高壓氧調(diào)控TLR4/NF-κB通路對(duì)膿毒癥大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

郭 慧， 李旭蕊， 曲珍珍， 李建國(guó)

(河北省人民醫(yī)院， 河北 石家莊 050051)

膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的最常見(jiàn)原因之一，盡管最近的醫(yī)學(xué)進(jìn)展大大提高了存活率，但膿毒癥相關(guān)性腦病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)仍是一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)病率高達(dá)70%[1]。SAE通常表現(xiàn)出嚴(yán)重的、長(zhǎng)期的認(rèn)知障礙，不但影響生活質(zhì)量，還增加了患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核因子(nuclear factor，NF)-κB通路是膿毒癥不受控制的炎性反應(yīng)的主要機(jī)制，該通路可被脂多糖等激活，并最終促進(jìn)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6的分泌，從而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元炎性損傷和凋亡[2]。高壓氧(hyperbaric oxygenation，HBO)是一種現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段，其可通過(guò)提高氧分壓使氧分子到達(dá)血紅蛋白無(wú)法穿透的組織，研究顯示HBO具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、調(diào)控免疫和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用[3]。近年來(lái)HBO在腦神經(jīng)保護(hù)中有著廣泛的應(yīng)用，研究顯示HBO能夠減少腦出血后繼發(fā)的神經(jīng)元損傷，保護(hù)腦神經(jīng)功能[4]。但是HBO對(duì)SAE的影響和機(jī)制仍不清楚。本文主要分析HBO干預(yù)通過(guò)調(diào)控TLR-4/NF-κB通路對(duì)SAE大鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料:Sprague-Dawley(SD)大鼠(SPF級(jí)，雄性，7～8周，180～200g，北京維通利華動(dòng)物公司，中國(guó))。水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(上海移數(shù)信息科技有限公司，中國(guó))。HE和TUNEL凋亡試劑盒(Roche公司，美國(guó))。四氧化鋨(Sigma公司，美國(guó))。乙酸鈾酰和檸檬酸鉛(上海生工公司，中國(guó))。樹(shù)脂(Epon812，TAAB公司，英國(guó))。超薄切片機(jī)(LKB公司，瑞典)。RNAspin Mini試劑盒(GE Healthcare，美國(guó))。Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR試劑盒(DBI Bioscience公司，德國(guó))。Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)(Santa公司，美國(guó))。一抗和山羊抗兔HRP-IgG二抗(博士德公司，美國(guó))。PVDF膜(Millipore公司，美國(guó))。ECL顯色試劑盒(Thermo Fisher公司，美國(guó))。光學(xué)顯微鏡(Olympus 公司，日本)。JEM-1230 透射電子顯微鏡(JEOL 公司，日本)。

1.2建模、分組和干預(yù):將45只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、SAE組和SAE+HBO組(n=15)。通過(guò)腹腔注射LPS構(gòu)建SAE模型(15mg/kg，3d)。在建模前2d和建模后3d，每日接受HBO干預(yù)，大鼠放置于高壓氧艙中，在20min緩慢、穩(wěn)定的加壓至2.2個(gè)絕對(duì)大氣壓力，然后再此壓力下呼吸95%的氧氣60min；吸氧結(jié)束后再20min內(nèi)緩慢、穩(wěn)定的降至常壓常氧，每日1次。

1.3觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.3.1水迷宮實(shí)驗(yàn):通過(guò)水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)分析大鼠神經(jīng)功能，通過(guò)檢測(cè)大鼠的逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)分析神經(jīng)功能，逃避潛伏期越長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)越低提示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.3.2ELISA:取大鼠尾靜脈血離心(3000rpm，20min，4℃)收集血清，通過(guò)ELISA檢測(cè)IL-1β和IL-6的水平。根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入抗體和顯色劑，根據(jù)450nm下的光密度和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度。

1.3.3HE染色:大鼠斷頭處死后取出海馬體組織并在室溫下用4%多聚甲醛固定6h。用乙醇脫水(從低濃度到高濃度)后，將組織包埋在石蠟中。然后將石蠟包埋的組織切成5μm的切片，并將切片固定在載玻片上。將載玻片在室溫下放入蘇木精中染色10min。用自來(lái)水洗滌1～2min后，將玻片置于10%冰醋酸中10s，然后置于1%氨水中，直到切片變藍(lán)。隨后用自來(lái)水清洗1～2min后，將玻片放入曙紅中10s。在乙醇(濃度分別為70%、90%、95%和100%)中脫水后，將玻片置于二甲苯中2min；重復(fù)此步驟一次。最后，用中性膠密封玻片。在倒置顯微鏡下觀察載玻片。

