熒光法測(cè)定溶液和食品添加劑中的馬來(lái)酸

于珊珊, 田 俊

(四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院綠色化學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610064)

1 引 言

二酸分子由于其獨(dú)特的生物學(xué)活性以及作為重要生物中間體的合成而備受關(guān)注[1,2]. 在常見(jiàn)的二酸中, 馬來(lái)酸(學(xué)名：順丁烯二酸)及其幾何異構(gòu)體富馬酸(反丁烯二酸)是兩種重要的二酸結(jié)構(gòu), 具有巨大的的生物學(xué)影響[3]. 它們廣泛存在于醫(yī)藥、食品以及聚合物的合成中, 同時(shí)也是一種重要的化工原料. 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn), 馬來(lái)酸在三羧酸循環(huán)中起著重要的作用, 但過(guò)量食用馬來(lái)酸對(duì)腎臟有損害, 并可能導(dǎo)致多種腎臟疾病[4-6]. 因此根據(jù)中國(guó)現(xiàn)行食品安全標(biāo)準(zhǔn)[7], 禁止馬來(lái)酸酐和馬來(lái)酸作為食品添加劑加入食物中. 由于馬來(lái)酸作為添加劑可以使得淀粉等面制品的光澤度提高且黏性和彈性增加, 從而它被不法商家所利用. 在我國(guó), 2010年長(zhǎng)春, 2011年廣西, 以及2013年臺(tái)灣均發(fā)生過(guò)大規(guī)模非法添加馬來(lái)酸在淀粉中的事件, 給人們的健康造成了不利影響和傷害.

目前, 馬來(lái)酸的檢測(cè)主要依賴(lài)于離子色譜法[8]、高效液相法[9]以及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]等. 這些方法均依賴(lài)于昂貴的儀器設(shè)備, 且樣品制備繁瑣、操作過(guò)程復(fù)雜, 在一定程度上增加了檢測(cè)的難度, 限制了大批量快速檢測(cè). 而熒光法具有靈敏度高、測(cè)定快速、檢測(cè)方式多樣化、可以實(shí)現(xiàn)在線實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn), 因此此方法得到了科學(xué)家的青睞. 近年來(lái), 熒光法在化學(xué)、生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迅猛發(fā)展, 取得了優(yōu)異的效果[11-13].

我們之前報(bào)道的一類(lèi)基于聯(lián)萘醛結(jié)構(gòu)的探針1[14]對(duì)手性谷氨酸和天冬氨酸有良好的化學(xué)選擇性和對(duì)映選擇性, 且對(duì)部分二酸化合物有一定的熒光增強(qiáng). 本文對(duì)探針1與馬來(lái)酸反應(yīng)后的熒光進(jìn)一步研究, 并將其應(yīng)用于淀粉中馬來(lái)酸的檢測(cè).

圖1 探針1Fig.1 Probe 1

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

本文所用藥品均來(lái)自安耐吉化學(xué)試劑供應(yīng)商, 且使用前未做特殊處理. 所有用于測(cè)定熒光光譜的溶劑均為色譜純, 來(lái)自Fisher公司. 熒光光譜儀：日立F7000(HITACHI). 核磁：Bruker AV-400核磁共振儀 (1H: 400 MHz, 0.5% TMS為內(nèi)標(biāo)). 化合物1參照文獻(xiàn)[14]的方法合成.

2.2 核磁滴定實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取化合物1(1 mg)于核磁管中, 另分別稱(chēng)取馬來(lái)酸(1.9 mg)和富馬酸(1.9 mg)分別加入不同的核磁管中, 加入氘代溶劑定容至500 μL, 混合均勻后, 室溫放置2 h后進(jìn)行核磁氫譜的掃描.

2.3 熒光測(cè)試

2×10-3mol/L 的化合物1的CH2Cl2溶液和二酸的甲醇溶液均為每次實(shí)驗(yàn)現(xiàn)配. 在10 mL試管加入2.5 mL的甲醇溶液, 用微量注射器加入25 μL的化合物1 (2×10-3mol/L), 再加入所需當(dāng)量的二酸客體溶液(0.10 mol/L, MeOH). 將反應(yīng)液置于室溫下反應(yīng)一定時(shí)長(zhǎng)后進(jìn)行熒光測(cè)定. 所有樣品的熒光光譜測(cè)定總時(shí)間不超過(guò)2 h.

