譚芷芬,張宏方,于鵬龍,王志航,徐洋洋,王媛媛,張怡敏
(陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046)
中藥方劑多靶點調(diào)節(jié)免疫抗腫瘤的機(jī)制日益成為研究的熱點,復(fù)方中藥(方劑)在惡性腫瘤治療方面顯示出諸多優(yōu)勢并已得到醫(yī)學(xué)界的公認(rèn)。近年來研究表明腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平明顯升高,該細(xì)胞與相關(guān)免疫抑制因子共同構(gòu)建的免疫抑制微環(huán)境與腫瘤的進(jìn)展存在密切關(guān)系[1]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞既可調(diào)節(jié)抑制周圍免疫細(xì)胞,又可產(chǎn)生白細(xì)胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等免疫細(xì)胞抑制因子,造成瘤組織中免疫細(xì)胞不作為,尤其是TGF-β調(diào)節(jié)抑制作用最為明顯,其可誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Treg細(xì)胞,且可降低其周圍環(huán)境中所有免疫細(xì)胞的增殖與分化。而IL-10抑制免疫系統(tǒng)的作用可通過多重機(jī)制產(chǎn)生[2]。有研究表明轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是CD4+CD25+Treg細(xì)胞最可靠的特征性標(biāo)記,它介導(dǎo)了胸腺和外周CD4+CD25+Treg細(xì)胞的發(fā)育,無論是胸腺還是外周起源的CD4+CD25+Treg細(xì)胞都能特異性地表達(dá)Foxp3,因此Foxp3可以作為衡量人體中CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量多少的一個重要指標(biāo)[3]。經(jīng)典名方理沖湯源于清代張壽甫《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》,調(diào)衡方為加減取舍了理沖湯的個別藥味而化裁出有抑瘤與調(diào)節(jié)荷瘤體免疫功能的方藥[4-10]。該方的粗多糖不僅可提升樹突狀細(xì)胞提呈抗原的能力,還可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞與紅細(xì)胞免疫功能[4-6]。但調(diào)衡方對荷瘤體免疫抑制性細(xì)胞的作用影響仍不清楚,故本實驗以小鼠血清、瘤組織與肺組織中Foxp3、IL-10、TGF-β的表達(dá)為靶點,從調(diào)控荷瘤體免疫抑制性細(xì)胞活性等途徑切入,探討調(diào)衡方對荷瘤體免疫抑制性細(xì)胞調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。
1.1實驗動物 雄性C57BL/6小鼠,潔凈級二級,體重(20±2)g,鼠齡6~8周,購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心,合格證號:SCXK(陜)2018-009,在陜西中醫(yī)藥大學(xué)生物技術(shù)與免疫實驗中心飼養(yǎng)(二級潔凈實驗室)。所有實驗操作均符合動物倫理學(xué)要求。
1.2細(xì)胞株、試劑和主要儀器 Lewis肺癌細(xì)胞株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640(Gibco),胎牛血清(FBS,購自美國omiga),胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)含酚紅購于武漢普諾賽生命科技有限公司,磷酸鹽緩沖液(PBS)干粉購于北京索萊寶科技有限公司,兔抗小鼠Foxp3、兔抗小鼠TGF-β、兔抗小鼠IL-10均購于武漢博士德生物工程有限公司。即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒、DAB顯色試劑盒(黃)購于武漢博士德生物工程有限公司,TGF-β、IL-10 ELISA試劑盒購于江蘇晶美生物科技有限公司。