的RF進(jìn) 展。ZHANG等［34］專注于研究Oct-4對(duì)腎損傷的影響，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Oct-4的ADMSC-EVs顯著抑制了IR小鼠腎損傷引起的纖維化，而低表達(dá)Oct-4的ADMSCEVs僅輕微抑制了腎纖維化，表明EVs中Oct-4的表達(dá)在抑制腎損傷中起重要作用，證實(shí)Oct-4可能通過(guò)抑制腎損傷后Snail基因（驅(qū)動(dòng)EMT的主要轉(zhuǎn)錄因子）的表達(dá)來(lái)抑制纖維化進(jìn)展?？傊?，上述研究證實(shí)MSC-EVs可通過(guò)下調(diào)TGF-β1、Snail等促纖維化因子，降低腎小管上皮細(xì)胞的EMT，抑制纖維化形成的多種信號(hào)通路，進(jìn)而緩解RF。

3.2 減輕炎癥反應(yīng) CX3C趨化因子配體1（CX3CL1）是一類對(duì)巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)吸引力的趨化因子，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生［35］，其在IR腎臟中呈高表達(dá)狀態(tài)，CX3CL1及其受體CX3CR1具有增加腎臟損傷，促進(jìn)RF的作用［36］。鄒翔宇［18］研究證實(shí)，HucMSC-MVs可減少IR腎臟巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，同時(shí)降低CX3CL1的表達(dá)，表明HucMSC-MVs可通過(guò)抑制CX3CL1的表達(dá)來(lái)減少巨噬細(xì)胞的腎臟浸潤(rùn)及炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而改善IR腎臟后期的纖維化。為了進(jìn)一步研究CX3CL1與microRNA的聯(lián)系，他們篩選出具有和CX3CL1 mRNA分子相同的基因保守配對(duì)序列的microRNA，包括miR-15a、miR-15b、miR-195、miR-16、miR-497和miR-424，這 些 可 能 對(duì)CX3CL1起調(diào)控作用。促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生可引起腎缺氧和纖維化，IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子。EIRIN等［27］證實(shí)，自體ADMSC-EVs的腎內(nèi)給藥通過(guò)減少腎臟炎癥，增加修復(fù)性巨噬細(xì)胞的數(shù)量，并上調(diào)IL-10的表達(dá)來(lái)減輕代謝綜合征和腎動(dòng)脈狹窄豬模型的RF。他們的另一項(xiàng)研究還證實(shí)，來(lái)自瘦豬的ADMSC-EVs顯著增加了代謝綜合征及腎動(dòng)脈狹窄豬的腎血流量和腎小球?yàn)V過(guò)率，并減少了腎小管損傷和纖維化，這可能是通過(guò)上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量，將促炎巨噬細(xì)胞極化為抗炎表型，并減少浸潤(rùn)性炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子，繼而改善腎臟炎癥實(shí)現(xiàn)的，研究還表明來(lái)自代謝綜合征豬的MSC-EVs的這種能力有所減弱［37］。LU等［38］以UUO小鼠為研究模型，發(fā)現(xiàn)人BMSC-exo可通過(guò)激活EP2受體、抑制促炎因子分泌、減少肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化來(lái)調(diào)節(jié)M1和M2巨噬細(xì)胞的極化，從而減少ECM沉積和RF的形成。綜上可見(jiàn)，MSC-EVs可通過(guò)抑制CX3CL1表達(dá)、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化、上調(diào)IL-10表達(dá)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量等途徑來(lái)減輕腎臟炎癥反應(yīng)，從而抑制RF。

3.3 促進(jìn)血管生成 ZOU等［39］研究表明，HucMSCMVs可通過(guò)HIF-1a獨(dú)立方式誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）升高來(lái)促進(jìn)血管生成，維持毛細(xì)血管密度，防止微血管稀疏，進(jìn)而減輕IR誘導(dǎo)的腎損傷，并減輕晚期的RF。同時(shí)也證明，RNA遞送與蛋白質(zhì)貨物都參與了VEGF的調(diào)節(jié)。CHEN等［40］通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，來(lái)自膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）修飾的人ADMSCs來(lái)源外泌體的抗RF作用是通過(guò)調(diào)節(jié)腎小管周圍毛細(xì)血管生成來(lái)介導(dǎo)的，其具體的機(jī)制之一是外泌體上調(diào)SIRT1，SIRT1進(jìn)一步通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮一氧化氮合酶的磷酸化水平來(lái)抑制細(xì)胞凋亡并刺激血管生成。