3 結(jié)果與討論

3.1 核磁滴定

我們考察了在不同氘代溶劑中, 化合物1與馬來(lái)酸和富馬酸的核磁情況. 如圖2所示, 在氘代二甲基亞砜、丙酮和乙腈中, 化合物1的醛基信號(hào)峰δ=9.53與順丁烯二酸作用后沒(méi)有任何變化, 表明其與二酸均不發(fā)生反應(yīng). 在氘代甲醇中, 加入馬來(lái)酸后,δ=9.53處的信號(hào)峰消失, 在δ=4.75處產(chǎn)生新的信號(hào)峰, 這表明羧基與醛基形成對(duì)稱(chēng)的半縮醛結(jié)構(gòu). 在加入富馬酸的溶液中, 醛基信號(hào)峰δ=9.53沒(méi)有完全消失, 在δ=4.75處的新的信號(hào)也比較弱, 表明沒(méi)能形成穩(wěn)定的半縮醛結(jié)構(gòu). 這與我們之前的報(bào)道[14]一致, 醇類(lèi)溶劑有利于這一反應(yīng)的進(jìn)行, 核磁滴定實(shí)驗(yàn)也表明了這一點(diǎn).

圖2 化合物1與馬來(lái)酸和富馬酸在不同氘代溶劑中的反應(yīng): (a) DMSO-d6; (b) Acetone-d6; (c) MeCN-d3; (d) MeOH-d4Fig.2 The reaction of compound 1 with maleic acid and fumaric acid in different deuterated solvents: (a) DMSO-d4; (b) Acetone-d6; (c) MeCN-d3; (d) MeOH-d4

3.2 熒光實(shí)驗(yàn)

3.2.1 反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)當(dāng)量比考察 在2.5 mL甲醇中加入化合物1 (2.0 mmol/L)與馬來(lái)酸和富馬酸(10 equiv), 分別反應(yīng)不同時(shí)間后進(jìn)行熒光測(cè)量.如圖3a, 3b所示, 隨著時(shí)間增加, 熒光強(qiáng)度逐漸增加, 在240 min后達(dá)到穩(wěn)定, 表明反應(yīng)達(dá)到平衡, 后續(xù)測(cè)量均在反應(yīng)240 min后進(jìn)行.

不同當(dāng)量的馬來(lái)酸與化合物1反應(yīng)的熒光效果如圖3c, 3d所示.隨著馬來(lái)酸量的增加, 熒光強(qiáng)度穩(wěn)定增加.在馬來(lái)酸當(dāng)量大于等于10 equiv后, 熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定，表明這一反應(yīng)的穩(wěn)定性, 不會(huì)隨著后續(xù)馬來(lái)酸的過(guò)量加入而破壞反應(yīng)平衡.因此其具有較好的應(yīng)用前景.

圖3 (a) 化合物1(2.0 × 10-5 mol/L)與馬來(lái)酸(10 equiv) 在10, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300和360 min時(shí)的熒光圖譜; (b) 化合物1(2.0 × 10-5 mol/L)與馬來(lái)酸(10 equiv)在350 nm處的熒光強(qiáng)度;(c)化合物1(2.0×10-5 mol/L)與馬來(lái)酸(0～30 equiv)反應(yīng)的熒光光譜; (d) 化合物1(2.0 × 10-5 mol/L)與不同當(dāng)量的馬來(lái)酸在350 nm處的熒光強(qiáng)度誤差線通過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)測(cè)定. 溶劑： MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nmFig.3 (a) Fluorescence spectra of compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) with 10 equiv of maleic acid at 10, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300 and 360 min; (b) fluorescence intensity of compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) with 10 equiv of maleic acid at 350 nm; (c) fluorescence spectra of compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) with 0～30 equiv of maleic acid; (d) fluorescence intensity of compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) versus the equivalence of maleic acid at 350 nmThe error bars were obtained with three independent measurements. Solvent: MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nm

3.2.2 檢測(cè)限計(jì)算 化合物1與低當(dāng)量馬來(lái)酸作用時(shí)熒光強(qiáng)度的急劇線性增長(zhǎng)表明可以在低濃度下進(jìn)行檢測(cè). 接下來(lái), 我們就化合物1對(duì)馬來(lái)酸響應(yīng)的檢測(cè)限做了考察.檢測(cè)限的計(jì)算根據(jù)公式：LOD=3δ/S，其中δ為測(cè)量10次空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差值,S為得到的濃度與熒光強(qiáng)度滴定曲線擬合的線性關(guān)系的斜率. 為了計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確, 選取熒光強(qiáng)度變化明顯, 馬來(lái)酸在0～10 mmol/L時(shí)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行考察. 如圖4所示, 隨著馬來(lái)酸的加入, 熒光強(qiáng)度呈線性增長(zhǎng), 且線性關(guān)系良好.通過(guò)擬合的線性直線的斜率以及空白探針樣品測(cè)量10次得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差值即可計(jì)算得到檢測(cè)限. 通過(guò)計(jì)算可得探針1對(duì)馬來(lái)酸的最低檢測(cè)濃度可達(dá)1.3×10-7mol/L. 這一檢測(cè)濃度達(dá)到百納摩爾級(jí)別, 由此可見(jiàn)該探針具有較高的靈敏度, 具有較大的實(shí)際應(yīng)用潛能.