CCB-150型CO2培養(yǎng)箱(BinDer公司),S200倒置顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司),酶標(biāo)儀(美國BioTeK Epoch公司),L530離心機(jī)(賽特湘儀公司),賽多利斯電子天平(made by Sartorius),SW-CJ-2FD單人雙面超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司),HH-S2s數(shù)顯恒溫水浴箱(金壇市大地自動化儀器廠),DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海-恒科技有限公司),pH值測定儀(上海精宏實驗設(shè)備有限公司),培養(yǎng)細(xì)胞用培養(yǎng)瓶與培養(yǎng)板(Coming公司),細(xì)胞計數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司),ImagePro plus 6.0型半定量圖形分析版軟件(MediaCybernetic公司)。
1.3實驗用藥 經(jīng)理沖湯加減化裁的調(diào)衡方組方:花旗參15 g、生黃芪30 g、莪術(shù)10 g、水蛭3 g、白花蛇舌草30 g、生山藥30 g、天花粉12 g、川天冬10 g、生雞內(nèi)金10 g。各味中藥經(jīng)陜西中醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科主任中藥師王凡鑒定,均符合2015版《中國藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。按中藥煎藥規(guī)定要求,將調(diào)衡方組方加工制成流浸膏(3 g生藥/mL),分裝滅菌置2~10 ℃冰箱備用。貞芪扶正膠囊,甘肅新蘭藥藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字J201810501。給藥劑量用人與小鼠體表面積折算公式換算。
1.4分組、模型制備及干預(yù)方法 采用體重隨機(jī)分組法將C57BL/6小鼠分為正常組、荷瘤組、貞芪組、調(diào)衡方低劑量組、調(diào)衡方中劑量組、調(diào)衡方高劑量組,每組10只。取生長旺盛的Lewis肺癌細(xì)胞,將細(xì)胞濃度為6.5×106個/mL的瘤細(xì)胞0.2 mL接種于每只小鼠的右側(cè)腋窩皮下。接種24 h后,貞芪組給予貞芪扶正膠囊41.5 g/kg(生藥量為0.83 g)灌胃,調(diào)衡方低、中、高劑量組分別給予調(diào)衡方流浸膏12.5 g/kg、25 g/kg、50 g/kg灌胃,荷瘤組給予等容量生理鹽水灌胃,均1次/d,連續(xù)8 d。
1.5樣本的收集與處理 實驗結(jié)束后脫頸處死各組小鼠,經(jīng)心臟取血,隨后將血液樣本靜置2h,3 000 r/min室溫離心15 min,取上清液待檢;取小鼠瘤組織與肺組織,使用4%多聚甲醛固定24 h,用于后續(xù)HE染色與免疫組織化學(xué)染色檢查。
1.6觀察指標(biāo)及方法
1.6.1瘤組織與肺組織HE染色觀察 取制備好的瘤組織與肺組織石蠟切片,置于烘箱中60 ℃烤1~2 h,常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水,蘇木精5 min染色,染色時間依據(jù)具體情況而定,流水沖洗并去余色。0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,返藍(lán),隨后伊紅染色、脫水:常規(guī)二甲苯透明,中性樹脂封片,避免氣泡。光鏡下觀察。
1.6.2血清IL-10、TGF-β水平檢測 取待檢血清,按ELISA試劑盒說明書操作,使用酶標(biāo)儀(BioTeK Epoch),在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。
1.6.3瘤組織與肺組織中Foxp3、IL-10、TGF-β表達(dá)免疫組化檢測 將制備好的組織樣本置于二甲苯中,脫臘至水,加EDTA 抗原修復(fù)緩沖液(pH 9.0),在修復(fù)盒中進(jìn)行抗原修復(fù), 置于3%過氧化氫溶液中避光孵育25 min,PBS緩沖液洗滌。滴加SABC試劑,37 ℃恒溫箱中靜置20 min,甩去多余的液體。分別加配置好的一抗Foxp3(1∶200稀釋)、IL-10(使用濃度為10 μg/mL)、TGF-β(1∶200稀釋),37 ℃,1 h;PBS液(pH 7.2~7.6)每次2 min。洗滌 3次,滴加對應(yīng)的二抗,室溫下50 min,PBS液(pH 7.2~7.6)每次2 min。洗滌 3次,滴加DAB顯色液,蘇木素輕度復(fù)染,梯度酒精脫水,二甲苯透明、封片,室溫下干燥,顯微鏡下觀察Foxp3、TGF-β、IL-10表達(dá)情況并拍照,出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性表達(dá),用半定量圖形分析軟件ImagePro plus 6.0計算其面積陽性表達(dá)率。