3.4 抗氧化應(yīng)激 眾所周知，腎小管易受氧化應(yīng)激損傷。一項(xiàng)研究證實(shí)，單次靜脈注射hWJMSC-MVs可通過(guò)抑制NADPH氧化酶（NOX）的表達(dá)來(lái)減輕IR腎臟早期的氧化應(yīng)激，并且RF在2周時(shí)被MVs消除，說(shuō)明減輕腎臟早期的氧化應(yīng)激對(duì)延緩后期RF形成有一定的作用，表明MSC-EVs可通過(guò)抗氧化應(yīng)激來(lái)減輕RF［41］。近年，LIU等［26］研究證明HucMSC-exo可通過(guò)抑制活性氧激活的P38MAPK/ERK通路保護(hù)UUO腎免受氧化應(yīng)激損傷，從而緩解RF。

3.5 抗細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡在RF中起重要作用。LIANG等［42］建立了UUO大鼠模擬的RF體內(nèi)模型和TGF-β1處理人HK-2細(xì)胞的體外模型，首次發(fā)現(xiàn)人BMSC-exo可將miR-374a-5p從MSCs轉(zhuǎn)移到HK-2細(xì)胞并發(fā)揮抗纖維化作用，表明外泌體miR-374a-5p有希望用于腎病治療。該研究進(jìn)一步證實(shí)，外泌體miR-374a-5p通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK6/MK5/YAP軸顯著抑制HK-2細(xì)胞凋亡并阻止體內(nèi)RF的進(jìn)展，提示MAPK6/MK5/YAP在RF的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要?？傊隧?xiàng)研究表明MSC-EVs中的microRNA可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)延緩RF進(jìn)展。

3.6 其他 HU等［43］發(fā)現(xiàn)，由α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶特異性催化的核心巖藻糖基化（CF）是多種促纖維化蛋白的關(guān)鍵翻譯后修飾，以UUO小鼠及IR小鼠為研究模型，首次發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠BMSC-exo通過(guò)CD81-EGFR復(fù)合物將miR-34c-5p遞送到周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，miR-34c-5p進(jìn)一步下調(diào)CF以抑制多種信號(hào)通路，從而改善多種細(xì)胞激活和RF。這是第一份關(guān)于MSCs通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾來(lái)拮抗周細(xì)胞活化能力的報(bào)道，并且證明外泌體在其中起主要作用。這也是外泌體miR-34c-5p可以抑制成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化的第一份報(bào)道?？傊訡F為靶點(diǎn)，MSCs衍生的外泌體對(duì)多種細(xì)胞和信號(hào)通路產(chǎn)生廣泛影響。JIN等［44］發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1刺激的NRK52E細(xì)胞和UUO后腎臟中l(wèi)et-7i-5p的水平顯著上調(diào)，而人BMSCs-exo介導(dǎo)的抗-let-7i-5p遞送在體外NRK52E細(xì)胞中以及體內(nèi)UUO模型中發(fā)揮抗纖維化作用，其結(jié)果表明，外泌體抗miR-let-7增加受損腎臟中TSC1的表達(dá)，隨后降低其下游靶標(biāo)mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化，通過(guò)啟動(dòng)TSC1/mTOR通路減弱了RF。

4 結(jié)語(yǔ)

在MSC-EVs與RF的研究中，已有大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSC-EVs在AKI和CKD模型中均有治療RF的作用，但未來(lái)仍需要更多的臨床研究證實(shí)其抗RF效果及安全性。目前研究顯示，MSC-EVs治療RF的機(jī)制與下調(diào)纖維化因子、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激等有關(guān)。此外，據(jù)相關(guān)研究證實(shí)，經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的MSCs分泌的EVs具有更好的抗RF作用，預(yù)示在今后研究中需要進(jìn)一步明確提高M(jìn)SC-EVs療效的方法，使其能夠發(fā)揮最大治療作用。MSC-EVs作為一種新興的無(wú)細(xì)胞再生療法，若能得到有效的研究和利用，將來(lái)有望成為有效、可靠的抗RF措施。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明楊清梅：論文選題、論文撰寫(xiě)及文獻(xiàn)資料的收集分析；潘博：論文審核及修正；劉鳳：文獻(xiàn)資料收集；劉曉惠：論文審核及修正，指導(dǎo)寫(xiě)作