圖4 化合物1(2.0×10-5 mol/L)對(duì)0～10 mmol/L的馬來(lái)酸的 (a) 熒光滴定; (b) 350 nm處熒光強(qiáng)度的線性擬合圖溶劑： MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nmFig.4 The fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity at 350 nm (b) of compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) with 0～10 mmol/L of maleic acidSolvent: MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nm

3.2.3 干擾實(shí)驗(yàn) 抗干擾能力也是衡量一個(gè)熒光探針重要的指標(biāo).我們之前報(bào)道了化合物1對(duì)23種二酸的熒光響應(yīng), 化合物1對(duì)馬來(lái)酸有著優(yōu)異的選擇性[14]. 在此基礎(chǔ)上, 本文分別考察了其余22種二酸對(duì)化合物1與馬來(lái)酸熒光響應(yīng)的干擾. 在化合物1中分別加入馬來(lái)酸(6 equiv)和其余二酸(4 equiv)，反應(yīng)后的熒光結(jié)果如圖5所示.相比于化合物1與馬來(lái)酸, 加入其余二酸后幾乎沒(méi)有大的熒光變化, 表明了化合物1對(duì)馬來(lái)酸識(shí)別的穩(wěn)定性, 也進(jìn)一步表明了其實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值.

圖5 (a) 測(cè)試的23種二酸的結(jié)構(gòu)式; (b) 化合物1(2.0 × 10-5 mol/L)與馬來(lái)酸(6 equiv)在其他二酸存在時(shí)的熒光光譜; (c) 350 nm處熒光強(qiáng)度的柱狀圖溶劑： MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nmFig.5 (a) The structural formula of 23 diacids tested; (b) compound 1 (2.0 × 10-5 mol/L) and the fluorescence spectrum of maleic acid (6 equiv) in the presence of other diacids; (c) the bar graphs of the fluorescence intensity at 350 nmSolvent: MeOH∶DCM=99∶1, v/v. λexc = 285 nm, slits = 5/5 nm

3.3 淀粉樣品中馬來(lái)酸的檢測(cè)

我們將這一檢測(cè)體系拓展到淀粉樣品中的馬來(lái)酸檢測(cè). 分別取3份40 g玉米淀粉放入100 mL燒瓶, 一份作為空白對(duì)照, 其余兩份分別加入0.40 g馬來(lái)酸和富馬酸. 然后向3份樣品中加入80 mL甲醇, 攪拌24 h后過(guò)濾掉不溶的固體, 取1 mL濾液與1 mL 化合物1(0.86 × 10-3mol/L)二氯甲烷溶液混合反應(yīng)2 h后, 用甲醇稀釋到2× 10-5mol/L后進(jìn)行熒光測(cè)定. 如圖6所示, 化合物1與二酸反應(yīng)后, 與馬來(lái)酸作用表現(xiàn)出明顯的強(qiáng)熒光信號(hào), 富馬酸和空白對(duì)照幾乎沒(méi)有熒光增強(qiáng). 因此可以很好地通過(guò)熒光法來(lái)對(duì)富含淀粉食物中的馬來(lái)酸添加劑進(jìn)行檢測(cè).

圖6 熒光光譜法測(cè)定淀粉食物中的馬來(lái)酸Fig.6 Determination of maleic acid in starch food by fluorescence spectroscopy

4 總 結(jié)

我們對(duì)已有的化合物1與馬來(lái)酸反應(yīng)的熒光條件細(xì)化篩選, 考察了反應(yīng)時(shí)間和當(dāng)量比. 低的檢測(cè)限表明探針具有高的應(yīng)用潛能, 優(yōu)異的抗干擾能力和對(duì)淀粉樣品中的馬來(lái)酸添加劑有效的檢測(cè)進(jìn)一步表明其實(shí)用價(jià)值. 總之, 我們開(kāi)發(fā)了一種利用熒光法高效檢測(cè)食品添加劑中馬來(lái)酸的方法.