2.1各組小鼠瘤組織中瘤細(xì)胞形態(tài) HE染色顯示:荷瘤組瘤細(xì)胞壞死面積很少,有少量的凋亡瘤細(xì)胞;調(diào)衡方各組多處瘤細(xì)胞核固縮、瘤細(xì)胞凋亡與壞死,且見瘤細(xì)胞膜嚴(yán)重變形,其胞膜皺縮不完整,膜上有許多突起,在瘤組織小血管周圍與瘤組織邊緣處癌細(xì)胞殘留壞死物隨處可見,尤其是調(diào)衡方高、中劑量組明顯;貞芪組凋亡瘤細(xì)胞與壞死瘤細(xì)胞面積較調(diào)衡方各組少,但多于荷瘤組。見圖1。
圖1 荷瘤各組小鼠瘤組織HE染色表現(xiàn)(×400)
2.2各組小鼠肺組織細(xì)胞形態(tài) HE染色顯示:正常組小鼠肺泡邊界輪廓清楚,未見腫瘤灶;荷瘤組小鼠肺組織可見細(xì)胞排列混亂的腫瘤轉(zhuǎn)移灶,細(xì)胞形狀不規(guī)則,分布集中,細(xì)胞核大、染色深,病理性的核分裂較多,染色較深,腫瘤實、間質(zhì)間邊緣不清;調(diào)衡方低劑量組肺組織可見腫瘤細(xì)胞,有腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成跡象,調(diào)衡方中、高劑量組未見明顯的腫瘤細(xì)胞聚集,且隨給藥劑量的增大肺泡邊界越發(fā)清晰,細(xì)胞排列與正常肺組織形態(tài)越接近;貞芪組肺泡邊界輪廓較清楚,偶見腫瘤轉(zhuǎn)移灶,較荷瘤組少,較調(diào)衡方中、高劑量組稍多。見圖2。
圖2 正常組和荷瘤各組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×400)
2.3各組小鼠血清IL-10、TGF-β水平比較 荷瘤組血清IL-10、TGF-β水平均明顯高于正常組(P均<0.05);貞芪組和調(diào)衡方各組血清IL-10、TGF-β水平均明顯低于荷瘤組(P均<0.05),調(diào)衡方高劑量組均明顯低于調(diào)衡方低、中劑量組(P均<0.05);調(diào)衡方各組血清IL-10水平與貞芪組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05),調(diào)衡方高劑量組血清TGF-β水平明顯低于貞芪組(P<0.05)。見表1。
表1 正常組和荷瘤各組小鼠血清IL-10、TGF-β水平比較
2.4各組小鼠瘤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β表達(dá)情況 免疫組化染色顯示,F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)多呈彌散性分布,少數(shù)局灶性,IL-10和TGF-β蛋白陽性定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿或胞膜及間質(zhì)中;貞芪組和調(diào)衡方各組Foxp3、IL-10、TGF-β蛋白表達(dá)陽性率均明顯低于荷瘤組(P均<0.05),調(diào)衡方高劑量組均明顯低于調(diào)衡方低劑量組和貞芪組(P均<0.05)。見圖3~6。
圖3 荷瘤各組小鼠瘤組織中Foxp3表達(dá)情況(免疫組化染色,×400)
圖4 荷瘤各組小鼠瘤組織中IL-10表達(dá)情況(免疫組化染色,×400)
圖5 荷瘤各組小鼠瘤組織中 TGF-β表達(dá)情況(免疫組化染色,×400)
圖6 荷瘤各組小鼠瘤組織中Foxp3、IL-10、TGF-β陽性表達(dá)率比較
2.5各組小鼠肺組織中Foxp3、IL-10、TGF-β表達(dá)情況 正常組顯示Foxp3蛋白表達(dá)極少,細(xì)胞胞漿或胞膜及間質(zhì)中未見明顯IL-10和TGF-β蛋白陽性表達(dá)。荷瘤組肺組織中Foxp3、IL-10、TGF-β陽性表達(dá)率明顯高于正常組(P均<0.05);貞芪組和調(diào)衡方各組Foxp3、IL-10、TGF-β陽性表達(dá)率均明顯低于荷瘤組(P均<0.05),且調(diào)衡方高劑量組Foxp3、IL-10、TGF-β均明顯低于調(diào)衡方低劑量組(P均<0.05)。見圖7~10。
圖7 正常組和荷瘤各組小鼠肺組織中Foxp3表達(dá)情況(免疫組化染色,×100)
圖8 正常組和荷瘤各組小鼠肺組織中IL-10表達(dá)情況(免疫組化染色,×100)