1.3.4TUENL染色:將海馬體組織樣本在流水下洗滌8h。樣本在洗滌后置于70%的乙醇中過(guò)夜。然后將組織塊分別浸入80%，90%，100%A和100%B乙醇中1h。然后使用丙酮，二甲苯A和二甲苯B分別浸泡30min，直到組織塊出現(xiàn)棕褐色或暗紅色并透明。將塊料分別放入水浴石蠟罐中1h(60℃)，并將塊放置在嵌入模具中并切成4μm的厚度。將切下的切片置于45℃的烘箱中過(guò)夜。經(jīng)過(guò)脫蠟和修復(fù)抗原后，用10mM Tris-鹽酸(pH7.4～7.8)將蛋白酶K稀釋成10～20μg/mL的溶液，然后將蛋白酶K稀釋液逐滴加入樣品中，用膜覆蓋，并在37℃下孵育20min。然后將樣品用PBS洗滌兩次，每次5min。將制備的TUNEL反應(yīng)混合物滴在載玻片上，用膜覆蓋，并在37℃下孵育60min。然后將其用PBS洗滌3次，每次5min。顯色后在×200倍數(shù)的顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算TUNEL染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞。

1.3.5電子顯微鏡觀察神經(jīng)元:將海馬體組織在室溫下浸入含有4%甲醛、2.5%戊二醛的、濃度為0.1M磷酸鈉緩沖液(pH=7.4)中浸泡2h。然后將組織使用2%的四氧化鋨固定。經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水后包埋在Epon 812樹(shù)脂混合物(TAAB，英國(guó)伯克斯)中。然后使用Leica EM UC6超薄切片機(jī)切割成超薄切片(約70nm)，分別使用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重染色，并用電子顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元。

1.3.6RT-qPCR:使用RNeasy Mini試劑盒取海馬組織中的總RNA，然后使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37℃/15min；98℃/5min。然后使用BestarTMqPCR預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，條件如下：95℃/2min，94℃20s，58℃20s，72℃/20s，40個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延伸4min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。通過(guò)比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.7Western blot:將海馬體組織在放射免疫沉淀測(cè)定裂解緩沖液中在冰上裂解。通過(guò)8%的SDS-PAGE分離每個(gè)樣品中等量(50μg)的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通過(guò)在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2h封閉非特異性抗原。隨后，將膜與一抗體在4℃下孵育過(guò)夜，然后將膜與相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1h。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，使用Quantum One軟件分析灰度計(jì)算蛋白相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1HBO對(duì)SAE大鼠神經(jīng)功能的影響:三組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較差異顯著(P<0.05)。SAE組的逃避潛伏期(44.06±5.12s)顯著高于對(duì)照組，穿越平臺(tái)次數(shù)(2.94±0.35次)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。SAE+HBO組的逃避潛伏期(35.86±3.06s)顯著低于SAE組，穿越平臺(tái)次數(shù)(4.98±0.66次)顯著高于SAE組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 HBO對(duì)SAE大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

2.2HBO對(duì)SAE大鼠炎性反應(yīng)的影響:三組大鼠血清炎性因子水平比較差異顯著(P<0.05)。SAE組的IL-1β(76.25±8.06pg/mL)和IL-6(91.37±10.74pg/mL)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。SAE+HBO組的IL-1β(48.68±5.21pg/mL)和IL-6(64.47±7.06pg/mL)水平顯著低于SAE組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 HBO對(duì)SAE大鼠血清IL-1β和IL-6水平的影響

2.3HBO對(duì)SAE大鼠海馬組織損傷的影響:對(duì)照組海馬體神經(jīng)元的形態(tài)正常，SAE組觀察到嚴(yán)重的神經(jīng)元變性，發(fā)現(xiàn)了許多增色細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)收縮甚至出現(xiàn)空泡。SAE+HBO組海馬神經(jīng)組織損傷情況較SAE組輕。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色檢測(cè)HBO對(duì)SAE大鼠海馬組織損傷的影響(×200)

2.4HBO對(duì)SAE大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響:如圖2所示，藍(lán)色進(jìn)而棕色分別為細(xì)胞核和TUNEL陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核。三組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況比較差異顯著(P<0.05)，SAE組的凋亡細(xì)胞(6.17±0.78個(gè)/視野)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，SAE+HBO組的的凋亡細(xì)胞(3.42±0.52個(gè)/視野)顯著低于SAE組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

圖2 TUNEL染色檢測(cè)HBO對(duì)SAE大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響(×200)(黑色箭頭提示凋亡細(xì)胞)

表3 HBO對(duì)SAE大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

2.5HBO對(duì)SAE大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況的影響:電鏡分析表明，對(duì)照組的腦毛細(xì)血管完整結(jié)構(gòu)，鄰近的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常。SAE組出現(xiàn)神經(jīng)元腫脹和細(xì)胞膜破裂，同時(shí)還能觀察到神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)密度增加，細(xì)胞器異常。SAE+HBO組的神經(jīng)元損傷情況較SAE組輕。見(jiàn)圖3。

圖3 電子顯微鏡觀察HBO對(duì)SAE大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況的影響(bar=2μm)