圖9 正常組和荷瘤各組小鼠肺組織中TGF-β表達(dá)情況(免疫組化染色,×100)
圖10 正常組和荷瘤各組小鼠肺組織中Foxp3、IL-10、TGF-β陽性表達(dá)率比較
腫瘤歸屬中醫(yī)“癥瘕”“積聚”“瘤”“巖”“惡瘡”“癌毒”等范疇,正氣虧虛為癌毒起病、發(fā)展的必要條件,癌毒內(nèi)結(jié)為腫瘤發(fā)生的重要病機(jī)和物質(zhì)基礎(chǔ)。復(fù)方中藥調(diào)衡方具有益氣生血養(yǎng)陰、清熱解毒、活血祛瘀之功效,“益氣解毒化瘀”能增加機(jī)體的“正氣”;“益氣”可直接扶助正氣;“解毒”能減少邪氣對正氣的耗傷;“化瘀活血”能夠祛除局部瘀血阻滯,消除積聚或癥瘕,恢復(fù)病灶的血液循環(huán),使瘀血去,新血生,化生正氣[11]。本實驗以Lewis肺癌細(xì)胞建立轉(zhuǎn)移性癌瘤模型,進(jìn)一步探討了調(diào)衡方對荷瘤體免疫抑制性細(xì)胞調(diào)節(jié)作用及其分泌抑制性細(xì)胞因子的影響。
肺癌等惡性腫瘤體周圍免疫細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境中各種免疫細(xì)胞功能低下,尤其是Treg等抑制性細(xì)胞增多與其釋放的抑制性細(xì)胞因子 IL-10、TGF-β等分泌增加,是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的主要原因之一。Treg等抑制性免疫細(xì)胞可促進(jìn) IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子的分泌,進(jìn)一步抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞對腫瘤的免疫應(yīng)答,從而加速腫瘤的病理進(jìn)展[12-14];Treg細(xì)胞也可通過與腫瘤干細(xì)胞(CSCs)相互作用增強(qiáng)腫瘤免疫耐受,促進(jìn)腫瘤發(fā)展[15]。細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是CD4+CD25+Treg的自然標(biāo)志物,并控制其生成與功能的發(fā)揮[16],CD4+CD25+Treg可以促進(jìn)CTLA4和PD-L1、IL-10、TGF-β等抑制性因子高表達(dá)而發(fā)揮免疫抑制作用。多個研究證實IL-10與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[17-18]。另外從癌變前的腫瘤發(fā)展成轉(zhuǎn)移性疾病通常伴隨著TGF-β的激活或表達(dá)增加[19],發(fā)揮全身免疫抑制作用,癌癥晚期階段TGF-β可誘發(fā)許多活動促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增長、入侵和轉(zhuǎn)移[20]。隨著腫瘤的進(jìn)展,機(jī)體所產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg增多,進(jìn)而釋放大量的炎性介質(zhì),隨之而來的是瘤細(xì)胞組織對周圍正常細(xì)胞器官的擠壓及瘤細(xì)胞新生血管的大量增生,惡病質(zhì)增多,腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞不作為而致的免疫功能低下及紊亂。本實驗發(fā)現(xiàn),調(diào)衡方能夠下調(diào)荷瘤小鼠瘤組織與肺組織中Foxp3的表達(dá),從而有效抑制CD4+CD25+Treg對機(jī)體的免疫抑制作用,改善腫瘤微環(huán)境中免疫抑制情況,從而達(dá)到抗腫瘤的目的。調(diào)衡方各組血清IL-10、TGF-β水平及瘤組織、肺組織中二者陽性表達(dá)率均明顯低于荷瘤組,表明調(diào)衡方能抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肺臟轉(zhuǎn)移,其抗瘤抑瘤作用與下調(diào)抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β的表達(dá)有關(guān)。
綜上所述,調(diào)衡方對Lewis肺癌荷瘤體的作用可能與其下調(diào)Foxp3、IL-10、TGF-β表達(dá),改善腫瘤微環(huán)境中免疫抑制狀況有關(guān),這為腫瘤免疫治療開辟了新的途徑。
利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。