2.6HBO對(duì)SAE大鼠海馬體組織中TLR4和NF-κB轉(zhuǎn)錄水平的影響:三組SAE大鼠海馬體組織中TLR4和NF-κB轉(zhuǎn)錄水平比較差異顯著(P<0.05)。SAE組的TLR4(5.82±0.54)和NF-κB(5.61±0.53)mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，SAE+HBO組的TLR4(2.75±0.25)和NF-κB(3.02±0.29)mRNA水平顯著低于SAE組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 HBO對(duì)SAE大鼠海馬體組織中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA水平的影響

2.7HBO對(duì)SAE大鼠海馬體組織中TLR4/NF-κB通路中蛋白表達(dá)水平的影響:三組SAE大鼠海馬體組織中TLR4/NF-κB通路中蛋白表達(dá)水平比較差異顯著(P<0.05)。SAE組的TLR4(3.79±0.34)和NF-κB(3.21±0.29)蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，SAE+HBO組的TLR4(1.05±0.09)和NF-κB(1.47±0.13)蛋白水平顯著低于SAE組(P<0.05)，見(jiàn)圖4和表5。

圖4 Western blot檢測(cè)HBO對(duì)SAE大鼠海馬體組織中TLR4/NF-κB通路中蛋白表達(dá)水平的影響

表5 HBO對(duì)SAE大鼠海馬體組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

SAE是由感染的全身反應(yīng)引起的常見(jiàn)腦功能障礙，SAE患者表現(xiàn)出不同程度的認(rèn)知功能障礙，這些認(rèn)知障礙可能歸因于敗血癥本身，或歸因于敗血癥增加了大腦對(duì)神經(jīng)退行性疾病的敏感性[5]。SAE可在出院后持續(xù)數(shù)月至數(shù)年，但是目前尚無(wú)有效的干預(yù)SAE的方法，SAE患者通常需要長(zhǎng)期的康復(fù)干預(yù)治療才能恢復(fù)功能，尋找有效的治療SAE的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

HBO是在加壓艙中進(jìn)行的非侵入性療法，患者在高于正常大氣壓的情況下吸入純氧，這改善了從肺部到全身器官的氧合作用，特別是在缺血性狀況下。HBO療法目前用于治療急性和慢性缺血性損傷，包括與潛水有關(guān)的傷害、中風(fēng)、脊髓損傷等[6]。研究顯示HBO可以促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，如Tan等[7]研究結(jié)果顯示脊髓損傷患者接受早期HBO治療可明顯提高體感誘發(fā)電位和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的峰值，縮短潛伏期，加快神經(jīng)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)患者運(yùn)動(dòng)和自理能力的恢復(fù)。近年來(lái)，HBO在感染和炎性相關(guān)疾病的治療中也取得了重大進(jìn)展，研究結(jié)果顯示HBO可以緩解脂多糖誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子和抑制凋亡[8]。本次研究通過(guò)HBO干預(yù)SAE模型小鼠，結(jié)果顯示HBO不但可以抑制炎性細(xì)胞因子的釋放保護(hù)神經(jīng)功能，還明顯減少了海馬體神經(jīng)元的損傷和凋亡。研究結(jié)果顯示海馬體神經(jīng)元的凋亡是導(dǎo)致SAE患者記憶功能、神經(jīng)損傷和運(yùn)動(dòng)功能受損的重要機(jī)制[9]。Ying等[10]研究結(jié)果也表明HBO干預(yù)可通過(guò)調(diào)控脊髓損傷大鼠中的BDNF/TrkB信號(hào)通路減少神經(jīng)元凋亡和損傷。這提示HBO可顯著的抑制SAE大鼠海馬體神經(jīng)元的損傷和凋亡，從而保護(hù)神經(jīng)功能，但是其分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

研究認(rèn)為T(mén)LR4在膿毒癥相關(guān)的炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，TLR4可被脂多糖等激活，而TLR4蛋白可激活下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進(jìn)而調(diào)控免疫炎性基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡[11]。該通路也是SAE海馬體神經(jīng)元損傷和凋亡的重要機(jī)制。而抑制TLR4/NF-κB可保護(hù)海馬神經(jīng)元[12]。本次研究結(jié)果顯示SAE大鼠海馬體組織中TLR4和NF-κB轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平均明顯升高，而HBO干預(yù)可顯著抑制TLR4/NF-κB通路。Liu等[13]認(rèn)為HBO可通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路減輕脂多糖引起的炎癥反應(yīng)。HBO干預(yù)能夠通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路緩解大鼠實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷[14]。也有研究顯示HBO可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB介導(dǎo)炎癥而改善聽(tīng)力喪失患者的聽(tīng)力水平。這提示HBO保護(hù)SAE的功能可能與TLR4/NF-κB通路有關(guān)，HBO可能通過(guò)神經(jīng)抑制TLR4和NF-κB的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而抑制海馬神經(jīng)元損傷。

綜上所述，HBO可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路緩解SAE引起的海馬神經(jīng)元損傷和凋亡，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)功能。但是關(guān)于HBO對(duì)SAE的治療效果仍需要臨床研究證實(shí)，并且其機(jī)制仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。